Modification de la direction et l'orientation du champ électrique pendant des impulsions électriques d'application améliore le transfert de gène plasmidique In vitro
12 septembre 2011
Transfection de gènes par électroporation est amélioré d'environ deux fois lorsque l'orientation du champ électrique est changé lors de l'application d'impulsions, tandis que la viabilité des cellules n'est pas affectée. L'augmentation de la transfection de gènes est causée par l'augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l'entrée d'ADN dans la cellule.
Le transfert électrogénique est une méthode physique utilisée pour introduire des gènes dans les cellules au moyen d'impulsions électriques brèves et intenses. Dans un transfert électrogénique réussi, plusieurs étapes interviennent : la formation d'un complexe entre l'ADN et la membrane cellulaire, la translocation de l'ADN à travers la membrane électropercée, le transfert de l'ADN du cytoplasme vers le noyau et l'expression du gène pour le transfert électrogénique. Différents protocoles d'impulsions électriques sont utilisés afin d'obtenir une transfection génique maximale.
L'un d'eux consiste à modifier l'orientation du champ électrique pendant la délivrance des impulsions. Dans cette vidéo, nous démontrons la différence d'efficacité de transfert génique par électroporation lorsque toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction et lorsque les impulsions sont délivrées en changeant l'orientation du champ électrique. Les expériences ont été réalisées sur des cellules d'ovaire de hamster chinois, CHOK1, pour l'expérience.
Suivez ces étapes : faites croître les cellules dans un flacon de culture dans l’incubateur pendant 24 heures. Le jour de l’expérience, préparez une suspension cellulaire à l’aide de trypsine à 0,25 % dans une solution d’EDTA, comptez les cellules, centrifugez-les pendant cinq minutes à 1000 rotations par minute à quatre degrés Celsius, puis remettez en suspension les culots cellulaires dans un tampon phosphate de sodium ISO OSM Miller pour obtenir une densité cellulaire de 5 millions de cellules par millilitre. Transférez ensuite l’échantillon dans la boîte appropriée ; les cellules sont exposées à un champ électrique dans une pointe de pipette munie d’électrodes intégrées, connectée à un générateur prototype à haute tension.
Ces électrodes permettent d'appliquer un champ électrique relativement homogène dans différentes directions. La pointe et le générateur ont été développés au laboratoire de biomécanique du faculté de génie électrique. Université de Luana ajoute un plasmide, E-G-F-P-N un à une concentration de suspension cellulaire de 10 microgrammes par millilitre.
Mélangez soigneusement les cellules avec l'ADN plasmidique et incubez le mélange pendant deux à trois minutes à température ambiante avant d'appliquer des impulsions électriques. Aspirez 100 microlitres de la suspension cellulaire dans la pointe de pipette intégrant des électrodes. Dans cette expérience, une série de huit impulsions rectangulaires est appliquée à l'aide d'un générateur prototype à haute tension, et différents protocoles de champ électrique sont utilisés dans le premier protocole.
Toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, tandis que dans le deuxième protocole, les impulsions sont délivrées en modifiant l'orientation du champ électrique. Le deuxième protocole ne peut être utilisé qu'avec un générateur d'impulsions approprié, permettant l'application d'impulsions électriques dans différentes directions. Immédiatement après l'application des impulsions, transférez les cellules du bout de pipette dans des plaques de six puits et ajoutez du sérum de veau fœtal.
25 % du volume de l'échantillon, incuber les cellules pendant cinq minutes à 37 degrés CELs. Pour permettre la reformation de la membrane cellulaire, ajouter deux millilitres de HAMF 12 à chaque échantillon dans une plaque à six puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 dans l'incubateur. L'efficacité du transfert génique par électroporation est déterminée comme le pourcentage de cellules exprimant la GFP 24 heures après l'application de l'impulsion.
Les cellules sont observées à l'aide d'un microscope à fluorescence dans le logiciel d'acquisition. Réglez la longueur d'onde d'excitation à 488 nanomètres et choisissez un filtre passe-bande approprié pour l'image fluorescente verte afin de détecter les cellules exprimant la GFP. Acquérez au moins cinq images, en contraste d'ombre portée et en fluorescence verte, à un grossissement de 20 fois.
Le grossissement de l'objectif permet de compter les cellules sur l'image en contraste de phase et les cellules exprimant la GFP sur l'image de fluorescence verte, afin de déterminer le pourcentage d'efficacité du transfert électrogénique en divisant le nombre de cellules exprimant la GFP par le nombre total de cellules sur chaque image correspondante. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP lorsque toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction et lorsque les impulsions sont délivrées en modifiant l'orientation du champ électrique est présenté en fonction du changement d'orientation du champ électrique. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP augmente de manière significative.
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Aperçu
Cette étude examine la transfection génique par électroporation, en mettant en évidence l'impact de l'orientation du champ électrique sur l'efficacité de la transfection. Les résultats indiquent que modifier la direction du champ électrique pendant l'application des impulsions peut doubler les taux de transfection génique sans compromettre la viabilité cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Thérapie génique
- Biologie cellulaire
- Techniques d'électroporation
Contexte général
- Le transfert de gènes par électroporation est une méthode permettant d'introduire des gènes dans les cellules.
- Il consiste à appliquer de brèves impulsions électriques intenses pour faciliter l'entrée de l'ADN.
- Une transfection réussie exige que l'ADN traverse la membrane cellulaire et pénètre dans le noyau.
