Name: La culture et lélectrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez l'électrophysiologie des neurones en culture sur puces patch-clamp planaires. Cette méthode permet d'enregistrer l'activité ionique et d'étudier la communication synaptique dans les réseaux neuronaux.

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Les auteurs tiennent à remercier Alexei Bogdanov pour la fabrication de patch-clamp de jetons au CCFDP et Hue Tran, Ping Zhao et Matthew Shiu pour assistance lors du montage. Naweed Syed a été pris en charge par un institut canadien de recherche en santé (IRSC) de subvention. Collin Luk est le récipiendaire du CRSNG et de l&#39;Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) bourses d&#39;études.

1. La fabrication de puces Le processus décrit dans 6 résultats dans un 3 um d'épaisseur autonome film, une faible résistance 1 Mohm et un accès à surface lisse d'entonnoir en forme qui facilite l'ouverture d'un sceau intime avec la cellule 9, voir la figure 2. Les puces sont individualisés et collées dans des emballages en plexiglas avec l'ouverture face à un trou de connexion de la puce à un canal souterrain. Le collage est distribué d'une manière qui minimise la capacité de dérivation pour une valeur nominale 17 pF. Les colis sont équipés de deux piles de 1,5 mm de diamètre et 6 mm tubes de verre longues que les ports fluidiques (Figure 3). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Microscope électronique à balayage d'un faisceau d'ions focalisé section d'un SCGDV patch-clamp puce montre une surface de silicium lisse dioxyde de carbone et en forme d'entonnoir qui favorise les contacts cellulaires intimes, et un orifice de faible profondeur qui représente une faible accès resistance. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 3. Une puce est collée au fond du flacon de culture dans un paquet de plexiglas équipé fluidique souterraines et des tubes de verre. 2. Stérilisation, l'amorçage et les tests Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination ou de brancher de l'ouverture. <ul type="disc"><li> Stériliser jetons dans un nettoyeur de base Harrick plasma (www.harrickplasma.com) avec une pression de 0.1 à 0.3 mbar air résiduel pendant 15 min à la puissance maximale de 18 W. Les autres systèmes de plasma d'air peut être utilisé, avec une densité de puissance comparable (24 mW / cm 3) et à maintenir le produit de la densité de puissance et la constante de temps. Le traitement par plasma rend aussi les puces hydrophile, qui facilite l'amorçage. </li><li> Monter des tubes de verre avec tube stérile Laboratoire de silicone Silastic, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115 à 08), sur un côté 3inch, 1 pouce de l'autre côté. </li><li> Remplissez fluidique à travers les tubes avec une solution stérile de tampon standard filtrée phosphate (PBS), en s'assurant qu'aucune bulle est piégée. </li><li> Clip du tube de silicone longtemps mise sous pression du PBS à partir du côté le plus court à 1 atm. Une piscine de PBS qui suinte à travers l'ouverture pourrait être visible dans le flacon. Clip de l'offre sous pression de la PBS et détacher le tube de silicone court à partir de cette offre. </li><li> Remplissez le flacon avec filtration PBS à l'aide d'une seringue. </li><li> Immerger une Ag / Ag: électrode de Cl dans le tube court et une contre-électrode dans le flacon. Un impédancemètre est utilisé pour confirmer que la résistance d'accès se situe entre 300kohm et 3Mohm et la capacité de shunt est entre 10pF et 25pF. Une puce avec une diminution de la résistance est susceptible d'avoir une fuite, et une capacité plus élevée est considérée comme impropre pour une utilisation comme il peut ne pas capturer les plus rapides la dynamique de l'électrophysiologie de la cellule 6. Une puce avec une capacité plus faibleou une résistance plus élevée est considérée comme branché, mais il pourrait simplement s'agir d'une bulle est piégée dans l'orifice. Certaines puces sont un nouveau test après 1H et constaté que l'impédance électrochimique