Name: LentiPlex MISSION dépistage sur mélange dBibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez le criblage LentiPlex MISSION avec une bibliothèque shRNA génomique complète dans des cellules de mammifères. Cette méthode permet d'identifier rapidement les gènes impliqués dans la survie cellulaire et la cytotoxicité tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MISSION est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP LentiPlex est une marque de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

Configuration de l'écran LentiPlex Pooled Pour identifier des séquences shRNA d'intérêt, il est essentiel de mettre en place l'écran de telle sorte que la majorité des cellules ne reçoivent qu'une seule shRNA construire. En utilisant une faible MOI (multiplicité d'infection), la probabilité d'intégrants multiples par cellule est grandement diminué. Cependant, l'efficacité de transduction, et donc MOI désiré, dépendent fortement du type de cellule cible. Par conséquent, il est impératif que la détermination de la MOI optimale est effectué avant de commencer l'écran dans un type cellulaire nouvelle. 1. Transduction des cellules cibles avec la mission LentiPlex Pooled shRNA Bibliothèque <ol><li> La réelle MOI utilisée varie en fonction des différents types cellulaires. Si désiré, puis répétitions sont le nombre de plaques doit être augmenté en conséquence. De plus, généralement il ne sera pas avantageux de combiner les sous-pools différents. Garder le sous-pools distincts seront une aide dans le processus de déconvolution. Assurez-vous proper étiquetage de chaque plat culture tissulaire avec le nombre sous-pool qui est appliquée lors de la transduction. Un peu MOI est conseillé de réduire la probabilité d'intégrants multiples par cellule. </li><li> Jour 1 - Seed le nombre approprié de 60 mm de plats avec suffisamment de cellules pour obtenir environ 70% de confluence le jour suivant (10 piscines au total, chacun réalisés en triple = 30 plats au total). Pour notre étude, boîtes de 60 mm ont été ensemencées avec 6 x 105 cellules A549 pour atteindre un confluence de 70% avant de transduction. Cela garantit que les cellules sont encore en phase de croissance exponentielle. Les taux de croissance varient selon le type de cellules et doit être déterminé avant de commencer l'écran. </li><li> Permettent aux cellules d'adhérer par une nuit d'incubation à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO 2. </li><li> (Facultatif) Inclure deux autres de 60 mm plats pour la transduction des shRNA contrôle négatif. Étiquette les plats "Contrôle A" pour SHC001H et "Control B» pour SHC002H. </li><li> Jour 2 - ème transduirecellules e avec les particules virales LentiPlex. Le jour de la transduction, le dégel des particules lentiviraux sur la glace. </li><li> Transfert des particules décongelés à une hotte à flux laminaire et de garder sur la glace si elle n'est pas utilisée immédiatement. </li><li> Calculez combien de chacun des sous-virale piscine d'ajouter aux cellules pour obtenir le MOI de 1 dans toutes les boîtes de culture cellulaire. <ol><li> Exemple: 1 x 10 6 cellules / boîte; titre viral = 5 x 10 8 TU / ml; une MOI de 1 désiré. i.) 1 x 10 6 cellules / boîte x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unités de transduction (TU) nécessaires ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtenue à partir du C A = 2 pi de solution stock lentiviraux devrait être ajouté à l'antenne appropriée. Diluer le montant calculé du virus à raison de 100-300 ul de milieu complet afin d'assurer une meilleure répartition du virus lorsqu'il est ajouté à la boîte de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Retirez le support à partir des cellules pré-ensemencés. Ajouter complète des médias ContaMINIER solution de bromure hexadiméthrine à chaque plat. La concentration finale recommandée de bromure hexadiméthrine dans les médias est de 8 pg / ml. Utilisez moins de bromure de hexadiméthrine si vous trouvez qu'il soit toxique pour les cellules de votre cible. </li><li> Ajouter particules shRNA Lentiviral aux plats appropriés conformément à la conception prédéterminé expérimental. Mélanger délicatement les plaques pour répartir uniformément le virus à travers les cellules. </li><li> Incuber 18-20 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié dans une atmosphère de 5% de CO 2. </li><li> (Facultatif) Répétez 3-8 à l'identique avec MOI SHC001H (vide vecteur de shRNA Control) dans un plat de contrôle A et SHC002H (brouillés shRNA contrôle) dans un plat de contrôle B. Traiter ces plats à l'identique aux plats expérimentaux durant l'expérience. </li><li> Jour 3 - Changer les médias. Aspirer contenant le virus des médias et ajouter Fresh Media complète (sans bromure hexadiméthrine). Incuber les cellules à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol> 2. Traiter plaquéscellules avec composante