- Différents protocoles d'impulsions électriques peuvent améliorer l'efficacité de la transfection.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'effet de l'orientation du champ électrique sur l'efficacité de la transfection génique.
- Déterminer si la modification de l'orientation affecte la viabilité cellulaire.
- Illustrer le processus en utilisant des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO).
Méthodes utilisées
- Application d'impulsions électriques à des cellules CHO.
- Comparaison de l'efficacité de transfection selon différentes orientations du champ électrique.
- Évaluation de la viabilité cellulaire après la transfection.
- Analyse de l'entrée de l'ADN dans les cellules et de l'expression génique subséquente.
Résultats principaux
- L'efficacité de la transfection génique a augmenté d'environ deux fois grâce à une orientation modifiée du champ électrique.
- Aucun impact significatif sur la viabilité cellulaire n'a été observé.
- Une augmentation de la surface membranaire a contribué à une entrée améliorée de l'ADN.
- L'efficacité de différents protocoles d'impulsions électriques a été démontrée.
Conclusions
- Modifier l'orientation du champ électrique pendant l'application de l'impulsion améliore considérablement la transfection génique.
- Cette méthode peut être optimisée sans compromettre la viabilité cellulaire.
- Des recherches ultérieures pourraient explorer d'autres protocoles afin d'améliorer la livraison de gènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'optimisation de l'orientation du champ électrique pendant l'électroporation améliore l'efficacité du transfert génique plasmidique, offrant une stratégie non virale pour augmenter les rendements de transfection dans les flux de travail de validation précoce des cibles et d'identification des candidats. Cette approche facilite la détection mécanistique des risques en augmentant l'entrée d'ADN grâce à une compétence membranaire accrue, sans compromettre la viabilité cellulaire, améliorant ainsi la fiabilité prédictive des modèles précliniques. La méthode permet une livraison génique reproductible et évolutive, utile au développement de tests et aux criblages phénotypiques dans la recherche et le développement en biopharmacie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Augmente la surface membranaire compétente pour l'entrée de l'ADN, améliorant ainsi l'efficacité de la transfection et soutenant la validation fonctionnelle de cibles dans les études d'expression de protéines recombinantes.
- Valeur opérationnelle : Permet une livraison cohérente du plasmide au sein des populations cellulaires, réduisant la variabilité lors des tests d'hypothèses en phase précoce et de la clarification des voies biologiques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des lectures quantitatives, basées sur la fluorescence, de l'efficacité du transfert génique, compatibles avec des plates-formes de criblage à haut contenu.
- Valeur opérationnelle : Normalise les paramètres d'électroporation à l'aide de pointes d'électrodes intégrées et de générateurs d'impulsions programmables, améliorant ainsi la reproductibilité des tests entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Permet la préparation à grande échelle de lignées cellulaires transfectées destinées à des tests ultérieurs d'engagement de cibles et de biomarqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la viabilité cellulaire après la transfection, permettant des études longitudinales de l'expression génique et des effets phénotypiques dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Facilite la génération de modèles précliniques stables ou transfectés de manière transitoire à l'aide de cellules CHO, un hôte largement utilisé pour la production de biomédicaments et l'analyse des voies métaboliques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, où une livraison efficace des gènes est nécessaire pour évaluer la fonction de la cible et moduler les voies dans des modèles cellulaires.
- Biologie de la découverte : Permet la validation d'hypothèses en assurant une surexpression ou une inhibition fiable de gènes d'intérêt dans des cellules de mammifères.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs normalisés de transfection, permettant la comparaison de constructions génétiques ou d'éléments régulateurs.
- Analytique : Génère des mesures d'efficacité exprimées en pourcentage (cellules GFP+/nombre total de cellules), permettant des comparaisons statistiques entre différents protocoles d'impulsions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique en produisant des cellules transfectées viables, adaptées à des validations ultérieures dans des modèles tridimensionnels ou des systèmes de co-culture.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité d'électroporation réutilisable, applicable à plusieurs projets nécessitant une livraison de plasmides dans des lignées cellulaires adhérentes ou en suspension.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive des résultats de transfert génique en augmentant l'efficacité de transfection grâce à l'optimisation biophysique des paramètres d'impulsion.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation des procédures de transfert génique grâce à des trains d'impulsions définis et un contrôle de l'orientation du champ.
- Valeur stratégique : Réduit le risque biologique dans la validation des cibles en assurant une expression suffisante du transgène pour l'évaluation phénotypique, minimisant ainsi les faux négatifs.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles génétiques selon les niveaux d'expression réalisables dans les tests cellulaires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules de mammifères, en préparation de plasmides et en microscopie à fluorescence pour l'évaluation de l'efficacité de la transfection.
- Dépend de l'accès à des générateurs d'impulsions haute tension capables de modifier l'orientation du champ électrique de manière programmable et à des pointes munies d'électrodes compatibles.
- Implique la standardisation des paramètres d'impulsion (tension, durée, nombre) et de la densité cellulaire entre les expériences afin d'assurer la comparabilité.
- Implique l'optimisation du rapport ADN par cellule et des temps d'incubation pour équilibrer efficacité de la transfection et stress cellulaire.
- Limité aux lignées cellulaires adhérentes ou en suspension compatibles avec l'électroporation ; les cellules primaires ou sensibles peuvent nécessiter des méthodes de livraison alternatives.