correcte. </li><li> Rincer le canal fluidique avec de l'eau déminéralisée stérile; vider le flacon dessus et rincer avec le même, à deux reprises. </li><li> Immergez la puce emballé avec des tubes dans l'eau fraîche désionisée stérile pendant 30 minutes puis de charger avec d'autres puces dans un récipient stérile rempli avec de l'eau déminéralisée stérile. Cela garantit que les puces restent hydrophile et protégés de toute contamination. </li></ul> 3. Préparation Chips dans le laboratoire de biologie cellulaire Les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte laminaire HEPA filtré de flux en utilisant les techniques d'asepsie, toutes les solutions utilisées dans cette procédure doit être filtrée stérilisés avant leur utilisation à l'aide d'un filtre 0.22μm. <ul type="disc"><li> Ouvrez un conteneur à puce sous une hotte laminaire HEPA filtré débit et retirer des jetons de container face vers le bas pour éviter l'excavation éventuels contaminants flottants dans le flacon haut. </li><li> Rincer haut de flacon de 2x à puce avec l'eau fraîchement filtrée désionisée stérile afin de retirer tous les débris résiduels de la surface de la puce. </li><li> Aspirer l'eau stérile déionisée hors du flacon en haut. </li><li> Branchez une extrémité du tube silastic attaché à la chaîne fluidique à une seringue stérile sous pression contenant de l'eau filtrée désionisée. Dans notre système, les seringues remplies de solution sont mis sous pression par la connexion à un réservoir d'air comprimé réglé à 20 psi. Pour assurer la stérilité, l'air est filtré (filtre de 0,22 um) avant l'entrée dans la seringue et de notre système dispose également d'une vanne de marche / arrêt qui nous permet d'arrêter ou de faire pression en cas de besoin. </li><li> Utilisation d'une pince hémostatique, serrer l'extrémité de sortie de la tubulure. </li><li> Ouvrir le soupapes allumées / éteintes pour mettre sous pression la solution. </li><li> À rincer le fluide subterranen de la puce avec l'eau fraîche déminéralisée stérile, déblocage l'extrémité de sortie du tube. </li><li> Pour desCE l'eau à travers l'ouverture, fixer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique. </li><li> Pour éviter le drainage de l'eau, serrer les extrémités d'entrée et de sortie de la tubulure avec une pince à bec et fermer la marche / arrêt vannes. </li><li> Détachez l'extrémité d'entrée du tube de la seringue. </li><li> Insérer les bouchons de verre dans les deux extrémités du tube et enlever les pinces hémostatiques. </li><li> Remplissez le flacon avec de l'eau dessus steriled filtre désionisée. </li><li> Placer le couvercle d'une boîte de 35 mm stérile dans la base d'un plat de 100 mm stérile </li><li> Puce Déposer sur le dessus du couvercle de 35 mm et la couverture avec 100 couvercle de boîte de mm. </li><li> Puces d'image afin de s'assurer que la membrane et l'ouverture des puces sont exempts de débris et / ou des bulles d'air. Dans notre laboratoire, nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail. </li><li> Si des débris et / ou des bulles d'air sont présents, à plusieurs reprises rincer le canal fluidique et le flacon haut. Si les débris et / ou des bulles d'air ne peuvent pas être enlevé de la puce est éliminé. </li><li> Une fois que les puces sontimagé, retourner à hotte à écoulement laminaire et débrancher les deux extrémités de la tubulure. </li><li> Attacher une extrémité de la tubulure à une seringue sous pression contenant les milieux physiologiques. </li><li> Serrer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique </li><li> Ouvrir la vanne de pression, retirer la pince hémostatique de l'extrémité de sortie de la fluidique et rincer le canal fluidique avec les milieux physiologiques </li><li> À rincer le fluide souterrain avec les milieux physiologiques, ouvrir le soupapes allumées / éteintes et enlever la pince hémostatique de l'extrémité de sortie de la tubulure. </li><li> Pour forcer les milieux physiologiques à travers l'ouverture, fixer l'extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique. </li><li> Pince