Name: Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez l'édition de génome avec les nucléases à doigts de zinc CompoZr personnalisées pour créer des lignées cellulaires knockout. Cette méthode permet des modifications génétiques précises sans sélection.

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1. Processus de conception personnalisée ZFN <ol><li> Pour accélérer le processus de conception ZFN, un enquêteur doit fournir: </li><ul><li> Informations sur le gène cible telles que le nom du gène, espèce, et le gène de l'annotation / numéro d'identification. </li><li> Une clairement indiqué sur-tout l'objectif de l'expérience (par exemple, ou Knockout Knockin) </li><li> Tous les facteurs spécifiques de la cible du gène qui comprennent structure génique atypique, la biologie particulière impliqué dans le locus génétique, ou des régions homologues dans le reste du génome. </li><li> La plage spécifique de séquence d'ADN pour le doigt de zinc pour cibler nucléases. </li></ul><li> L'équipe de Sigma bioinformatique mène in silico ZFN conception pour développer des sites initiaux à doigts de zinc cibles. </li><li> Les premiers sites cibles ZFN sont fournis à un consultant technique et scientifique ZFN. Pour les projets plus complexes techniquement, ce scientifique Sigma travaille avec les enquêteurs de mettre au point la stratégie du projet. </li><li le sigma bioinformatique proc une analyse des algorithmes pour g zfn dans les conceptions silico. cela inclut recherche du entier hors-cible sites masquage de r et l snp chaque site cible potentiel.><li> Bioinformatique fournit les meilleurs sites cibles ZFN à l'enquêteur aux fins d'examen. Lors de l'approbation des sites potentiels cibles ZFN, cette information est fournie à l'équipe de production ZFN pour commencer le processus de fabrication ZFN. </li></ol> 2. Personnalisé de production ZFN <ol><li> L'archive Sigma de modules à doigt de zinc est utilisé pour assembler les modèles ZFN approuvés. </li><li> Chaque modèle est assemblé et ZFN séquence vérifiée sur une plate-forme de clonage à haut débit. </li><li> Une fois la production de tous les modèles ZFN est terminée, tous les ZFN est envoyé à la validation. </li></ol> 3. Validation des ZFNs personnalisés <ol><li> Des projets dans ZFNespèce humaine, la souris, de rat ou de CHO sont validés dans des lignées cellulaires bien caractérisées pour chaque espèce, un dosage à base de levure est utilisé pour d'autres organismes ou des types cellulaires. </li><li> Constructions ZFN sont livrés dans la lignée cellulaire appropriée par nucléofection et les ZFNs sont exprimés. </li><li> ADN est récolté à partir du pool de cellules transfectées ZFN et la région d'intérêt est amplifié par PCR. </li><li> Le Cel-1 test est ensuite effectué sur le produit de PCR. L'électrophorèse sur gel est exécuté sur le Cel-1 dosage de l'activité ZFN validé. </li><li> La conception plus forte activité ZFN tel que confirmé par le dosage Cel-1 est ensuite fourni au client. ZFNs sont livrés en ARNm et l'ADN plasmidique ainsi amorces de PCR pour l'essai Cel-1 et l'ADN génomique comme témoin positif. </li></ol> 4. La livraison des ZFNs validés par nucléofection <ol><li> Graine les cellules à une densité de 2x10 5 cellules par ml de la veille nucléofection. </li><li> Le jour de nucléofection,sortez portable Ligne Nucleofector Kit V et laisser tiédir à température ambiante. </li><li> Ajouter le supplément à la solution nucléofection V selon le protocole du fabricant. </li><li> Compter les cellules. Densité de cellules doit être compris entre 2,5-5x10 5 cellules par ml. </li><li> Remplir une plaque à 6 puits avec 2 ml de milieu dans chaque puits et pré-chaud dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C pendant au moins 20 minutes avant nucléofection. </li><li> Centrifuger 2x10 6 cellules par transfection (8x10 6 au total) au 200xg pendant 5 minutes. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 20 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). </li><li> Préparer des tubes expérimentaux: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique) </li><li> Retirer la plaque à 6 puits contenant les médias de l'étape (6.5) de l'incubateur. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 400 pi (100 pi / réaction) de la solution nucléofection V. </li><li> Un réactionnel à la fois, ajouter 100 pl de cellules à chaque ADN ou ARNm contenant du tube. Transfer le mélange à une électroporation 2 mm cuvette et sur une nucleofect Nucleofector avec le programme approprié. </li><li> Immédiatement après nucléofection de chaque échantillon, utiliser une pipette de transfert pour ajouter ~ 500 pi de milieu préchauffé de la plaque à 6 puits à l'étape (6,9) dans la cuvette. Puis, transférez les cellules de la cuvette au milieu restant préchauffé dans la plaque à 6 puits. </li><li> Terminer toutes les réactions et retourner la plaque à 6 puits à l'incubateur à CO 2 à 37 ° C. </li></ol> 5. La récolte d'ADN génomique après la livraison de ZFNs <ol><li> Des plaques 6 puits - ne pas récolter la totalité des cellules mises en commun. Il est important de maintenir la culture dans le but d'avoir des cellules à clone cellulaire de dilution simple une fois que vous confirmez que vous avez produits Cel-1 de digestion. Un à trois jours après nucléofection recueillir les cellules pour préparer l'ADN chromosomique utilisant le GenElute l'ADN génomique des mammifères Miniprep Kit. </li></ol> 6. Cel-1 Test <li> Amplifier par PCR de l'ADN génomique à partir des échantillons ZFN transfectées et l'ADN génomique de contrôle positif fourni dans le kit, en utilisant les amorces fournies. La réaction de PCR est mis en place avec les conditions suivantes: (voir tableau en Custom ZFN bulletin technique). </li><li> Pour générer des hétéroduplex homoduplexes PCR prendre 10 ul de la réaction PCR à partir de chaque échantillon ZFN traités ainsi que le contrôle et utiliser le programme suivant sur un thermocycleur: 95 ° C, 10 minutes 95 ° C à 85 ° C, -2 ° C / seconde 85 ° C à 25 ° C, -0,1 ° C / seconde 4 ° C, indéfiniment </li><li> Ajouter 1 ul de enhancer et 1 ul de nucléase S (à partir de 706 025 Numéro de catalogue Transgenomic) à chaque réaction et incuber à 42 ° C pendant 20-40 minutes. </li><li> Exécuter les digestions sur un 10% PAGE-TBE gel avec des marqueurs appropriés, tels que l'ADN Ladder DirectLoad WideRange (D7058 Numéro de catalogue) (voir les résultats dans le bulletin technique personnalisé ZFN). </li><li> SurCE signal positif a été détecté dans ZFN-traités par les populations cel-je test, procéder à l'isolement et la caractérisation des clones. </li> 7. Isolement et caractérisation de clones <ol><li> Une seule cellule clone les échantillons ZFN-traités par des méthodes standards, y compris FACS et le clonage de dilution. </li><li> Autoriser les clones se développer suffisamment, puis fractionnez une certaine proportion de cellules pour la récolte d'ADN génomique, le gel de retour le reste en tant que matériau en banque. </li><li> Amplifier l'ADN génomique des clones en utilisant les amorces Cel-I et d'analyser l'amplicon par Cel-je test (avec et sans ADN WT atteint un sommet en), ou encore utiliser cet amplicon de procéder directement au génotypage. </li><li> Clones candidats génotype identifié comme ayant des allèles édité par la méthode préférée. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Un exemple de l'ensemble du flux de travail CompoZr ZFN est présenté dans la Figure 2. ZFNs sont livréspour les cellules où ils se lient et coupent la séquence d'ADN appropriée qui crée une cassure double brin (DSB). Le processus naturel de réparation, non homologue (NHEJ extrémité de jonction), les réparations de l'ORD. Dans certains résultats aberrants dans les instances NHEJ suppression, insertion ou substitution de nucléotides. Amplification par PCR de la récolte des résultats d'ADN génomique dans la formation des hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés après la dénaturation / étape de recuit de la réaction de PCR. Ajout des résultats enzymatiques Cel-1 dans le clivage de toutes les molécules hétéroduplex. Cel-1 résultats sont résolus par l'analyse PAGE pour confirmer le clivage ZFN. La figure 3 présente un schéma de l'essai Cel-1 et les résultats escomptés. Représentant de CEL-1 résultats sont contenus dans les figures 4 et 5 la figure 4 contient les résultats d'une paire très actif de ZFNs (21%) dans les cellules K562;. Figure 5 contient les résultats d'une paire moins actif (2,4%) de ZFNs dansLes cellules K562. Activité ZFN est confirmée dans les deux chiffres par la présence de fragments de PCR deux sous le fragment parentale PCR. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. ZFNs Représentation des nucléases à doigt de zinc liés. Sont conçus protéines composées d'un doigt de zinc domaine liant l'ADN fusionné au domaine de clivage de l'endonucléase de restriction FokI. Lorsqu'il est lié comme un hétérodimère, ZFNs créer une cassure double brin à une séquence d'ADN d'utilisateur spécifié. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Schéma du workflow ZFN service personnalisé. Représentation graphique du workflow pour générer une lignée de cellules génétiquement modifiées à l'aide ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Schéma de l'essai Cel-1 et les résultats. A) ZFN plasmide o ARNm r est délivré à cellules. B) Exprimé bind ZFNs et couper leur séquence cible la création d'une pause double brin (DSB) dans une partie des cellules. C) la réparation aberrante de certains conseils scolaires de district par des non-homologue fin de rejoindre des résultats à l'insertion ou la suppression de nucléotides. D) l'ADN génomique est récolté à partir du pool de cellules transfectées et amplifié au niveau du locus d'intérêt. EF) produit de PCR est dénaturé et re-création de recuit formation d'hétéroduplex entre le type sauvage et les amplicons modifiés. G) Les résultats Cel-1 inadéquation endonucléase de dosage dans le clivage de molécules hétéroduplex. H) Cel-1 enzyme digère sont résolus par PAGE. Le ratio observé de produit de clivage à la bande parentérale, déterminée par logiciel ImageJ, indique la coupe de fraction et de l'efficacité des ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Cel-1 résulte de 21% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:._blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Cel-1 résulte de 2,4% ZFNs actifs logiciels ImageJ est disponible à l'adresse:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
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<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

Les chercheurs peuvent fournir des ZFN cellules ou animaux modifiés à des collaborateurs dans le cadre du Contrat de Licence de recherche standard. Dans cette circonstance Sigma demande qu&#39;un accord de transfert de matériel est mis en place entre Sigma, le client ZFN et leur collaborateur. Le permis de recherche peut être consulté à: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Si il ya un potentiel pour une application commerciale en utilisant des cellules modifiées ZFN Sigma demande alors qu&#39;une licence commerciale est mis en place. La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par la société Sigma, Inc

