Name: Léchelle du génome décran pour cibles des miRNA laide de lID de bibliothèque MISSION cible (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Apprenez le criblage génomique des cibles de miRNA à l'aide de la bibliothèque Target ID. Cette méthode utilise la transfection cellulaire, le ganciclovir pour la sélection et le séquençage profond pour identifier les interactions microARN-gènes.

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Nous tenons à remercier toute la vie Sigma sciences cible Mission ID développement équipe de la Bibliothèque, en particulier Kevin Gutshall pour trouver la technologie et de la négociation des conditions de licence, et Heather Holemon pour son soutien et la participation à des discussions fructueuses de dépannage. Nous remercions également le Dr Joop Gäken du Kings College de Londres pour partager librement les résultats non publiés et des suggestions, et Qazi Hamid RxBiosciences pour la préparation d&#39;un lot de grande ADNc et sa persistance à l&#39;obtenir cloné. Nous tenons à remercier Nan Lin et Scott Bahr de SAFC pour effectuer des puces à ADNc et l&#39;analyse des données. MISSION est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent des relations financières avec des entités commerciales qui ont un intérêt dans le travail présenté.

microARN sont des ARN 20-24 nucléotides qui régulent l&#39;expression génique post-transcriptionnelle par inhibition de la traduction des ARNm, et souvent, la déstabilisation de l&#39;ARNm ciblé (revue dans [6]). Un seul miARN peuvent réguler plusieurs centaines ARNm pour contrôler la réponse d&#39;une cellule à signaux développement et d&#39;environnement. Identifier et valider les ARNm cibles est essentielle pour déterminer le rôle d&#39;un miARN et de la fonction dans ces voies. Cependant, l&#39;identification des cibles n&#39;est pas simple parce que, chez les animaux, les miRNAs et de leurs sites cibles ne sont pas tout à fait complémentaire. La «graine» région, fonde 2 à 7 de l&#39;extrémité 5 &#39;du miRNA, est généralement complémentaire à ses objectifs. Cependant, il ya de nombreuses exceptions à la règle de semences, et en aval d&#39;appariement de bases peut compenser pour un match de semences imparfaite. Un certain nombre d&#39;algorithmes informatiques ont été développés pour prédire les cibles des miRNA sur la base de correspondance de semences et de compensation en aval, la structure cible d&#39;unla position d, conservation de la séquence, et divers autres paramètres qui ont été observées pour des cibles validées expérimentalement (revue dans [7]). Bien que les prédictions in silico sont pratiques et permettent d&#39;identifier de nombreuses cibles des miRNA valides, la plupart des gènes prédit échouent aux tests de validation expérimentale, et de nombreux objectifs réels ne sont pas prévues. En outre, parce que les algorithmes informatiques sont basés sur les caractéristiques cibles préalablement déterminées, elles ne permettent pas de découverte de cibles qui s&#39;écartent de ce qui est déjà connu. Un certain nombre de systèmes expérimentaux ont été utilisés avec succès pour identifier ou de découvrir des cibles des miRNA fonctionnels dans les cellules vivantes. Ces méthodes de dépistage mondiaux comprennent les microréseaux et séquençage de l&#39;ARN, l&#39;ARN co-immunoprécipitation (RIP), et l&#39;étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC), une méthode protéomique (revue dans [7]). Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients. Depuis miARN ciblant déstabilise souvent un ARNm et conduit à sa dégradation, la perte ogain de r dans le niveau d&#39;ARNm après l&#39;introduction d&#39;un miRNA imiter ou d&#39;un inhibiteur, respectivement, peuvent identifier les cibles des miRNA. Cette perte ou le gain de l&#39;ARNm est facilement détectée par puces à ADN ou par séquençage en profondeur. Bien que les méthodes de détection d&#39;ARNm sont plus simples et plus sensible que les méthodes de détection de protéines, de détection d&#39;ARNm va manquer les cibles des miRNA qui ne sont pas dégradées. Des rapports récents du laboratoire Bartell comparant les résultats cibles des miRNA de détection de l&#39;ARN avec ceux de SILAC [8] ou le profilage des ribosomes [9] indiquent que les miRNAs mammifères principalement agissent en réduisant les niveaux d&#39;ARNm cibles. Cependant, de nombreux autres laboratoires qui travaillent avec des objectifs individuels miARN ont détecté le changement dans la protéine, mais aucun changement dans le niveau d&#39;ARNm. Rapports de ce qui semble être régulation de la traduction sans perte ARNm détectable comprennent: miR-10b sur HOXD10 [10], miR221/222 sur p27kip1 [11], miR-21 sur Pdcd4 [12], miR-126 sur p85β [13] , miR-34 sur SIRT1 [14], miR-21 sur PTEN [15], miR-302d sur Arid4b [16], miR-200c sur JAG1 [17], et miR-299, 297, 567, une 609 sur VEGFA [18]. En outre, Clancy et al [19] a récemment rapporté que la réglementation en translation par let-7 a été détectée lorsque isoformes d&#39;ARNm individuels qui contiennent le site let-7 ont été détectés cible de manière sélective. Celui-ci suggère que, au moins dans certains cas, régulation de la traduction peut être négligé dans un profil composite - qui est, lorsque toutes les isoformes d&#39;ARNm sont détectés comme un ARNm - obtenue avec un microréseau nombreux et analyses de séquences. Co-immunoprécipitation des miARN-ARNm complexes via Argonaute (généralement Ago2) ou d&#39;une autre protéine associée (ARN immunoprécipitation, ou RIP) permet d&#39;isoler les cibles des miRNA indépendamment du mécanisme de règlement. En outre, RIP détecte endogène, et probablement biologiquement pertinente, les interactions. Cependant, on ne sait pas si toutes les interactions miARN-ARNm sont fonctionnels, et RIP serait manquer aucun ARNm cibles qui associent uniquement de façon transitoire ou sont rapidement dégradées. En outre, spécifiques miARN-ARNm des partenaires doit être déduite bioinformatiment parce que toutes les paires de miARN-ARNm co-précipités ensemble. Enfin, SILAC identifie directement le produit final de la réglementation miRNA, la protéine elle-même, mais elle est insensible et manque donc de protéines rares et de petits changements de pliage dans les taux de protéines. À la lumière des limites des méthodes actuelles d&#39;identification des miRNA cibles, nous nous sommes sentis un test global supplémentaire pour identifier les cibles des miRNA fonctionnelles par un autre mécanisme a été nécessaire. Pour répondre à ce besoin, nous sous licence une technologie inventée par Joop Gaken et Azim Mohamedali du Kings College de Londres. Leur invention est une protéine de fusion double sélection, en particulier, une thymidine kinase-zéocine fusion, régie par une banque d&#39;ADNc de séquences cibles potentielles de miARN dans son 3&#39;UTR. Les cellules transfectées de façon stable avec et exprimant TKzeo-ADNc constructions peuvent être sélectionnés avec la zéocine, comme illustré dans la figure 2. Après avoir exprimé un miRNA d&#39;intérêt, les objectifs que miARN peuvent être sélectionnés wie ganciclovir, comme l&#39;illustre la figure 3. Ganciclovir tue les cellules exprimant la thymidine kinase, qui est, toutes les cellules exprimant TKzeo-ADNc défaut une cible pour la miARN d&#39;intérêt. Ciblée d&#39;ADNc peut être isolé par amplification par PCR