thérapeutique / réactif <ol><li> Jour 4 - Aspirer les médias à partir des puits et ajouter milieu frais contenant composante thérapeutique à la concentration optimale. Comme avec les conditions de culture, les traitements varient et les concentrations et les durées appropriées doivent être déterminées au préalable. Dans notre étude, nous avons utilisé 100 ng / mL de TRAIL et 1 uM de Paclitaxel. Les cellules ont été traitées pendant 48 heures. </li><li> Cellules survivantes devraient être ré-ensemencées dans des flacons T75 et a permis d'étendre jusqu'à près de 100% de confluence. </li><li> (Facultatif) A la fin de la sélection, inspecter contrôle vaisselle A et B. Contrôle vaisselle vaisselle A et B de chaque plat doit avoir moins de colonies que au moins un des plats les bibliothèques mises en commun. S'il ya un nombre étonnamment élevé de colonies dans un plat, que ce soit le processus de transduction a affecté une voie liée au phénotype désiré ou la pression sélective n'est pas suffisamment forte et ré-optimisation de l'essai peut être nécessaire. Si B plat contient trop de colonies, Alors l'expression de shRNA et l'engagement de la voie de l'ARNi peut avoir un effet sur le phénotype d'intérêt. Si c'est le cas avec SHC001H répéter, afin de s'assurer que l'effet n'est pas spécifique à SHC002H. </li></ol> 3. Déconvolution d'une population cellulaire polyclonale <ol><li> Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d'isoler l'ADN génomique. Dans notre essai, les cellules ont été lavées brièvement dans du PBS et la trypsine avant d'ADN génomique a été isolé en utilisant la génomique des mammifères GenElute Miniprep kit et fourni protocole (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativement, d'autres kits de purification toute génomiques qui sont actuellement disponibles sur le marché peuvent être utilisés pour l'isolation d'ADN. Il est important de suivre les recommandations du protocole pour le montant de départ de cellules cultivées. </li><li> L'amplification par PCR de cibles. La procédure de récupération shRNA modèle permet l'amplification de l'ensemble du pool d'inserts shRNA de la population de cellules sélectionnées, ou pour la récupération des indideux modèles de shRNA de colonies ont été individuellement pris et élargi. Après amplification d'encarts shRNA du contrôle et de cellules cibles sélectionnées, les produits de PCR peut être séquencé. </li><li> Cette étape d'amplification PCR a été optimisé en utilisant Sigma Readymix, Catalogue n ° P2893. D'autres réactifs peuvent être utilisés pour l'amplification, mais les conditions du vélo et / ou la concentration de magnésium peut être nécessaire de modifier pour l'amplification réussie. Amorces d'amplification à la concentration 20 mM sont inclus avec le kit LentiPlex. </li><li> Mettre en place la réaction PCR comme décrit dans le tableau 1. Ajoutez les composants dans l'ordre indiqué. Les montants sont décrits pour une réaction de 50 ul. Pour plus de réactions, de l'échelle des composants master mix par le nombre souhaité de réactions et notamment surconsommation de 10%. Le montant de la matrice d'ADN recommandée est de 50-100 ng. </li><li> Il est fortement recommandé que pour une réaction du modèle se compose de la MISSION shRNA Vector Control humain positif dilué au approprIATE concentration. Amplification réussie avec ce modèle indique que les composants PCR et les conditions du vélo sont adéquates. REMARQUE: Pour éviter des contaminations croisées des échantillons expérimentaux et des réactifs, il est suggéré que le témoin positif peut être diluée dans un endroit séparé de l'endroit où ultérieures réactions de PCR sont mis en place. </li><li> Enregistrer le programme PCR énumérés dans le tableau 2 dans votre thermocycleur. </li><li> Pour chaque échantillon, mélanger réaction 3 uL PCR avec 1 ul de colorant et électrophorèse côtés 5 pi de DirectLoad ™ PCR de 100 bp Ladder bas, D3687 Numéro de catalogue sur un gel à 1% d'agarose pour confirmer la présence d'un amplicon 309 pb. </li><li> Sous-clonage des amplicons PCR: Les produits de PCR ont été clonés TOPO utilisant le kit de clonage TOPO-TA, après le protocole du fabricant (Invitrogen, K4575-01). Le résultat est que l'on produit de PCR est contenue dans chaque vecteur. </li><li> 250 colonies bactériennes individuelles (contenant chacun un individu amplicon de PCR) ont été isolés et grandirn dans 2 ml de cultures de LB avec 100 mg / ml d'ampicilline. L'ADN plasmidique a ensuite été extrait en utilisant la GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Purifié ADN plasmidique a été digéré par EcoRI et électrophorèse pour confirmer la présence de l'insert. </li><li> Les échantillons d'ADN plasmidique ont ensuite été séquencés et l'insert de shRNA identifiées en utilisant la séquence shRNA LentiPlex Recherche base de données fournie avec la bibliothèque LentiPlex. </li></ol> 4. Identification de la