extrémité d'entrée de la tubulure avec une pince hémostatique et fermer l'soupapes allumées / éteintes. </li><li> Retirez l'extrémité d'entrée du tube de la seringue et branchez les deux extrémités du tube avec des bouchons glas. </li><li> Retirer les pinces hémostatiques. </li><li> Enlevez l'eau du flacon en haut. </li><li> Remplissez le flacon dessus avec filtre stérilisés milieux physiologiques. </li><li>Placez le dos à puce dans le plat de 100 mm de Petri. </li><li> Placer la base d'un plat de 35 mm dans la boîte de 100 mm et le remplir avec de l'eau désionisée filtre stérilisé pour enrichir l'humidité. </li><li> Couvrir le plat jusqu'à ce qu'il soit temps pour le placage </li></ul> 4. Placage cellulaire des neurones d'escargots Les puces de patch-clamp peut être approprié pour une variété de préparations. Nous sommes en train de tester nos puces avec des mammifères primaires neurones corticaux et ont obtenu des résultats préliminaires avec des cellules cultivées pendant 14 jours 7, qui indique que notre protocole de stérilisation est adéquate et que les puces ne sont pas cytotoxiques à long terme des cultures. Pour l'application de ce protocole, les neurones d'escargots ont été choisis parce qu'ils représentent un modèle simple, mais bien établie pour étudier neuronale électrophysiologie 11, et c'est avec ces cellules que nous avons obtenu les résultats les plus significatifs à ce jour 10. L'isolement des cellules et des procédures détaillées de la culture ontété décrit précédemment 12, 13. <ul type="disc"><li> Retirer la coquille externe de 2-3 mois Lymnaea stagnalis vieux forceps émoussé et les animaux anesthésier dans une solution saline contenant Lymnaea Listerine 10%. Toutes les étapes subséquentes réalisée de manière aseptique à l'intérieur d'une hotte flux d'air laminaire avec un équipement de dissection stérilisé et des solutions à la température ambiante. </li><li> Remplacer les milieux physiologiques dans les fluidique avec la solution d'enregistrement approprié à l'aide d'une pipette Eppendorf. Dans le cas de neurones Lymnaea la solution contient (en mM): 50 KCl, MgCl 2 5, 5 éthylènebis (oxyéthylènenitrilo) tétraacétique (EGTA) et 5 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Epingler les escargots dans un plat rempli de Sylgard Lymnaea une solution saline et de supprimer cerveau entier tel que décrit précédemment 13 </li><li> Traiter le isolatcerveaux éd dans les médias définis (DM) avec trypsine (solution à 0,2%, Sigma, catalogue # T-9201) pour 18 minutes, suivie par un traitement en DM et inhibiteur de la trypsine (Sigma, de soja, Catalogue # T-9003) pendant 15 minutes. </li><li> Epingler les cerveaux dans un plat rempli de Sylgard petite osmolarité élevée définie médias (HODM - DM avec le glucose ajouté, 750 pi de solution de glucose 1M à 20 ml de DM). </li><li> En utilisant des pinces fines et les ciseaux de dissection, retirer la gaine extérieure et intérieure des ganglions de l'intérêt, d'exposer les neurones. </li><li> En utilisant une pipette en verre poli feu rempli de HODM et attaché à une microseringue, appliquer une aspiration douce près de la cellule d'intérêt (gauche dorsale pédale 1) jusqu'à ce que le neurone se détache du cerveau et est suspendu dans la pipette. </li><li> La pipette de verre est ensuite déplacé et trempée dans neuropuces individuels lorsque l'éloignement de la douceur microseringue permet aux neurones d'être légèrement poussé hors de la pipette et placé au-dessus des trous de raccordement individuels sur les puces.