de l&#39;ADN à partir de cellules qui survivent au ganciclovir en utilisant des amorces qui flanquent les produits d&#39;ADNc et la PCR peut être séquencés pour identifier les cibles. Nous avons développé une technologie Collège du Roi dans un nouvel outil pour l&#39;identification globale et la découverte de cibles fonctionnelles miRNA humains - la Bibliothèque ID MISSION cible. Avec la Bibliothèque ID cible, les utilisateurs peuvent isoler des cibles des miRNA par une série de transfection de culture cellulaire de mammifère et des mesures de sélection des médicaments. La bibliothèque est complète, et contient 66-79% des gènes humains. Les premiers résultats indiquent que les deux précédemment découvert ainsi que de nouvelles cibles peuvent être isolés de la Bibliothèque ID MISSION cible. Bien que le protocole est d&#39;une certaine longueur,l&#39;utilisation de la Bibliothèque ID cible nécessite des techniques standard de laboratoire moléculaires - culture cellulaire de mammifère, la transfection, la sélection des médicaments, la PCR et le séquençage - et, par conséquent, devraient être bien dans les moyens de la plupart des biologistes. Nous suggérons qu&#39;une attention suffisante soit accordée à la conception expérimentale proprement dite, l&#39;optimisation des conditions de culture, et surtout, de pré-tester chaque nouveau type de cellule pour déterminer les niveaux de médicaments optimales pour les étapes de sélection (kill-courbes) pour assurer le succès avec la Bibliothèque ID cible. Comme avec les méthodes d&#39;identification des miRNA tous les cibles, il est fortement recommandé que les objectifs identifiés par criblage de la bibliothèque ID cible être validée par une deuxième méthode, tels que puces, qRT-PCR, test rapporteur (c.-à-luciférase), ou l&#39;analyse de l&#39;Ouest.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Le ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute ADN génomique des mammifères Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> K nucléofection Cell Specificil </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zéocine </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> ID cible Bibliothèque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des mirna l&#39;aide de l&#39;id de bibliothèque mission cible

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Bibliothèque ID cible est conçu pour aider à la découverte des cibles et l&#39;identification des microARN (miARN). La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l&#39;échelle du génome ADNc cloné dans les 3&#39;UTR aval de la protéine de fusion à double sélection, la thymidine kinase-zéocine (TKzeo). Le premier tour de sélection est pour les transformants stables, suivie avec l&#39;introduction d&#39;un miRNA d&#39;intérêt, et enfin, la sélection pour les ADNc contenant la cible du miRNA de. ADNc sélectionnés sont identifiés par séquençage (voir la figure 1-3 pour Workflow Library ID cible et les détails). Pour assurer une large couverture du transcriptome humain, ID cible Bibliothèque ADNc ont été générés via oligo-dT amorçage utilisant un pool d&#39;ARN total préparé à partir de plusieurs tissus humains et des lignées cellulaires. Résultant gamme d&#39;ADNc de 0,5 à 4 ko, avec une taille moyenne de 1,2 kb, et ont été clonés dans le p3TKzeo double plasmide de sélection (voir la figure 4 pour une carte de plasmide). Les gènes cibles représentées dans le lithèque peut être trouvée sur la page web de Sigma-Aldrich. Les résultats de séquençage Illumina (tableau 3), montrent que la bibliothèque comprend 16 922 des 21,518 gènes uniques dans UCSC RefGene (79%), ou 14.000 gènes avec 10 ou plus de lectures (66%).