cible et la validation <ol><li> La séquence shRNA initie avec 5'-GAAACACCGG-3 '. Saisissez au moins les 10 prochaines, mais moins de 21 nucléotides que la séquence requête dans le champ de recherche sur la séquence ci-jointe shRNA Recherche base de données Access. </li><li> Sélectionner les espèces du shRNA commun. En option, sélectionnez le sous-pool à partir duquel la séquence a été trouvée. </li><li> Maintenant, cliquez sur «Trouver tubes potentiels" pour effectuer la recherche. Cela devrait identifier les correspondants TRC shRNA de séquence (s) qui correspondent èmee séquençage des données. Plus d'informations sur la séquence shRNA TRC (s) identifié et les objectifs gène correspondant peut être facilement trouvé chez Sigma-Aldrich votre gène favoris: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Gènes cibles identifiés devraient être validées en répétant le test de dépistage d'origine avec le clone original TRC et au moins deux shRNA supplémentaires qui ciblent le même gène en utilisant un shRNA 1-1 format bien. Frappe True afficher le même phénotype dans la majorité des puits. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple d'un workflow d'écran LentiPlex groupée est détaillé dans la Figure 1. Cellules transduites qui ont proliféré dans la présence de TRAIL et Paclitaxel ont été autorisés à étendre jusqu'au flacons sont confluentes. L'ADN génomique a été récoltée et soumise à l'amplification par PCR et le clonage, comme illustré dans la figure 1 A, avant d'être soumis pour l'identification et le séquençage shRNA comme décrit dans Figure 1 C 250 clones ont été séquencés, de ces 25 étaient représentés par des clones multiples et les 225 restants ont été représentés par seulement 1 clone et n'ont pas été poursuivies à ce moment. Comme le montre la figure 2, plusieurs gènes candidats dont TBX3, PPP2CA et AKT2 étaient représentés par des clones multiples. Le facteur de transcription T-box, TBX3 apparu dans un total de quatre clones et a été impliquée dans la migration tumorale 5. Downregulation PPP2CA a été démontré pour maintenir la croissance des cellules LNCaP cultivées dans des conditions déficientes androgènes en soulageant le blocage androgénique induite par arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose prévention 6. AKT2 est une sérine-bêta CAR / thréonine protéine kinase-oncogène et putatifs démontré à jouer plusieurs rôles dans le cancer de développement 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> * Concentration finale de Mg 2 + en solution va être de 3 mm;1,5 mm est versé du Readymix Taq et 1,5 mm de la solution de chlorure de magnésium. Tableau 1. Conditions Lentiplex réaction PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tableau 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 2"> Tableau 2. Lentiplex Programme d'amplification par PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figure 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figure 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figure 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1c"> Figure 1. (A) LentiPlex regroupés écran, (B) workflow déconvolution polyclonaux, et (C) l'identification des cibles shRNA. LentiPlex A. regroupés écran. Abord, les cellules de semence, puis ajouter sous-pools shRNA, (10 piscines au total, chacune réalisée en trois exemplaires, pour les 30 plats au total). Ensuite, traiter avec composante thérapeutique / réactif (dans notre cas, TRAIL et Paclitaxel, respectivement). Puis, réensemencer les cellules survivantes dans des fioles et permettent de se développer. Récolte de la population hétérogène de cellules de chaque sous-pool et d'isoler l'ADN génomique. B. déconvolution polyclonaux. Effectuer la PCR pour amplifier l'ADN contenant l'insert de shRNA. Le produit de PCR est de taille uniforme, mais polyclonaux en séquence depuis l'ADNg modèle a également été polyclonaux. Produit de PCR est cloné dans le vecteur et ensuite transformés dans des bactéries compétentes. C. Identification de cibles shRNA. Colonies individuelles sont isolées et l'ADN plasmidique est extrait. Chaque clone contient le vecteur de clonage avec un fragment de PCR individuels. L'ADN plasmidique est digéré pour confirmer la présence de l'insert et séquencé. L'insert de shRNA est identifié en utilisant le shRNA LentiPlex Recherche de séquence en base. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Identifiés peuventLes gènes didate. 25 gènes candidats ont été identifiés qui avait de multiples coups. 225 gènes candidats avaient seulement 1 coup et n'ont pas été poursuivies. S'il vous plaît voir le tableau 1 pour une ventilation supplémentaire des clones individuels par gène candidat. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> 1 Tableau complémentaire. Individuels TRC clones identifiés à partir de la bibliothèque ID séquençage des gènes polyclonaux Clics clones détectés.