</li><li> Laisser les cellules tranquille pendant un minimum de 2h à température ambiante afin de promouvoir leur attachement à la surface de la puce qui entoure l'ouverture. </li></ul> 5. Des enregistrements électrophysiologiques Pour connecter les puces à l'amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis) <ul type="disc"><li> Remplacer la solution dans le fluide souterrain et dans le flacon puce avec les solutions d'enregistrement appropriées. Dans le cas de neurones Lymnaea, les chambres de culture supérieures sont remplis d'une solution saline Lymnaea (en mM: 51,3 NaCl, KCl 1,7, 4 CaCl 2, MgCl 2 et 1,5) tamponnée à un pH de 7,9 à 14 HEPES. </li><li> Pour plus de stabilité, de la colle la puce sur une lame de verre et le placer sous un microscope. </li><li> Pour connecter la puce à l'amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis), couper un bout du tube et insérez une SilveFil r qui est relié à la tête-étape. </li><li> Placer l'électrode de référence dans le flacon supérieure de la puce. </li><li> La puce est maintenant prêt pour l'enregistrement. </li><li> Appliquer une étape 5 mV avec l'amplificateur pour mesurer la résistance totale (R t) et déterminer la configuration des neurones: cellule attenante (R t&gt; 1 GQ); cellules entières (Rt = 50-100 transitoires MQ ainsi capacitif, ce qui indique la rupture des membranes sur l'ouverture), ou pas de sceau (R t &lt;5 MW). Dans notre dernière série d'expériences 10, 58 pour cent% des cellules avaient joints à haute résistance et, de ceux, 80% des cellules ont montré des réponses excitables. </li></ul> 6. Les résultats représentatifs <ul type="disc"><li> Appliquer dépolarisant impulsions de courant (20 incrément pA) au neurone (dans ce cas LPeD1). </li><li> Tenez le neurone à près Vm à son potentiel de repos (~ - 60 mV). </li><li> Observez les réponses à ces impulsions dépolarisantes. Potentiels d'action devrait surréactionêtre observé si le neurone est viable. </li><li> La figure 4 montre un résultat représentatif qui est discuté en détail dans les 14, 15. </li></ul><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Réponses de tension Figure 4. (En haut) d'un neurone à LPeD1 série graduée de intracellulaires des impulsions de courant (ci-dessous). Les impulsions de courant ont été appliqués à Vm = - 60 mV. Dépannage <ul type="disc"><li> Avant de placage, copeaux d'image pour déterminer si la membrane et l'ouverture sont exempts de débris et adapté pour le placage. Nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail. Dans notre dernière série d'expériences 1, 67 pour cent% de copeaux ont été amorcée avec succès de cette manière. </li><li> Si des débris et / ou des bulles d'air sont présents jetez puce et essayer un autre. </li><li> Divers traitements de surface (plasma) ou revêtements (PDL, PEI, etc) peut être essayé, mais le succès peut être très dépendant de type de celluleutilisée. </li><li> La composition de la fluidique ("pipette") dans une solution critique pour la formation de la giga-joint et l'ensemble de cellules-. Ajuster la solution, en accordant une attention à l'osmolarité, le pH, et le maquillage ionique. </li><li> Pour la culture à plus long terme, commencer par les médias dans le canal microfluidique, puis passer à pipeter une solution avant l'enregistrement par la gravité de perfusion douce alimenté (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

SCGDV patch-clamp plate-forme d&#39;interrogation à puce est un outil potentiellement puissant pour haute dosages contenu de l&#39;information pharmaceutiques et d&#39;enquêter sur des modèles in vitro de la maladie. Ses avantages par rapport aux pipettes en verre sont une résistance faible accès, qui est un avantage pour sonder les grandes cellules, et en dépit d&#39;une capacité un peu plus grande se traduira par la dynamique comparables pour les petites cellules. Cellulaire spontanée à joints d&#39;ouverture ont été obtenus en routine, et l&#39;entrée de cellules entières a été observé que 14 spontanée. Un nette différence entre les puces et la méthode de pipette de verre est le fait que la sonde est une partie de la boîte de culture cellulaire et n&#39;est pas manuellement mis en contact avec la membrane cellulaire. La culture de cellules, peut-être une partie de réseaux fonctionnels, les résultats dans des modèles plus biologiquement pertinentes comme modèles de maladies, et un mécanisme différent pour obtenir des cellules haute pour sonder les phoques 16. Cependant, par contraste avec des suspensions cellulaires aspiration, Canot être