Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

L'objectif général de cette procédure est d'établir une préparation de tranches tissulaires aiguës de l'organe nasal RO ou de l'organe voméro-nasal (OVN) de la souris afin de réaliser des expériences d'imagerie calcique sur des sous-populations ou des neurones individuels dans un tissu vivant. Cette procédure consiste d'abord à extraire l'OVN du nez de la souris, puis à le disséquer minutieusement hors de sa capsule cartilagineuse au microscope stéréoscopique dans un liquide artificiel céphalo-rachidien (ACSF) froid. Ensuite, l'OVN isolé est positionné verticalement dans un bloc d'agarose et des tranches tissulaires coronales aiguës sont coupées à l'aide d'un microtome afin de vérifier l'intégrité du tissu.

Quelques coupes sont observées après immunohistochimie au microscope confocal. D'autres coupes sont chargées avec un colorant sensible au calcium, puis perfusées avec des ligands phéromonaux présumés, et l'activation neuronale est observée à l'aide de l'imagerie calcique. Cette méthode peut aider à résoudre des questions clés dans le domaine olfactif.

Par exemple, des centaines de récepteurs de phéromones sont exprimés dans l'organe nasal voméronasal, mais très peu d'entre eux ont des ligands identifiés. Les récepteurs de phéromones sont très difficiles à exprimer dans un système hétérologue. Nous devions mettre au point un essai in vivo efficace permettant d'associer des phéromones spécifiques à des récepteurs spécifiques.

Nous pouvons utiliser des souris tactiles dans lesquelles une sous-population spécifique de neurones exprime des récepteurs inconnus et peut être identifiée par l'expression de la GFP. Nous pourrions également utiliser cet essai pour étudier pharmacologiquement les canaux ioniques et les enzymes impliqués dans la cascade de transduction de Fairmont en démontrant la procédure. Aujourd'hui, ce seront Julian et Fabian, deux chercheurs de mon laboratoire, avant de commencer la dissection.

Préparez un liquide céphalorachidien artificiel frais et froid, A CSF, saturé d'oxy carb en combinant tous les ingrédients sauf le chlorure de calcium. Saturez la solution en la barbotant directement avec de l'oxy carb. Ajoutez ensuite le chlorure de calcium et ajustez au volume désiré avec de l'eau doublement distillée.

Gardez la solution de LCR A sur de la glace jusqu'à son utilisation. Après l'euthanasie et la décapitation d'une souris adulte, préparez une boîte de Pétri contenant du LCR A froid et continuellement oxygéné et carbonaté. Après avoir retiré la mâchoire inférieure, placez la tête de la souris dans la boîte de Pétri.

Positionner la tête de la souris sous le microscope stéréoscopique afin de visualiser le palais. Ensuite, pratiquer une incision horizontale dans la partie supérieure du palais à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, puis retirer la membrane palatine à l’aide de pinces microdissectrices. Hydrater et nettoyer la cavité exposée avec un LCS.

Coupez la partie supérieure et inférieure du septum nasal. Ensuite, extrayez délicatement le septum nasal contenant l'organe voméronasal (VNO) et placez-le directement dans du LCR propre, verticalement. Séparez les deux parties du VNO à l’aide de pinces de dissection microchirurgicales.

Identifier la capsule cartilagineuse du VNO, puis la retirer délicatement en veillant à éliminer tous les fragments cartilagineux. Le VNO isolé, les fragments cartilagineux et le VNO non disséqué sont indiqués ici. La première année, préparez de l'agarose à faible point de fusion à 3 %, puis aménagez le poste de travail avec les outils nécessaires. Remplissez le moule d'inclusion avec de l'agarose et assurez-vous que la température soit inférieure à 41 degrés Celsius avant d'y plonger le VNO disséqué. Positionnez le tissu verticalement afin d'obtenir des coupes coronales.

Placer le moule d'encapsulation sur de la glace pendant une minute, jusqu'à ce que l'augoir durcisse. Après une minute, retirer le bloc d'augoir, découper l'agar en forme paramétrale, puis le coller sur le support du microtome à l'aide du microtome pour découper des tranches coronales du VNO à une vitesse de 0,5 millimètre par seconde, avec une amplitude de 0,7 millimètre et une épaisseur de 100 micromètres dans un liquide céphalorachidien froid.