Une fois ZFN modifiés cellules sont isolés, ils ont permanente et héréditaire modifications de l&#39;ADN. Il en résulte la possibilité de générer des lignées cellulaires de façon stable ou animaux modifiés race avec des modifications génétiques souhaitées pour effectuer des recherches. CompoZr ZFNs personnalisés offrent une méthode robuste pour génome d&#39;édition dans une grande variété de types cellulaires. Publication du génome succès d&#39;édition avec ZFNs comprend mais ne se limite pas à des lignées cellulaires humaines, de souris, rat, poisson-zèbre, grenouille, porcine et des modèles de recherche CHO. 3,4,5,6,7,8,9 La possibilité de créer un double brin rupture au site cible désirée dans le type cellulaire déterminé est assurée lorsque les ZFNs sont correctement délivrés dans une cellule. Il est également possible d&#39;effectuer séquentielles modifications à doigts de zinc à une cellule afin d&#39;avoir plus d&#39;une modification génétique dans une cellule 10. La possibilité de sélectionner une séquence cible spécifique et ne modifient que locus particulier est une principale cause de la possibilité de créer plusieurs modifides cations. Le CompoZr personnalisé ZFN certificat d&#39;analyse est générée avec les réactifs très fournies dans le kit assurant ainsi que tous les composants du kit ont été soigneusement validé pour la réussite des clients. Les étapes critiques du flux de production du début à la fin sont présentées ci-dessous: Clonage cellulaire La capacité à isoler et à développer une lignée cellulaire donnée doivent être testés avant de commencer toutes les expériences ZFN. Les cellules individuelles doivent être isolés et élargi afin de s&#39;assurer que la population clonale dérivée est possible. Certaines lignées cellulaires sont récalcitrantes à ce sujet, et des astuces telles que l&#39;enrichissement des clones édités, ou de la culture avec les médias climatisées peuvent aider à surmonter ces défis. L&#39;efficacité de livraison Optimisation de l&#39;efficacité de livraison est un must avant la livraison des ZFNs. De nombreuses méthodes peuvent être utilisées, y compris à base de lipides transfection, l&#39;électroporation, et nucleofectile. La méthode de livraison idéal se compose d&#39;un mélange qui offre la plus optimale de l&#39;efficacité de livraison et la survie cellulaire. Quantification de ces gains d&#39;efficacité peuvent être estimées par la prestation d&#39;un contrôle GFP du plasmide et la quantification par inspection visuelle ou FACS 24-48h après l&#39;accouchement. Cel-je test Il est impératif que Cel-je dosage est effectué en parallèle avec les contrôles appropriés pour s&#39;assurer que les paramètres de la PCR, la digestion, et l&#39;électrophorèse ne pas interférer avec l&#39;interprétation de l&#39;expérience ZFN. Chaque kit comprend l&#39;ADN génomique de contrôle qui est utilisé pour créer l&#39;image Cel-I dans le certificat d&#39;analyse. Amplification de l&#39;ADN de contrôle avec les amorces fournies suivies par Cel-je test permettra à l&#39;utilisateur de comparer les résultats avec celles fournies dans le certificat d&#39;analyse (CA) d&#39;image, et d&#39;isoler les inefficacités potentielles dans cet aspect de l&#39;expérience. Un contrôle approprié négative comme une maquette, ou GFP traités celluleéchantillon doit également être inclus pour permettre l&#39;élucidation de tous les produits de clivage non-spécifiques. Qualitative / quantitative d&#39;analyse de la seule clones de cellules Après le traitement et le clonage ZFN seule cellule, les populations de cellules peuvent être criblés pour l&#39;édition au niveau du locus d&#39;intérêt par un certain nombre de méthodes. Cel-I dosage peut être effectuée sur l&#39;ADN génomique à partir de clones dans le but d&#39;identifier les clones candidats pour le génotypage en outre. Il est important de pic WT