utilisé pour positionner une cellule sur la sonde. Neurones d&#39;escargots, comme d&#39;autres grandes cellules, se prêtent à un positionnement manuel sur le dessus de la sonde. Pour le placement des cellules plus petites nécessitant des temps de culture plus longues, nous avons éliminé la nécessité de toute manipulation et de garder une forte probabilité de l&#39;obtention d&#39;un joint d&#39;étanchéité par des polypeptides d&#39;adhésion de structuration sur le dessus des sondes pour placer les cellules au-dessus des sondes, et a démontré des cellules sur le sonde 17,18. SCGDV développe aussi un polyimide microfluidique patch-clamp puce 19 avec une capacité comparable à celle du verre de pipette. Le but ultime de ce projet est un multiple des sondes de patch-clamp à puce qui permet le contrôle simultané de l&#39;activité électrophysiologique des neurones engagés dans plusieurs comportement du réseau à la résolution des canaux ioniques individuels 14. Cette méthode est une méthode complémentaire à haute résolution réseaux d&#39;électrodes multi-20.

la culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la scgdv de patch-clamp chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

En raison de sa sensibilité exquise et la capacité de surveiller et de contrôler des cellules individuelles au niveau des canaux ioniques, patch-clamp est l'étalon-or de l'électrophysiologie appliquée aux modèles de maladies et les écrans aussi bien pharmaceutiques 1. La méthode implique traditionnellement doucement en contact une cellule avec une pipette en verre remplie d'une solution physiologique dans le but d'isoler une parcelle de la membrane sous son sommet 2. Une électrode inséré dans la pipette capture d'ions de canal activité dans la pièce de membrane ou, lorsque la rupture, pour la cellule entière. Dans la dernière décennie, de patch-clamp puces ont été proposés comme une alternative 3, 4: un film en suspension sépare le milieu physiologique du milieu de culture, et une ouverture microfabriqué dans le film remplace le sommet de la pipette. Patch-clamp puces ont été intégrés dans les systèmes automatisés et commercialisées pour criblage à haut débit 5. Pour incrla facilité de débit, ils comprennent la livraison fluidique de cellules provenant de la suspension, leur positionnement sur l'ouverture par aspiration, et des routines automatisées pour détecter cellule-à-sonde joints, entrer en mode cellule entière. Nous avons présenté un rapport sur ​​la fabrication d'un silicium de patch-clamp puce avec une impédance optimale et la forme orifice qui permet l'enregistrement de haute qualité de potentiels d'action dans les neurones d'escargots d'élevage 6; récemment, nous avons également fait état ​​de progrès vers l'interrogation neurones de mammifères 7. Nos patch-clamp puces sont fabriquées au Centre canadien de fabrication de dispositifs photoniques 8, une fonderie commerciale, et sont disponibles en grande série. Nous sommes désireux de s'engager dans des collaborations avec des électrophysiologistes pour valider l'utilisation de la technologie CNRC dans différents modèles. Les copeaux sont utilisées selon le schéma général représenté dans la figure 1: la puce de silicium est au fond d'un flacon de culture plexiglas et l'arrière de l'ouverture est reliée à une souterraine Channel munie de tubes à chaque extrémité de l'emballage. Les cellules sont cultivées dans le flacon et la cellule au-dessus de la sonde est contrôlée par une électrode de mesure insérée dans les deux channel.The en dehors des ports fluidiques faciliter l'échange d'une solution avec une perturbation minimale de la cellule, ce qui est un avantage par rapport aux pipettes en verre pour intracellulaire perfusion. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Principe de la mesure à l'aide de la SCGDV patch-clamp puce Nous détaillons ici les protocoles de stérilisation et d'amorcer les puces, les charger avec le milieu, la plaque entre eux avec des cellules, et enfin les utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques.