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l&#39;échelle du génome de collecte de l&#39;ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l&#39;application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

La Target ID Library est conçue pour aider à la découverte et à l'identification des cibles des micro-ARN (miARN). La Target ID Library est une bibliothèque basée sur des plasmides, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser un criblage à haut débit à l'échelle du génome des cibles de microARN en utilisant la bibliothèque Target ID. Cela est réalisé par transfection cellulaire avec le plasmide de la bibliothèque. Une collection à l'échelle du génome de cDNAs clonés est transférée, suivie d'une sélection de lignées cellulaires stables.Les cellules de la biblioth&egrave;que &eacute;tablie sont ensuite transfect&eacute;es avec le vecteur d'expression de l'ARN microbien afin de permettre la co-expression de la cible de l'ARN microbien et de la thymidine kinase. &Agrave; ce stade, le ganciclovir est utilis&eacute; pour s&eacute;lectionner les cellules exprimant des cibles sp&eacute;cifiques de l'ARN microbien, en &eacute;liminant celles qui expriment la thymidine kinase. L'ADNc contenant les sites cibles de l'ARN microbien est ensuite amplifi&eacute; par PCR &agrave; l'aide des amorces d'amplification de l'identifiant de la cible, afin de s&eacute;quencer et d'identifier les cibles de la biblioth&egrave;que d'ARN microbien.En fin de compte, des résultats sont obtenus permettant d'identifier des cibles spécifiques d'ARN micro dans les cellules, sur la base d'une analyse de séquençage profond. La bibliothèque d'identification des cibles d'ARN micro est conçue pour faciliter la découverte et l'identification de gènes cibles pour les ARN micro. Ici, nous démontrons son utilisation et son application.Avant le début de ce protocole, choisissez une lignée cellulaire qui n'exprime pas ou qui exprime de faibles niveaux de l'IRA d'intérêt, mettez en culture et amplifiez les cellules afin d'obtenir environ deux fois 10⁷ cellules à 80 % de confluence. Après la trypsine, transférez les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres à vis, puis centrifugez les cellules à 200 × g pendant cinq minutes pour former un culot. Après élimination du milieu, resuspendez le culot cellulaire afin de laver les cellules, centrifugez à nouveau et répétez le lavage une deuxième fois.Entre-temps, préparez suffisamment de tubes de 0,5 millilitre pour le nombre de transfections en ajoutant deux microgrammes de la bibliothèque d'ADN cible à chaque tube. Resuspendez maintenant le culot cellulaire dans le tube de 15 millilitres en utilisant 600 microlitres de solution de nucléofection Maxim par transfection. Une réaction à la fois.Ajoutez 100 microlitres de cellules à l'aliquote, ainsi que deux microgrammes de plasmide, en mélangeant à l'aide du bout de la pipette. Transférez chaque mélange dans un vete d'effet nucléaire. Insérez un vete dans l'instrument d'effet nucléaire et exécutez un programme optimisé adapté à la lignée cellulaire.Ensuite, remplissez une pipette de transfert avec du milieu préchauffé. Aspirez les cellules transfectées avec la même pipette et transférez-les dans un puits d'une plaque à six puits préparée au préalable. Répétez ce processus pour chaque affection nucléaire NU, en suivant chaque affection nucléaire NU.Remettez les cellules dans la chambre de croissance pour une incubation nocturne le jour suivant. Remplacez le milieu et laissez les cellules se rétablir pendant trois à cinq jours. Une fois que les cellules se sont rétablies, retirez le milieu et ajoutez un milieu complet contenant le niveau approprié d'éosine pour sélectionner l'intégration stable et l'expression de la protéine de fusion TKZO.La concentration d'éosine peut être déterminée au préalable comme décrit dans le texte. Surveiller les cellules pour la sélection à l'éosine en fonction de la viabilité cellulaire. Remplacer le milieu par un milieu frais contenant de l'éosine tous les deux à trois jours.Une fois confluents dans la plaque à 6 puits, passagez et étendez les cellules dans des flacons plus grands. Une analyse de courbe de mortalité est réalisée afin d'établir la dose létale minimale des réactifs de sélection utilisés dans l'étude. Pour éviter des réponses phénotypiques indésirables, effectuez d'abord les courbes de mortalité en semant les cellules dans chaque puits d'une plaque à 96 puits contenant 120 microlitres de milieu frais le lendemain.Ajouter le médicament aux puits sélectionnés. Des antibiotiques tels que la G418 ou la