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sagou, et John Swarthout sont employés par Sigma-Aldrich, ce qui rend les outils et les réactifs utilisés dans cet article.

Dans cette étude, nous présentons un écran l&#39;échelle du génome pour identifier les gènes impliqués dans la cytotoxicité des cellules A549 après le paclitaxel / TRAIL traitement. L&#39;utilisation d&#39;une approche groupée dans un écran à l&#39;échelle du génome réduit le temps, de coût et d&#39;investissement d&#39;équipement normalement associées aux écrans conventionnels vêtu. Essentiel à la réussite de l&#39;écran sont des expériences d&#39;optimisation effectué au préalable. Conditions de transduction et MOI doit être déterminée empiriquement. La méthode de sélection doit permettre une sélection robuste de cellules présentant le phénotype souhaité (par exemple, la survie, l&#39;expression des protéines de surface, etc.) L&#39;optimisation de ces paramètres permettra de réduire le nombre de faux positifs détectés. Ici, ADNg a été récolté auprès de la population majeure partie des cellules sélectionnées, puis cloné à identifier TOPO inserts shRNA individuels. Une amélioration possible pour cette expérience aurait été de sélectionner pour les cellules vivantes en utilisant FACS pour assurerque seules les cellules vivantes sont collectées. Les cibles identifiées seront validés par transduction avec l&#39;objectif spécifique des shRNA dans un test de dépistage. Frappe True afficher le phénotype dans la majorité des puits. La Bibliothèque LentiPlex Pooled est souple dans son application. Il est compatible avec un large éventail d&#39;applications en aval et peut être utilisé avec des stratégies de sélection positive ou négative. Selon les conditions de dépistage, déconvolution des inserts shRNA est accompli par PCR / clonage, puces à ADN, ou séquençage de nouvelle génération 9, 10. Alors que la puissance et la vitesse de ces techniques pour déconvoluer écrans ARNi est bien établie, un souci de puces à ADN et la prochaine génération de méthodes de séquençage est la disponibilité des ressources bio-informatique et les connaissances nécessaires pour analyser et interpréter correctement les résultats expérimentaux. Les coûts associés à ces techniques peuvent souvent être un obstacle à la réalisation d&#39;écrans échelle du génome entier. APCR / clonage approche basée, tout en n&#39;étant pas aussi puissant que les microréseaux et de séquençage de nouvelle génération est une alternative rentable et inférieure. Agilent propose maintenant un tableau personnalisé basé sur la librairie shRNA TRC d&#39;une aide supplémentaire dans les écrans LentiPlex. Ces options permettent aux chercheurs d&#39;utiliser LentiPlex pour étudier un large éventail de fonctions cellulaires.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Tableau LentiPlex Pooled</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Cellules A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = fr &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = Spec &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> TOPO TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>% ONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = Spec &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute kit Plasmid Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadiméthrine bromure de</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