Nous montrons comment plane de patch-clamp puces fabriquées au sein du Conseil national de recherches du Canada sont stérilisés, apprêté, chargé avec le milieu, plaqué avec des cellules, et utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques.

La culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

En raison de son excellente sensibilité et de sa capacité à surveiller et à contrôler des cellules individuelles au niveau des canaux ioniques, le patch-clamp est la méthode de référence...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'enregistrer l'activité électrophysiologique de cellules cultivées au moyen d'une puce de type patch clamp planaire. Cela est réalisé en stérilisant, en amorçant et en testant les puces de patch clamp afin de permettre la croissance de cultures cellulaires et le suivi ultérieur de leur activité électrophysiologique. Après le test, les puces peuvent être stockées jusqu'à ce qu'elles soient à nouveau amorcées dans un laboratoire de biologie cellulaire.À l'étape suivante, les neurones sont extraits des membres, des staus, et cultivés sur les puces. Enfin, les puces sont connectées à un amplificateur de patch clamp afin de surveiller l'activité électrophysiologique des cellules. Le principal avantage de cette technologie par rapport aux puces de patch clamp planaires existantes est qu'elle convient à l'utilisation avec des neurones en culture établie, permettant l'analyse de neurones communicant de manière synaptique.Cette méthode et cette approche permettront une meilleure compréhension des fonctions des canaux ioniques dans les cellules excitables intégrées à un réseau neuronal, tant dans des conditions normales que pathologiques. Les implications de cette méthode s'étendent à la pharmacologie, où elle peut être utilisée pour effectuer des criblages médicamenteux à débit moyen et à contenu informationnel élevé, ciblant les canaux ioniques et les protéines réceptrices. Nous avons choisi de démontrer cette méthode en utilisant des neurones de limace, car ces neurones peuvent être facilement positionnés et cultivés.Et comme ces neurones reformeront un réseau en culture, ils constituent un excellent modèle pour l’étude des transformations. Plus important encore, ces puces peuvent également être utilisées avec d'autres systèmes cellulaires, tels que les cellules cardiaques et les cellules cancéreuses. Le principal défi lié à l'utilisation des puces de patch-clamp planaires consiste à obtenir des puces dotées d'ouvertures propres, ainsi qu'une mise en place et une culture cellulaires adéquates.Des puces débranchées seraient contre-productives, et par conséquent toutes les puces sont testées avant d'être utilisées. Le point le plus critique de l'évaluation électrophysiologique intervient une fois que les cellules ont été cultivées. Il consiste en la formation du scellement gigaseal entre la membrane cellulaire et le rebord supérieur de la puce.Toutes les puces de patch-clamp plantaires produites jusqu'à présent utilisaient des cellules isolées en suspension et comptaient sur une aspiration pour attirer les cellules vers l'ouverture afin de former un scellement gigaohm. Formation du scellement gigaohm. L'utilisation de nos puces se produit spontanément.Alors que les neurones sont en culture et ne nécessitent pas d'aspiration, je vais démontrer l'étape de stérilisation de la puce et de sélection. Tanya expliquera le chargement dans un laboratoire de biologie cellulaire, Colin illustrera la préparation des cellules et la mise en place. Enfin, Marcia montrera comment nos enregistrements sont effectués. Pour commencer cette procédure, stérilisez les puces dans un nettoyeur à plasma heric basic avec une pression résiduelle d'air comprise entre 0,1 et 0,3 millibar pendant 15 minutes à la puissance maximale de 18 watts.Le traitement au plasma rend également la puce hydrophile, ce qui facilite l'amorçage. Ensuite, fixez des tubes en verre avec un tube en silicone de laboratoire