La culture et l'électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

L’objectif global de l’expérience suivante est d’enregistrer l’activité électrophysiologique de cellules cultivées à l’aide d’une puce de serrage planaire. Ceci est réalisé en stérilisant, amorçant et testant les puces de patch clamp pour permettre la croissance de la culture cellulaire et le suivi ultérieur de son activité électrophysiologique. Après les tests, les puces peuvent être stockées jusqu’à ce qu’elles soient à nouveau amorcées dans un laboratoire de biologie cellulaire.

Dans l’étape suivante, les neurones sont extraits des membres, des staus, et cultivés sur les puces. Enfin, les puces sont connectées à un amplificateur patch clamp afin de surveiller l’activité électrophysiologique des cellules. Le principal avantage de cette technologie par rapport aux puces de patch clamp existantes est qu’elle convient à une utilisation avec des neurones établissant une culture, permettant l’interrogation de la communication synaptique, communiquer dans les neurones.

Cette méthode et cette approche permettront de mieux comprendre les fonctions des canaux ioniques des cellules excitables intégrées dans un réseau neuronal dans des conditions normales et pathologiques. Les implications de cette méthode s’étendent à la pharmacologie où elle peut être utilisée pour effectuer des criblages de médicaments à débit moyen, à contenu d’information élevé, pour les canaux ioniques et les protéines réceptrices. Nous avons choisi de démontrer cette méthode à l’aide de neurones d’escargots car ces neurones peuvent être facilement positionnés et cultivés.

Et parce que ces neurones vont reformer le réseau dans la culture, ils font une excellente étude de la transformation. Plus important encore, ces puces peuvent également être utilisées dans d’autres systèmes cellulaires tels que les cellules cardiaques et cancéreuses. Le principal défi de l’utilisation de puces à patch clamp planaire est d’obtenir des puces avec des ouvertures, des cellules de placage et de culture propres.

Les puces débranchées seraient contre-productives, et donc toutes les puces sont testées avant d’être utilisées. Le point le plus critique de l’évaluation électrophysiologique survient une fois que les cellules ont été cultivées. Il consiste en la formation du giga joint entre la membrane cellulaire et les deux bords supérieurs bon marché.

Toutes les puces de serrage de patch plantaire produites datent d’utilisation d’une cellule isolée en suspension et reposent sur l’aspiration pour attirer les cellules vers l’ouverture afin de former un giga joint. Formation GigE. L’utilisation de nos puces se fait spontanément.

Bien que les neurones soient en culture et ne dépendent pas de l’aspiration, je vais démontrer l’étape de stérilisation et de criblage de la puce. Tanya expliquera le chargement dans un laboratoire de biologie cellulaire, Colin illustrera la préparation et le placage des cellules. Pour commencer cette procédure, stérilisez les puces dans un nettoyeur plasma de base herique avec une pression d’air résiduelle de 0,1 à 0,3 millibars pendant 15 minutes à la puissance maximale de 18 watts.

Le traitement au plasma rend également la puce hydrophile, ce qui facilite l’amorçage. Ensuite, installez les tubes de verre avec un tube en silicone de laboratoire élastique stérile, trois pouces à une extrémité et un pouce à l’autre extrémité. Remplissez ensuite les tubes avec une solution tampon de phosphate standard stérile, en vous assurant qu’aucune bulle n’est piégée.

Clipsez le long tube en silicone tout en pressurisant le PBS à partir de l’extrémité courte à une atmosphère. Relâchez ensuite la pression dans le canal fluidique. Après cela, remplissez le flacon de PBS à l’aide d’une seringue.

Plongez une électrode d’argent, de chlorure d’argent dans le flacon et une contre-électrode dans le tube court. Utilisez un impédancemètre pour confirmer que la résistance d’accès est comprise entre 300 kilo ohms et trois méga ohms, et que la capacité de shunt est comprise entre 10 pico ferriday et 25 pico ferriday. Ensuite, rincez le canal fluidique avec de l’eau désionisée stérile.

Videz le flacon supérieur et répétez le processus de rinçage deux fois. Par la suite, plongez l’emballage à pucer avec les tubes dans de l’eau désionisée fraîche et stérile pendant 30 minutes. Chargez ensuite les autres copeaux dans un récipient stérile rempli d’eau déminéralisée stérile.

Cela garantit que les puces restent hydrophiles et protégées de la contamination. Ouvrez un récipient à copeaux sous une hotte à flux laminaire filtrée HEPA et retirez les copeaux avec le flacon supérieur vers le bas pour éviter la contamination par les débris d’emballage flottant à la surface de l’eau. Pour éliminer tout débris résiduel de la surface de la puce, rincez deux fois le flacon supérieur avec de l’eau déminéralisée stérile filtrée Connectez une extrémité du tube élastique fixé au canal fluidique à une seringue pressurisée contenant de l’eau déminéralisée filtrée stérile.

Dans ce système, l’eau de la seringue est pressurisée par un réservoir d’air comprimé réglé sur une seule atmosphère pour garantir que l’air de stérilité est filtré avant d’entrer dans la seringue. Ce système est également équipé de deux vannes marche-arrêt qui permettent le contrôle de la pression en cas de besoin. Fixez l’extrémité de sortie de la fluidique à l’aide d’un hémostat.

Ensuite, ouvrez le robinet du réservoir d’air comprimé pour pressuriser la solution. Ouvrez ensuite l’hémostat à l’extrémité de sortie de la fluidique pour rincer la puce avec de l’eau déminéralisée fraîche et stérile. Fixez l’extrémité de sortie de la fluidique avec un hémostat pour forcer l’eau à remonter à travers l’ouverture.