puromycine sont utilisés pour sélectionner l'intégration du vecteur d'expression de l'ARNmi, ou bien l'acyclovir est utilisé pour sélectionner contre l'expression de la thymidine kinase. Pendant l'incubation, examiner la viabilité cellulaire pour chaque concentration de médicament tous les deux jours. Remplacer le milieu contenant l'agent de sélection tous les trois jours.La concentration minimale du réactif de sélection provoquant une mort cellulaire complète après la durée souhaitée doit être utilisée pour ce type cellulaire et cette expérience, une fois les concentrations du médicament déterminées. Préparez la transfection pour MI en cultivant et en amplifiant les cellules de la bibliothèque d'identifiants cibles afin d'obtenir deux fois dix puissance sept cellules. Traitez à la trypsine lorsque les cellules présentent une confluence supérieure à 80 %.Transférez les cellules dans un tube stérile de 15 millilitres à visser et faites centrifuger à 200 ×g pendant cinq minutes. Éliminez le milieu et lavez le culot cellulaire deux fois comme précédemment. Ensuite, pour chaque transfection, ajoutez deux microgrammes du plasmide d'expression MIRA dans un tube de 0,5 millilitre.Réalisez l'incorporation nucléaire de l'ARNm dans les cellules de la banque en utilisant la même méthode que celle employée pour la transfection de la banque d'identifiants cibles. Après que les cellules se soient rétablies pendant trois à cinq jours, remplacez le milieu par un milieu complet contenant le niveau approprié d'antibiotique, tel que déterminé à partir du test de courbe d'efficacité létale.Surveillez les cellules pour la sélection par antibiotique, en remplaçant le milieu par un milieu contenant l'antibiotique tous les deux à trois jours. Une fois confluentes dans la plaque à six puits, passez et étendez les cellules dans des flacons plus grands. Comme précédemment, remplacez le milieu par du milieu frais contenant les concentrations appropriées de GCV et d'antibiotique.Surveillez les cellules pour l'expression de la thymidine kinase et l'expression des ARNm par la viabilité cellulaire, puis étendez les cellules survivantes en présence de GCV et d'antibiotique. Ensuite, préparez l'ADN génomique à partir des cellules sélectionnées avec le GCV. Amplifiez par PCR les inserts sélectionnés du clonage à l'aide des amorces fournies dans le kit et sous-clonnez-les comme décrit dans le protocole écrit.Des réactions de séquençage peuvent ensuite être réalisées avec des amorces d'amplification. Dans une dernière étape, identifier les gènes cibles par alignement BLAST des séquences avec le transcrit humain pour les transcrits connus et le génome humain pour les transcrits nouveaux. Un simple construct d'expression mere 3 73 a été transfecté de façon stable dans la bibliothèque MC seven et sélectionné dans un milieu contenant du ganciclovir afin d'enrichir les cellules exprimant le mere 3 73 cible.Le GCV n'a aucun effet sur les cellules MCF sept sans biblioth&egrave;que, car elles n'expriment pas la thymidine kinase. En revanche, les cellules de la biblioth&egrave;que C sept expriment la thymidine kinase mais ne sont pas enti&egrave;rement tu&eacute;es par la ganciclovir &agrave; huit ou 16 micromolaires, comme le montrent les cellules vivantes qui incorporent le bleu brillant. Toutefois, les cellules de la biblioth&egrave;que cessent de cro&icirc;tre en pr&eacute;sence de GCV, comme en t&eacute;moigne la couleur du colorant rouge de ph&eacute;nol dans leur milieu.Les cellules arrêtées n'acidifient pas leur milieu et la couleur reste rougeâtre. Au lieu de passer à l'orange, les séquences cibles ont été isolées à partir des cellules survivantes. Amplifiées par PCR et séquencées.Près de 12 millions de lectures d'ADNc ont été obtenues, se cartographiant sur près de 12 000 gènes uniques. Parmi ces gènes uniques, 234 ont été considérés comme des recoupements fiables en raison de la fréquence des recoupements et étaient spécifiques au mere 3 73. Une comparaison initiale a révélé que 10 des gènes uniques identifiés avec la bibliothèque d'ID cible figurent également dans la liste des cibles mere 3 73 précédemment identifiées dans tar base.Par conséquent, ces 10 éléments sont probablement des cibles valables du simple 3 73 et sont actuellement en cours de caractérisation afin de valider expérimentalement les hits sélectionnés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la bibliothèque d'identification des gènes cibles pour réaliser un criblage à haut débit de tout le génome visant les gènes cibles de microARN.

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