amplicon de PCR dans les amplicons échantillon à un rapport de 1:1 avant d&#39;effectuer la Cel-je digère comme homozygotes clones mutants sera contiennent des molécules homogènes, et donc donner un effet négatif Cel-I dosage résultat. Une méthode alternative pour le criblage de ces clones candidats est de concevoir un atterrissage d&#39;amorce de PCR directement sur le site cible ZFN. Utilisée en conjonction avec l&#39;une des amorces de contrôle, un résultat négatif signifie dosage perte de la séquence WT. Un clone hétérozygote contenant au moins un allèle WT va Yield signal PCR, mais peuvent être séparés à partir de clones WT pleinement en effectuant la PCR dans le cadre de SYBR qPCR. Une fois les clones candidats ont été identifiés par les méthodes ci-dessus, ils peuvent être génotypés par pyroséquençage standard, le séquençage de profondeur, ou d&#39;autres méthodes de séquençage. Pour toutes les méthodes de séquençage, un amplicon créé à partir de l&#39;ADN génomique des clones doit être généré. Pour allèles pyroséquençage traditionnels peuvent être séparés par TA-clonage du produit PCR et le séquençage des colonies individuelles. Pour des méthodes telles que le séquençage en profondeur cette étape n&#39;est pas nécessaire. Réparation homologie Réalisé (HDR) Ce protocole prévoit la méthode de knock-out de gène médié par l&#39;intermédiaire ZFN NHEJ. L&#39;intégration des transgènes peuvent également être réalisée par introduction d&#39;un plasmide donneur avec bras d&#39;homologie qui flanquent un site de coupe ZFN 11. Dans ce scénario, le ZFN créé double brin pause est réparé par HDR au lieu de NHEJ. HDR j&#39;ai réaliséntégration des transgènes peuvent être confirmés en utilisant des méthodes similaires aux procédures prévues dans ce protocole. Dépannage La livraison des ZFNs Livraison ZFN et d&#39;expression de livraison peut être contrôlée par la livraison d&#39;un GFP ou autre plasmide pour la visualisation et / ou la quantification. Faible niveau d&#39;expression pour cause d&#39;incompatibilité avec le promoteur type de cellule d&#39;intérêt peuvent être surmontés par la livraison de ZFNs au format ARNm. En outre, la méthode choc dû au froid peut être utilisé pour augmenter encore l&#39;efficacité de ZFNs dans les cellules. 12 Si l&#39;ARNm est utilisé, il est impératif que les cellules sont lavées avant la livraison pour s&#39;assurer que tous Rnases sérum dérivés ont été supprimés. Il est également prudent de dégeler l&#39;ARNm sur la glace, et ajouter le il aux cellules à la dernière minute afin de minimiser tout risque de dégradation. Cel-je test La fondation de l&#39;assa-Cel Iy est égal à une amplification spécifique et un grand du locus d&#39;intérêt. Si les produits d&#39;amplification non spécifiques sont observées utiliser la PCR standard les procédures de dépannage pour accroître la spécificité tels que l&#39;optimisation de la quantité de modèle, la concentration d&#39;amorce, et le cyclisme paramètres. Effectuer une analyse PAGE, par opposition à d&#39;agarose électrophorèse standard comme cette dernière méthode ne fournit pas la résolution et de sensibilité. Cel-I conditions de digestion peuvent également être optimisés si aucun produit digéré ou de traînées excessive est observée. Le titrage de la quantité de Cel-1 nucléase et / ou la durée de la digestion peuvent être titrés afin d&#39;améliorer ces aspects.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Nucléase S (Cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Cellule Ligne Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP exemptes d&#39;endotoxines Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