Collecter les tranches de tissu à l’aide d’un pinceau et les placer dans une plaque de culture tissulaire remplie de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) froid afin de vérifier l’intégrité structurelle des tranches de tissu, qui peuvent ensuite être fixées et soumises à une immunomarquage pour des composants du cytosquelette ou d'autres protéines d’intérêt. Ici, l’immunomarquage dirigé contre la tubuline acétylée, en violet, démontre l’intégrité structurelle de la tranche de tissu. En outre, l’observation d’une population neuronale spécifique dans laquelle un récepteur de phéromone particulier a été marqué par la protéine fluorescente verte (GFP) montre la morphologie neuronale conservée : des neurones présentant des corps cellulaires petits et ovales, ainsi que de longs dendrites atteignant la surface de la lumière et se terminant par des microvillosités, peuvent être observés en travaillant dans une pièce sombre.

Incuber les tranches de VNO dans une solution de chargement composée d'ACSF froid avec sept micromoles d'URA 2:00 AM et 0,1 % de ionique pendant une heure à 37 degrés Celsius après une heure. Conserver les tranches chargées sur de la glace avec oxygénation au gaz carbonique jusqu'à utilisation. Utiliser un pinceau pour placer les tranches chargées dans une chambre de perfusion contenant de l'ACSF et fixer les tranches à l'aide d'un ancrage pour tranches de tissu.

Placez la chambre de perfusion sur la platine du microscope d’un dispositif d’imagerie calcique et effectuez une perfusion continue avec du LCR oxygéné-carbonaté à température ambiante. Observez les tranches de VNO chargées en utilisant les longueurs d’onde de fluorescence correspondant au colorant, soit de 340 à 380 nanomètres pour le 4-O-AM. Utilisez le logiciel approprié pour enregistrer les variations du rapport calcique intracellulaire. Un système de perfusion est nécessaire pour induire une stimulation chimique.

Ici, une coupe coronale de tissu du VNO provenant d'une souris, dans laquelle la sous-population de neurones exprimant le récepteur phéromonal V1Rb2 exprime également la GFP, est immunomarquée contre la protéine tubuline acétylée, représentée en violet. Des vues à plus fort grossissement de la coupe montrent la préservation de l'intégrité du tissu. Des neurones dotés de longues dendrites sont visibles, s'étendant jusqu'à la surface de la lumière, et l'expression de la protéine structurelle peut être observée au niveau des boutons dendritiques et des microvillosités, en vue d'imagerie calcique.

Les tranches de tissu chargées de FU sont d'abord visualisées en contraste de phase Hoffman afin de localiser le champ d'intérêt en partant du vaisseau sanguin, première flèche blanche ; l'observateur progresse lentement vers la lumière, deuxième flèche blanche, puis vers la région neuro-épithéliale. Le corps cellulaire ovalaire du neurone nasal RO. La troisième flèche blanche peut être identifiée par son dite long et fin.

La quatrième flèche blanche s'étendant vers la lumière, le bouton dendritique neuronal. La cinquième flèche blanche indique des microvillosités en contact avec les cellules chargées de phéromones RA ; ici, celles-ci sont observées à trois 80 nanomètres, puis illuminées successivement à trois 40 et trois 80 nanomètres, et ce rapport de longueurs d'onde fluorescentes est tracé, correspondant aux variations de calcium intracellulaire dans les neurones sélectionnés, cercles noir, rouge et bleu. Un TP est utilisé pour déterminer la viabilité des neurones.

Remarquez la variabilité des réponses calciques observées dans les trois neurones sélectionnés, ainsi le fait que le neurone numéro deux (cercle rouge) ne réponde pas à un TP et sera donc écarté de toute analyse ultérieure. La stimulation chimique est ensuite réalisée à l’aide d’urine et d’un mélange de phéromones murines, en examinant la profondeur de la coupe tissulaire. Une sous-population de neurones exprimant à la fois la GFP et le récepteur V one RRB two peut être localisée.

Ici, un neurone exprimant à la fois la GFP et le récepteur V1RB2 est montré aux côtés d'un neurone n'exprimant pas V1RB2. Les deux cellules sont chargées avec URA 2:00 AM et le neurone exprimant V1RB2 présente un pic calcique en réponse à la perfusion du ligand du récepteur, le two he connu. Curieusement, le neurone n'exprimant pas V1RB2 répond également au two hep connu, démontrant la complexité du codage des phéromones dans l'ONV.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire et microdisséquer la souris afin d'isoler l'organe cochléaire pour préparer des tranches de tissu aiguës. Ce protocole peut également être adapté à des investigations physiologiques utilisant d'autres colorants calciques et différents montages microscopiques. Bonne chance dans votre expérience.