stérile de type cel élastique, de trois pouces à une extrémité et d’un pouce à l’autre extrémité. Puis remplissez les tubes avec une solution tampon phosphate stérile standard, en veillant à ce qu'aucune bulle ne soit piégée.Pincez le tube en silicone long tout en appliquant une pression sur le PBS par l'extrémité courte à une atmosphère. Ensuite, relâchez la pression dans le canal fluidique. Par la suite, remplissez le flacon avec du PBS à l’aide d’une seringue.Immergez une électrode en argent, chlorure d'argent dans le flacon et une électrode auxiliaire dans le tube court. Utilisez un impédancemètre pour confirmer que la résistance d'accès se situe entre 300 kiloohms et trois mégaohms, et que la capacité parasite se situe entre 10 picofarads et 25 picofarads. Ensuite, rincez le canal fluidique avec de l'eau déionisée stérile.Vider le flacon supérieur et répéter le processus de rinçage deux fois. Ensuite, immerger l'emballage contenant les puces avec les tubes dans de l'eau déionisée stérile fraîche pendant 30 minutes. Puis charger d'autres puces dans un récipient stérile rempli d'eau déionisée stérile.Cela garantit que les puces restent hydrophiles et protégées contre la contamination. Ouvrir un contenant de puce sous une hotte à flux laminaire équipée d'un filtre HEPA et retirer les puces en orientant le flacon vers le bas afin d'éviter toute contamination par des débris d'emballage flottant à la surface de l'eau. Pour éliminer tout résidu éventuel à la surface de la puce, rincer le flacon supérieur deux fois avec de l'eau déionisée stérile filtrée. Connecter une extrémité du tube élastique fixé au canal fluidique à une seringue sous pression contenant de l'eau déionisée stérile filtrée.Dans ce système, l'eau contenue dans la seringue est pressurisée par un réservoir d'air comprimé réglé à une atmosphère afin de garantir que l'air stérile soit filtré avant d'entrer dans la seringue. Ce système est également équipé de deux vannes marche-arrêt qui permettent de contrôler la pression lorsque cela est nécessaire. Bloquez l'extrémité de sortie de la partie fluidique à l'aide d'un hémostat.Ensuite, ouvrez la vanne du réservoir d'air comprimé pour pressuriser la solution. Puis, ouvrez le clamp à l'extrémité de sortie de la fluidique afin de rincer la puce avec de l'eau déionisée stérile fraîche. Serrez l'extrémité de sortie de la fluidique avec un clamp pour forcer l'eau à monter à travers l'ouverture.Pour éviter l'écoulement de l'eau, bloquer l'entrée du système fluidique avec le clamp et fermer les vannes d'arrêt. Ensuite, débrancher l'extrémité d'entrée du tube de la seringue. Boucher les deux extrémités du tube et retirer les pinces. Remplissez le flacon supérieur avec de l’eau déionisée stérile filtrée. Ensuite, placez le couvercle d’une boîte stérile de 35 millimètres sur le fond d’une boîte stérile de 100 millimètres. Puis, placez une puce sur le dessus du couvercle de 35 millimètres et recouvrez-la avec le couvercle d’une boîte de 100 millimètres.Pour s'assurer que la membrane et l'ouverture des puces sont exemptes de débris ou de bulles d'air, on procède à l'imagerie des puces. Si des débris ou des bulles d'air sont présents, le canal fluidique et le flacon supérieur sont rincés plusieurs fois avec de l'eau stérile.Si les débris ou les bulles d'air ne peuvent pas être éliminés, la puce est jetée. Une fois les puces imagées, ramenez-les sous la hotte à flux laminaire. Débranchez les deux extrémités du tube. Reliez une extrémité du tube à une seringue pressurisée contenant un milieu physiologique et serrez l'extrémité de sortie du tube avec le clamp hémostatique afin de rincer le circuit fluidique souterrain avec le milieu physiologique. Ouvrez les vannes d'ouverture/fermeture, puis retirez le clamp hémostatique de l'extrémité de sortie du tube pour forcer le milieu physiologique à remonter à travers l'orifice. Serrez à nouveau l'extrémité de sortie du tube avec le clamp hémostatique, serrez aussi l'extrémité