génome édition avec des nucléases personnalisés compozr doigt de zinc (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Génome édition est une technique puissante qui peut être utilisé pour élucider la fonction des gènes et de la base génétique de la maladie. Gène traditionnel édition méthodes telles que la chimie basée sur la mutagenèse aléatoire ou l&#39;intégration de séquences d&#39;ADN confère changements aveugles génétiques d&#39;une manière globalement inefficace et nécessite l&#39;incorporation de séquences synthétiques ou indésirables d&#39;utiliser des conditions de culture aberrants, peut prêter à confusion étude biologique. En revanche, l&#39;expression transitoire ZFN dans une cellule peut faciliter précise, héréditaires édition du gène d&#39;une manière très efficace sans la nécessité pour l&#39;administration de produits chimiques ou d&#39;intégration de transgènes synthétiques. Nucléases à doigt de zinc (ZFNs) sont des enzymes qui se lient et couper des séquences distinctes de l&#39;ADN double brin (ADNdb). Une fonctionnelle CompoZr ZFN unité se compose de deux protéines individuelles monomères qui lient l&#39;ADN &quot;demi-site» d&#39;environ 15-18 nucléotides (voir Figure 1). Lorsque deux ZFN monoMers &quot;maison&quot; à leurs sites cibles adjacents les domaines d&#39;ADN clivage dimériser et de créer une cassure double brin (CDB) dans l&#39;ADN. 1 Introduction de ZFN médiation CDB dans le génome établit une fondation pour l&#39;édition du génome très efficace. Réparation imparfaite de CDB dans une cellule par le biais du non-homologue de fin d&#39;assemblage (NHEJ) voie réparation de l&#39;ADN peut entraîner de petites insertions et suppressions (indels). Création d&#39;indels dans la séquence du gène codant d&#39;une cellule peut se traduire par décalage du cadre et suite à élimination directe fonctionnelle d&#39;un locus du gène à haut rendement. 2 Bien que ce protocole décrit l&#39;utilisation de ZFNs pour créer une inactivation du gène, l&#39;intégration des transgènes peuvent également être effectuées par l&#39;intermédiaire homologie dirigée réparation sur le site de coupe ZFN. Le CompoZr personnalisé ZFN service représente une approche systématique, globale et bien caractérisé à l&#39;édition gène ciblé pour la communauté scientifique avec la technologie ZFN. Scientifiques Sigma travailler en étroite collaboration avec les enquêteurs à 1) perform analyse de diligence raisonnable, y compris l&#39;analyse de la structure des gènes pertinents, la biologie, et un système de modèle conformément aux objectifs du projet, 2) appliquer cette connaissance pour développer une bonne stratégie de ciblage, 3), puis la conception, la construction, et fonctionnellement valider ZFNs pour l&#39;activité d&#39;une manière pertinente lignée cellulaire. L&#39;enquêteur reçoit positif ADN génomique de contrôle et des amorces, et prêt-à-utiliser les réactifs ZFN fournis à la fois dans l&#39;ADN plasmidique et le format in-vitro l&#39;ARNm transcrit. Ces réactifs peuvent ensuite être livrés pour l&#39;expression transitoire dans une lignée cellulaire de l&#39;enquêteur ou le type de cellule de choix. Les échantillons sont ensuite testés pour l&#39;édition au niveau du locus du gène d&#39;intérêt par des techniques classiques de biologie moléculaire, y compris l&#39;amplification par PCR, digestion enzymatique, et l&#39;électrophorèse. Après signal positif pour le montage du gène est détectée dans la population initiale, les cellules sont des cellules clonées seule et génotypés pour l&#39;identification de clones mutants ou allèles.

Le CompoZr personnalisé à doigt de zinc nucléase (ZFN) permet la fonction d&#39;édition génome précis dans un organisme ou lignée cellulaire à tout lieu défini par l&#39;utilisateur. Cet article décrit le processus pour la conception, la fabrication, la validation et la mise en œuvre du Service CompoZr personnalisé ZFN.