lentiplex mission dépistage sur mélange d&#39;bibliothèque shrna dans les cellules de mammifères

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

L&#39;interférence ARN (ARNi) est un mécanisme intrinsèque cellulaire pour la régulation de l&#39;expression génique. Exploiter la puissance innée de ce système nous permet d&#39;inactivation génique niveaux d&#39;expression de la perte d&#39;études de la fonction des gènes. Il existe deux méthodes principales pour effectuer l&#39;ARNi. La première est l&#39;utilisation de petits ARN interférents (siRNA) qui sont synthétisés chimiquement, et la seconde utilise des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) encodé dans une plasmides. Ces derniers peuvent être transfectés dans des cellules directement ou emballés dans des particules réplication incompétents lentiviraux. Les principaux avantages de l&#39;utilisation de shRNA lentiviraux est la facilité d&#39;introduction dans une grande variété de types de cellules, de leur capacité à intégrer de façon stable dans le génome des gènes knockdown terme de temps et de sélection, et leur efficacité dans la conduite de haut débit de perte d&#39;écrans de fonction. Pour faciliter cela, nous avons créé la librairie shRNA LentiPlex commun. Le SIGLentiPlex SION homme shRNA Bibliothèque Pooled est une piscine à l&#39;échelle du génome lentiviral produites en utilisant un procédé exclusif. La bibliothèque se compose de plus de 75.000 constructions de shRNA de la collection TRC ciblant 15 000 gènes humains + 2. Chaque bibliothèque est testé pour la représentation des shRNA avant la sortie de produits pour assurer une couverture bibliothèque robuste. La bibliothèque est fournie dans un format prêt à utiliser lentiviraux à des titres d&#39;au moins 5 x 10 8 TU / ml par dosage de p24 et est pré-divisée en dix sous-pools d&#39;environ 8000 shRNA construit chacun. Amorces d&#39;amplification et de séquençage sont également fournis pour l&#39;identification des cibles en aval. Des études antérieures établi une activité antitumorale synergique de TRAIL lorsqu&#39;il est combiné avec le paclitaxel dans les cellules A549, une ligne de poumon humain carcinome 3, 4. Dans cette étude, nous démontrons l&#39;application d&#39;une bibliothèque LentiPlex shRNA regroupées pour procéder rapidement à des un écran de sélection positive pour les gènes impliqués dans la cytotoxicité of cellules A549 lorsqu&#39;ils sont exposés à TRAIL et Paclitaxel. Un obstacle souvent rencontré avec des écrans à haut débit est le coût et la difficulté de déconvolution; nous avons aussi en détail une approche rentable polyclonaux utilisant le séquençage traditionnel.