Pour éviter l’écoulement de l’eau, fixez l’entrée de la fluidique avec l’hémostat et fermez les vannes marche-arrêt. Détachez ensuite l’extrémité d’entrée du tube de la seringue. Bouchez les deux extrémités du tube et retirez les hémostats.

Remplissez le flacon supérieur avec de l’eau déminéralisée stérile filtrée. Ensuite, placez le couvercle d’une boîte stérile de 35 millimètres sur la base d’une boîte stérile de 100 millimètres. Ensuite, placez une puce sur le couvercle de 35 millimètres et couvrez avec un couvercle de plat de 100 millimètres.

Pour s’assurer que la membrane et l’ouverture des puces sont exemptes de débris ou de bulles d’air, les puces sont imagées. Si des débris ou des bulles d’air sont présents. Le canal fluidique et le flacon supérieur sont lavés à plusieurs reprises avec de l’eau stérile.

Si les débris ou les bulles d’air ne peuvent pas être enlevés, la puce est jetée. Une fois les copeaux imagés, ramenez-les dans le capot à flux laminaire. Débranchez les deux extrémités du tube.

Fixez une extrémité du tube à une seringue pressurisée contenant un milieu physiologique et clampez l’extrémité de sortie du tube avec l’hémostat pour rincer le fluide souterrain avec un milieu physiologique. Ouvrez les vannes d’arrêt et retirez l’hémostat de l’extrémité de sortie du tube pour forcer le fluide physiologique à travers la pince d’ouverture, l’extrémité de sortie du tube avec la pince d’hémostat, l’extrémité d’entrée du tube avec l’hémostat et fermez les vannes d’arrêt. Ensuite, retirez l’extrémité d’entrée du tube de la seringue et bouchez les deux extrémités du tube avec des bouchons en verre.

Retirez ensuite les hémostatiques. Ensuite, retirez l’eau du flacon supérieur. Remplissez le flacon supérieur avec un milieu stérile filtré.

Remettez la puce dans la parabole de 100 millimètres. Après cela, placez la base de la parabole de 35 millimètres dans la parabole de 100 millimètres et remplissez-la d’eau déminéralisée stérile filtrée pour enrichir l’humidité. Couvrez ensuite le plat jusqu’au moment du dressage.

Pour commencer cette procédure, retirez la coquille extérieure des li saffs de deux à trois mois à l’aide d’une paire de pinces émoussées. Ensuite, anesthésez les animaux dans une solution saline contenant 10 % de Listerine dans une hotte à flux d’air laminaire. Épinglez les escargots dans une boîte de garde de cellule remplie de solution saline et retirez tout le cerveau.

Ensuite, traitez les cerveaux isolés dans des milieux définis avec l’enzyme trypsine pendant 18 minutes. Après cela, traitez-les dans un milieu défini et un inhibiteur de la trypsine. Pendant 15 minutes, épinglez les cerveaux dans une petite boîte de garde de cellule remplie de milieux définis à haute osmolarité à l’aide d’une paire de pinces fines et d’une paire de ciseaux de dissection.

Retirez les gaines externe et interne des ganglions d’intérêt et exposez les neurones. Ensuite, fixez une pipette en verre poli au feu remplie d’un milieu défini à haute osmolarité à une seringue microscopique et appliquez doucement une aspiration près de la cellule d’intérêt jusqu’à ce que le neurone se fixe à partir du cerveau et soit suspendu dans la pipette. Après avoir remplacé le support dans la fluidique de la puce neurologique par une solution d’enregistrement appropriée, versez la pipette en verre dans un flacon de culture et exposez doucement le neurone au-dessus de l’ouverture de la puce.

Laissez les cellules reposer sans être dérangées pendant au moins deux heures à température ambiante pour favoriser leur fixation à la surface de la puce entourant l’ouverture. Remplacez la solution dans la boîte de culture par la solution d’enregistrement appropriée pour la stabilité. Collez la puce sur une lame de verre et placez-la sous un microscope pour connecter les puces à l’amplificateur.

Coupez l’extrémité longue du tube et insérez le fil d’argent relié à la tête. Placez ensuite l’électrode de référence dans la boîte de culture de copeaux. La puce est maintenant prête pour l’enregistrement.

Voici un exemple des réponses en tension d’un neurone dorsal de la pédale gauche à une série graduée d’impulsions de courant intracellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’enregistrer l’activité électrophysiologique des cellules cultivées avec une puce de patch clamp planaire. N’oubliez pas que dans la première étape, nous criblons les puces pour nous assurer que les cellules non utilisées ont une biologie de Ture bouchée. Les utilisateurs commencent par l’étape de chargement et trouvent généralement encore quelques puces de bloc pour chaque lot.

Cette nouvelle méthode représente une percée importante dans le développement d’une technologie bon marché qui permet l’interrogation avec un niveau de résolution sans précédent des réseaux de neurones in vitro. Cette technologie peut conduire à des tests avancés pour l’identification de cibles thérapeutiques, le développement de médicaments et l’évaluation diagnostique. La poursuite du développement de cette technologie offrira aux chercheurs en santé de nouveaux moyens d’explorer de nouvelles thérapies pour les maladies ou les troubles neurologiques.

Son potentiel s’étend aux cellules cardiaques, au cancer et à d’autres cellules qui ont des propriétés électrogènes.