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

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L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une nucléase modifiée artificiellement à doigts de zinc, ou ZFN, afin d'induire une mutation perturbatrice à un locus spécifique pour aboutir à la création d'une lignée cellulaire invalidée. Cela est réalisé en analysant d'abord la séquence d'ADN du gène cible à l'aide de l'algorithme Composer afin de générer des conceptions de ZFN insco. Les ZFN sont ensuite assemblées, introduites dans les cellules par transfection nucléaire et analysées pour évaluer leur activité au niveau de leurs sites cibles respectifs afin de produire une lignée cellulaire invalidée.Le type cellulaire d'intérêt est d'abord traité avec une ZFN active. Ensuite, cette population est isolée en cellules uniques. Enfin, ces populations clonales sont agrandies pour une caractérisation génotypique supplémentaire. Les clones présentant des événements perturbateurs non homologues et de jonction au site cible peuvent être étudiés plus en détail dans le cadre d'un knockout génique fonctionnel.En fin de compte, la caractérisation génétique, incluant le test cellulaire unique et le séquençage de l'ADN, est nécessaire pour confirmer les modifications observées du phénotype cellulaire résultant d'une modification génétique médiée par des ZFN. Le principal avantage des nucléases à doigts de zinc par rapport aux méthodes existantes, telles que la recombinaison homologue traditionnelle, réside dans le fait que les ZFN permettent une édition génique. Cette dernière permet aux chercheurs de réaliser des modifications génétiques spécifiques et prévisibles sans sélection.Cela inclut les invalidations géniques, les modifications géniques et les intégrations géniques. Le processus de conception des nucléases à doigts de zinc commence par des études bioinformatiques simplifiées, qui visent à identifier des régions uniques de séquence contenant un nombre et une qualité suffisants de motifs de liaison des doigts de zinc propices à la réalisation d'une invalidation génique. Une stratégie expérimentale clairement définie facilitera grandement ce processus, tout comme les informations concernant le gène cible, telles que la structure atypique du gène, la biologie particulière associée au locus génétique et toute région homologue présente ailleurs dans le génome.Pour les projets plus complexes, un scientifique Sigma collaborera étroitement avec les chercheurs. Les Z fns sont conçus in silico et les sites hors cible sur l'ensemble du génome sont prédits. Un masquage des répétitions et une analyse de coupure (snip analysis) sont également réalisés pour chaque site cible potentiel de ZFN.Les sites cibles ZFN les plus pertinents sont examinés avant la production des ZFN. Les chercheurs demandent souvent : les ZFN fonctionneront-ils pour mon projet ? Pour répondre au mieux à cette question, nous devons prendre en compte plusieurs considérations essentielles.Pouvez-vous transfecter efficacement et exprimer un cassette d'expression typique dans votre type cellulaire d'intérêt ? Pouvez-vous isoler puis agrandir des clones monocellulaires ? Et enfin, existe-t-il un impact délétère sur la croissance cellulaire ou la viabilité cellulaire suite à l'invalidation de votre gène d'intérêt ?Les réponses à ces questions peuvent ou non dicter strictement la faisabilité d'un projet. Toutefois, elles nous permettent d'évaluer la facilité ou la difficulté potentielle d'un projet particulier, ou peuvent mettre en lumière des aspects spécifiques du flux de travail qui sont essentiels au succès. Sigma utilise son archive de modules à doigts de zinc pour assembler les conceptions approuvées de ZFN.Chaque conception de ZFN est assemblée et la séquence est vérifiée sur une plateforme de clonage à haut débit. Ensuite, les ZFN sont livrés sous forme d'ADN plasmidique à la lignée cellulaire bien caractérisée correspondante et s'expriment suffisamment en 24 à 48 heures. L'ADN génomique est alors extrait de chaque pool de cellules traitées aux ZFN, suivi d'une amplification par PCR du site cible des ZFN.Un test sur cellule unique est réalisé sur les produits de PCR, et les activités des ZFN sont évaluées par électrophorèse sur gel. La conception de ZFN présentant l'activité la plus élevée est fournie. En outre, de l'ADN génomique servant de contrôle positif est fourni, ainsi que des amorces de PCR pour reproduire les résultats indiqués dans le certificat d'analyse.Pour commencer votre expérience avec les ZFN, commencez par ensemencer les cellules à une densité de 200 000 cellules par millilitre le jour précédant leur transfection nucléaire. Le