d'entrée du tube avec le clamp hémostatique, puis fermez les vannes d'ouverture/fermeture. Ensuite, retirez l'extrémité d'entrée du tube de la seringue et obturez les deux extrémités du tube avec des bouchons en verre.Ensuite, retirez les hémostats. Puis retirez l'eau du flacon supérieur. Remplissez le flacon supérieur avec un milieu stérile filtré.Replacez la puce dans la boîte de 100 millimètres. Ensuite, placez la base de la boîte de 35 millimètres dans la boîte de 100 millimètres et remplissez-la d'eau déionisée stérile filtrée pour augmenter l'humidité. Puis couvrez la boîte jusqu'au moment de la mise en culture.Pour commencer cette procédure, retirez la coquille externe de limaces âgées de deux à trois mois à l’aide d’une pince effilée. Ensuite, anesthésiez les animaux dans une solution saline de limba contenant 10 % de Listerine, sous une hotte à flux laminaire. Fixez les escargots dans une boîte de culture remplie de solution saline de limba et retirez l’ensemble du cerveau.Ensuite, traitez les cerveaux isolés dans un milieu défini avec l'enzyme trypsine pendant 18 minutes. Après cela, traitez-les dans un milieu défini contenant un inhibiteur de la trypsine. Épinglez les cerveaux pendant 15 minutes à une petite boîte de culture cellulaire remplie d'un milieu défini à haute osmolarité à l'aide d'une pince fine et d'une paire de ciseaux de dissection.Retirez la gaine externe et la gaine interne des ganglions d'intérêt et exposez les neurones. Ensuite, fixez une pipette en verre polie au chalumeau, remplie d'un milieu défini à haute osmolarité, à une microsyringe et appliquez délicatement une aspiration près de la cellule d'intérêt jusqu'à ce que le neurone se détache du cerveau et soit suspendu dans la pipette. Après avoir changé le milieu dans le système fluidique de la puce neuronale pour une solution d'enregistrement appropriée, approchez délicatement la pipette en verre d'une fiole de culture et exposez le neurone doucement au-dessus de l'ouverture de la puce.Laisser les cellules en repos, sans perturbation, pendant au moins deux heures à température ambiante afin de favoriser leur attachement à la surface de la puce entourant l'ouverture. Remplacer la solution dans la boîte de culture par la solution d'enregistrement appropriée pour assurer la stabilité. Coller la puce sur une lame de verre et la placer sous un microscope pour relier les puces à l'amplificateur.Coupez l'extrémité longue du tube et insérez le fil d'argent relié à l'étage de tête. Ensuite, placez l'électrode de référence dans la boîte de culture de la puce. La puce est désormais prête pour l'enregistrement.Voici un exemple des réponses en tension d'un neurone dorsal du pédal gauche à une série graduée d'impulsions de courant intracellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'enregistrer l'activité électrophysiologique de cellules en culture à l'aide d'une puce de patch-clamp plan. N'oubliez pas que, lors de la première étape, nous sélectionnons les puces afin de nous assurer que celles non utilisées pour la mise en place des cellules sont bouchées ; les utilisateurs de Ture Biology commencent généralement à l'étape de chargement et trouvent typiquement encore quelques puces bloquées pour chaque lot.Cette nouvelle méthode représente une avancée importante dans le développement d'une technologie peu coûteuse permettant l'analyse de réseaux neuronaux in vitro avec un niveau de résolution sans précédent. Cette technologie peut conduire à des tests avancés pour l'identification de cibles thérapeutiques, le développement de médicaments et l'évaluation diagnostique. Un développement ultérieur de cette technologie offrira aux chercheurs en santé de nouveaux moyens d'explorer des thérapies innovantes contre les maladies ou troubles neurologiques.Son potentiel s'étend aux cellules cardiaques, aux cellules cancéreuses et à d'autres cellules possédant des propriétés électrogènes.

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