Ici, nous utilisons une bibliothèque LentiPlex humains mis en commun et des méthodes de séquençage d&#39;traditionnelle identifier les gènes cibles de promouvoir la survie cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et de déconvoluer un écran LentiPlex et valider les résultats.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d&#39;Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

L'interférence ARN (ARNi) est un mécanisme cellulaire intrinsèque de régulation de l'expression génique. L'exploitation de la puissance innée de ce système nous permet de...

L'objectif général de la vidéo suivante est de démontrer l'utilisation d'une bibliothèque d'ARN court en épingle à ADN génomique complet, ou ARNip, pour réaliser rapidement un criblage par sélection positive. Ceci est réalisé par la transduction des cellules cibles avec 10 sous-pools de la bibliothèque Mission LentiPlex, composée d'ARNip ciblant l'ensemble du génome, suivie de l'ajout du composant thérapeutique. Dans une deuxième étape, le matériel matrice d'ARNi est récupéré, ce qui permet la déconvolution du criblage en pool.L'ARNh-S-R-N-A récupéré est ensuite cloné dans le vecteur et transformé dans des bactéries compétentes. Ensuite, des échantillons d'ADN plasmidique sont séquencés et les cibles d'ARNh-S-R-N-A sont identifiées à l'aide de la base de données de recherche de séquences lenti PLX, HRNA. Les résultats de l'expérience réalisée dans cette vidéo révèlent les gènes impliqués dans la cytotoxicité d'une lignée cellulaire tumorale épithéliale lorsqu'elle est exposée à des agents pharmacologiques anti-tumoraux, en fonction du nombre de lectures de séquençage obtenues.Lin Duplex en pool. La bibliothèque HRNA contient le consortium RNAi ou la collection TRC répartie dans 10 tubes matriciels et peut être utilisée pour réaliser rapidement des études à haut débit sur la perte de fonction génique. Dans cette étude, elle est utilisée pour effectuer rapidement un criblage par sélection positive afin d'identifier les gènes impliqués dans la cytotoxicité des cellules 5 49 lorsqu'elles sont exposées au trail et au paclitaxel, avant la transduction des cellules cibles.Plaquez le nombre approprié de boîtes de 60 millimètres avec suffisamment de cellules pour obtenir environ 70 % de confluence le jour suivant. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Les taux de croissance varient selon le type cellulaire et doivent être déterminés avant de commencer l'expérience afin de préparer la transduction des cellules avec la bibliothèque Mission Lenti plex en pool d'ARNh. Décongelez les particules lentivirales sur de la glace, puis transférez les particules décongelées dans une hotte à flux laminaire, en les maintenant sur de la glace si elles ne sont pas utilisées immédiatement.Calculez la quantité de chaque sous-pool viral individuel à ajouter aux cellules pour obtenir une multiplicité d'infection (MOI) de un sur l'ensemble des boîtes de culture cellulaire. Une faible MOI est utilisée afin de réduire la probabilité de multiples intégrines par cellule. Diluez la quantité calculée de virus dans 100 à 300 microlitres de milieu complet afin d'assurer une meilleure répartition du virus lors de son ajout dans la boîte de culture cellulaire, puis retirez le milieu des cellules précédentes. Ajoutez du milieu complet contenant la solution poly-brain à chaque boîte dans le milieu.Ajoutez les particules lentivirales HRNA aux boîtes appropriées conformément au plan expérimental prédéterminé. Agitez doucement les plaques pour répartir uniformément le virus sur les cellules. Incubez de 18 à 20 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humide sous une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain, aspirez le milieu contenant le virus et ajoutez du milieu complet frais sans poly cerveau. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius toute la nuit. Le quatrième jour, aspirez le milieu des cellules et ajoutez du milieu frais contenant le composant thérapeutique à une concentration optimale prédéterminée. Incubez ensuite les cellules avec le composant pendant une durée prédéterminée.Dans cette étude, les cellules sont traitées avec 100 nanogrammes par millilitre de trail et un micromolaire de paclitaxel pendant 48 heures. Après le traitement, les cellules survivantes doivent être resemées dans des flacons T 75 et laissées se développer jusqu'à une confluence quasi totale afin d'effectuer une déconvolution polyclonale. La population hétérogène de cellules est récoltée à partir de chaque sous-pool et l'ADN génomique est isolé.Commencez la procédure de récupération du modèle S-H-R-N-A par la mise en place de la réaction de PCR, comme décrit dans le protocole écrit. Les amorces d'amplification, à une concentration de 20 millimolaire, sont fournies avec le kit lenti plex. Préparez un contrôle positif en utilisant le vecteur contrôle positif humain mission SHRA dilué à la concentration appropriée comme modèle.Un amplification réussie avec ce modèle indique que les composants du test PCR et les conditions de cyclage sont adéquats. Enregistrez le programme PCR indiqué dans le protocole écrit dans le thermocycleur et effectuez l'amplification de la cible. Une fois le cycle terminé, mélangez trois microlitres de chaque réaction PCR avec un microlitre de colorant et faites migrer par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1 %, en parallèle d'une règle de taille moléculaire de 100 paires de bases, afin de confirmer la présence d'un amplicon de 309 paires de bases.À ce stade, les amplicons de PCR sont sous-clonés par clonage Topo à l’aide du kit de clonage topo ta, conformément au protocole du fabricant. Le résultat obtenu est qu’un produit de PCR est contenu dans chaque vecteur. Une fois le sous-clonage terminé, isolez 250 colonies bactériennes individuelles, chacune contenant un amplicon de PCR distinct.Faire croître les colonies individuelles dans des cultures de deux millilitres, à partir desquelles l'ADN plasmidique peut être extrait à l'aide du kit Gen Elute de préparation mini de plasmides, puis après digestion de l'ADN plasmidique purifié par l'enzyme Eco RI, la présence de l'insert peut être confirmée par électrophorèse. Enfin, à partir des échantillons d'ADN plasmidique séquencés, l'insert S-H-R-N-A peut être identifié à l'aide de la base de données de recherche de séquences Plex HRNA fournie avec la bibliothèque PLX. Localiser la zone de recherche sur le formulaire fourni de la base de données d'accès à la recherche de séquences S-H-R-N-A, au début de la séquence HRNA.Saisissez les 10 à 21 nucléotides suivants de la séquence interrogée. Ensuite, sélectionnez l'espèce de l'ARN-S-H-R-R groupé. Vous pouvez éventuellement sélectionner le sous-groupe à partir duquel la séquence a été trouvée.Cliquez maintenant sur le bouton « Rechercher les résultats potentiels » pour effectuer la recherche. Celle-ci devrait identifier les séquences T-R-C-S-H-R-N-A correspondantes qui correspondent aux données de séquençage. Le site web de Sigma-Aldrich, votre site préféré pour les gènes, peut ensuite être utilisé pour obtenir davantage d'informations sur les séquences TR CS HRA identifiées et les gènes cibles correspondants. Les gènes cibles identifiés doivent être validés en répétant le dosage de criblage initial avec le clone TRC d'origine ainsi qu'au moins deux ARN supplémentaires ciblant le même gène, selon un format d'un ARN h pour une boîte de 60 millimètres.Les vrais positifs afficheront le même phénotype dans la majorité des boîtes. Les clones contenant le vecteur d'insertion avec un fragment PCR individuel ont été isolés à l'aide de la procédure de récupération du modèle SHRA, et l'insert HRNA a été identifié à l'aide de la base de données de recherche de séquences SHRA lenti plex. Deux cent cinquante clones ont été séquencés.Sur ces 25, plusieurs étaient représentés par des clones multiples, tandis que les 225 restants n'étaient représentés que par un seul clone et n'ont pas été poursuivis. Comme indiqué ici, plusieurs gènes candidats, notamment TBX three, PPP two, ca et AKT two, étaient représentés par des clones multiples. Le facteur de transcription de la famille T, TBX three, est apparu dans un total de quatre clones et a été impliqué dans la migration tumorale.On a démontré que la diminution de l'expression de PPP deux ca permet de maintenir la croissance de cellules ln cap cultivées dans des conditions de carence en androgènes, en levant l'arrêt du cycle cellulaire induit par la privation d'androgènes et en empêchant l'apoptose. De plus, AKT deux, une protéine kinase Arak Beta Syrian trois Anine et un oncogène putatif, s'est révélée jouer plusieurs rôles dans le développement du cancer. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la mission.Bibliothèque groupée d'ARNi Len Plex permettant de réaliser rapidement des études à haut débit sur la perte de fonction génique.