jour suivant, comptez les cellules et poursuivez. Si leur densité se situe entre 250 000 et 500 000 cellules par millilitre, préparez la solution de transfection nucléaire V pour la lignée cellulaire avec laquelle vous travaillez, conformément au protocole du fabricant.Remplissez maintenant une plaque de six puits avec deux millilitres de milieu par puits et faites réchauffer la plaque dans un incubateur pendant au moins 20 minutes, tout en réchauffant la centrifugeuse. Prélevez 2 millions de cellules par nucléofection. Éliminez le surnageant et resuspendez délicatement les cellules dans 10 millilitres de HBSS. Répétez ensuite la procédure de lavage une ou deux fois supplémentaires. Les ZF NS délivrés sous forme d'ARNm produisent généralement des fréquences d'édition génique plus élevées que les mêmes ZF NS délivrés sous forme d'ADN plasmidique.Cependant, la livraison de ZF NS sous forme d'ARNm exige que nous prenions quelques précautions supplémentaires pour éviter sa dégradation. Tout d'abord, lavez vos cellules avec deux à trois grands volumes de PBS ou de HBSS afin d'éliminer les ARN provenant du sérum. En outre, conservez toujours votre ARNm sur de la glace pendant toute la durée de l'expérience.Enfin, veillez à ajouter l'ARNm à vos cellules au tout dernier moment possible afin d'éviter sa dégradation. Ensuite, préparez les tubes expérimentaux conformément au tableau figurant dans la notice technique personnalisée sur les ZFN. Pour chaque transfection, remettez en suspension les cellules dans 100 microlitres de solution de nucléofection V, en préparant une réaction à la fois.Ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque tube contenant de l'ADN ou de l'ARNm. Ensuite, transférer chaque mélange dans une électroporation de deux millimètres. Qve et nucle affectent les cellules avec le programme approprié immédiatement après l'affection nucle de chaque échantillon.Utilisez une pipette de transfert pour ajouter un demi-millilitre de milieu réchauffé à partir d'un puits de la plaque préparée à six puits. Transférez soigneusement les cellules du qve vers le milieu restant. Terminez toutes les réactions dans ce puits et replacez la plaque dans l'incubateur pendant un à trois jours.Après l'atteinte du noyau, isoler l'ADN génomique à l'aide du kit mini prep d'ADN génomique mammalien genal loop, sans récolter l'ensemble des cellules regroupées. Ensuite, utiliser les amorces fournies pour effectuer une PCR. Amplifier l'ADN génomique provenant des échantillons transfectés avec ZFN et de l'ADN génomique témoin positif fourni dans le kit.Digérez chaque produit PCR avec un microlitre d'activateur et un microlitre de nucléase s. Incubez à 42 degrés Celsius pendant 20 à 40 minutes. Ensuite, réalisez les digestions sur un gel TBE 10 % PAGE avec des marqueurs appropriés, tels qu'un marqueur d'ADN à large gamme prêt à l'emploi, après avoir effectué le clonage de cellules uniques des échantillons traités par ZFN et avoir permis aux clones de suffisamment s'étendre.Récupérez une partie des cellules pour l'ADN génomique, poursuivez la culture des cellules restantes ou congélez-les comme matériel de réserve. Amplifiez l'ADN génomique à l'aide des amorces cell one et analysez le produit par test cell one, avec et sans ajout d'amplicon de type sauvage dans un rapport un pour un. En alternative, utilisez cet amplicon pour passer directement au génotypage des clones candidats par séquençage ou toute autre méthode choisie.Dans cet exemple, le test cell one a été utilisé pour estimer l'activité d'une paire de cellules ZF NS et K 5 62. La bande glan représente le témoin positif et la bande Z montre les produits coupés, à partir desquels la fréquence des fragments d'AMP appariés est estimée ; à partir de ces données, l'estimation de l'activité de ZF N s'élève à 21 %, ce qui est très élevé. Nous montrons ici l'activité d'une autre paire de Z fns.Cette paire de ZFN était nettement moins active que l'autre, mais tout de même efficace. On estime qu'elle a produit des indels dans 2,4 % de la population cellulaire. Certains paramètres plus critiques concernant l'utilisation de ZF X incluent l'optimisation de la livraison et de l'expression dans votre type cellulaire.En optimisant ces paramètres, on peut réduire considérablement le temps et les efforts nécessaires pour isoler l'invalidation génique. Les clones Z fns constituent un outil très précis d'édition ciblée du génome lorsqu'ils sont utilisés correctement et dans le contexte approprié. Ils peuvent offrir aux scientifiques un moyen très rapide et efficace pour étudier la biologie de presque tout produit génique ou voie métabolique.

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