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici, nous utilisons une bibliothèque esiRNA homme dans un écran à haut débit pour les gènes impliqués dans la division cellulaire. Nous démontrons comment mettre en place et mener une esiRNA écrans, ainsi que la façon d'analyser et de valider les résultats.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Nous rapportons une petite épingle à cheveux RNA (shARN) et le protocole axée sur le séquençage de prochaine génération pour identifier les responsables de la réglementation de l’inactivation du chromosome x dans une lignée de cellules murines avec luciférase firefly et gènes de résistance à l’hygromycine fusionnée à la méthyl CpG binding protein 2 ((en anglais seulement) MeCP2) gène sur le chromosome X inactif.

ShARN regroupée écran pour la réactivation de MeCP2 sur le Chromosome X inactif

Une bibliothèque CRISPR/sgRNA a été appliquée à interroger des gènes codant pour des protéines. Toutefois, la faisabilité d’une bibliothèque de sgRNA afin de découvrir la fonction d’une limite de la FCCT dans la régulation des gènes reste inexplorée. Nous décrivons ici une bibliothèque de sgRNA spécifiques de locus HOX afin d’élucider la fonction des limites de la FCCT dans loci HOX .

HOX Locus Focused CRISPR/sgRNA bibliothèque préalable identifier critique FCCT limites

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Le dépistage par interférence ARN (ARNi) à haut débit à l’aide d’un pool d’ARNs lentiviraux peut être un outil pour détecter des cibles létales synthétiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans les tumeurs malignes. Nous fournissons une approche de dépistage de l’ARNs pour étudier les effecteurs épigénétiques de la leucémie myéloïde aiguë (LAM).

Dépistage en pool de la bibliothèque d’ARNH pour identifier les facteurs qui modulent un phénotype de résistance aux médicaments

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Nous avons développé une approche d’oncogénomique comparative inter-espèces utilisant des analyses génomiques et des criblages génomiques fonctionnels pour identifier et comparer des cibles thérapeutiques dans les tumeurs apparaissant dans des modèles murins génétiquement modifiés et le type de tumeur humaine correspondant.

Profilage génétique et criblage de décrochage à l’échelle du génome pour identifier des cibles thérapeutiques dans des modèles murins de tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique

Cette étude présente un double système CRISPRi ciblant les ARN longs non codants dans les cellules de mélanome. Il permet l’inactivation combinatoire de gènes et le criblage létal synthétique, en identifiant les interactions d’ARNlnc spécifiques au cancer pour des stratégies thérapeutiques potentielles.

Stratégie d’interférence CRISPR double pour cibler les interactions létales synthétiques entre des ARN non codants dans des cellules cancéreuses

Ce protocole décrit une approche de dépistage intraductale évolutive de CRISPR permettant des études parallèles d’élimination et d’activation du gène in vivo dans la glande mammaire de la souris.

Dépistage in vivo parallèle de l’élimination et de l’activation du gène dans la glande mammaire de la souris

Découvrez le criblage LentiPlex MISSION avec une bibliothèque shRNA génomique complète dans des cellules de mammifères. Cette méthode permet d'identifier rapidement les gènes impliqués dans la survie cellulaire et la cytotoxicité tumorale.

LentiPlex MISSION dépistage sur mélange d'Bibliothèque shRNA dans les cellules de mammifères

Explorer plus de vidéos