Name: Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez la préparation de tranches aiguës de l'organe voméronasal chez la souris pour l'imagerie calcique. Cette méthode permet d'observer l'activation neuronale en réponse aux phéromones et d'étudier les mécanismes olfactifs.

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Nous tenons à remercier particulièrement Monique Nenniger Tosato pour son excellent support technique ainsi que Jean-Yves Chatton pour ses conseils scientifiques et la plate-forme d&#39;imagerie CIF de l&#39;UNIL pour l&#39;équipement de microscope. Le financement a été fourni par le Fonds national suisse.

1. Dissection de la souris VNO <ol><li> Utilisez la souris adulte. Comme phéromone de détection est impliqué dans multimodalities, distinguer soigneusement entre les souches, les génotypes, les sexes et les âges est importante et va influencer vos résultats. Ici, nous choisissons souris adultes VG 30 précédemment utilisés pour l'identification d'une paire phéromone-récepteur (2-heptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A). </li><li> Avant de commencer la dissection, préparer douce froide artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF; NaCl 118 mM, NaHCO 3 25 mM, D-glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturé avec oxycarbon (95% d'O 2: 5% de CO 2). Pour cela, mélanger tous les composants, sauf ACSF CaCl 2. Saturer la solution par barbotage directement avec oxycarbon. À la fin, ajouter le CaCl 2 et d'ajuster avec ddH 2 0 au volume désiré. Conserver la solution ACSF sur la glace jusqu'à ce que uSE. </li><li> L'euthanasie de la souris doit être préférentiellement réalisée par dislocation cervicale ou par inhalation de CO 2, juste avant l'expérience. </li><li> Couper la tête de la souris. Placez-le sous un microscope à dissection au froid en permanence oxycarbonated ACSF. </li><li> Couper la mâchoire inférieure et la position de la tête afin de visualiser le palais (Fig. 1B). </li><li> Faire une incision horizontale dans la partie supérieure du palais (Fig. 1B) avec des ciseaux micro et retirer la membrane en bouche avec micro pince à disséquer. Hydrater et nettoyer la cavité exposée avec ACSF (Fig. 1C). </li><li> Couper la partie supérieure et la partie inférieure de la cloison nasale (Fig. 1C). Délicatement extraire la cloison nasale contenant le VNO et le placer directement dans l'ACSF sur la glace (Fig. 1D). </li><li> Séparés verticalement les deux parties du VNO à l'aide de micro pince à disséquer et délicatement retirer la capsule cartilagineuse du VNO (Fig. 1E). Assurez-vous que toutes les pièces cartilagineuses sont supprimés. </li></ol> 2. Préparation VNO coupe de tissu La préparation VNO tranche de tissus décrits dans cette section 2) est principalement pour les enquêtes imagerie calcique. Tranches VNO peut aussi être utilisé pour immunohistostainings sur des tranches flottantes pour vérifier l'intégrité structurelle du tissu (s'il vous plaît voir la section 3) du Protocole). <ol><li> Préparer bas point de fusion de gélose (3% de la norme PBS) et votre lieu de travail. Vous aurez besoin de l'ACSF, un microtome et des supports, micro pince à disséquer, l'intégration de moules (22 x 22 x 20 mm), des lingettes de précision, des brosses, des plaques de culture tissulaire, cyanacrylat colle, glace et un thermomètre. </li><li> Remplissez le moule intégration avec 3% d'agar bas point de fusion. Assurez-vous que la température n'est pas supérieure à 41 ° C avant de les placer verticalement la peu effacé VNO (figure 2A) pour être en mesure d'obtenir des tranches coronales. </li><li> Placer le moule sur la glace intégrationpendant 1 min jusqu'à solidification et ensuite le séparer du bloc de gélose. Couper le bloc de gélose dans une forme pyramidale et placez-le avec de la colle sur le support microtome (figure 2B). </li><li> Couper les tranches coronales VNO avec le microtome, avec une vitesse de 0,5 mm / s, une amplitude de 0,7 mm et une épaisseur de 100 um à froid ACSF et de recueillir les tranches de tissu avec un pinceau avant de les placer dans une assiette remplie de culture de tissus par le froid ACSF. </li><li> Si vos tranches contiennent de fluorescence endogène comme la GFP (en génique ciblée les neurones), vous pouvez les sélectionner sous un stéréomicroscope fluorescentes (figure 2C). </li></ol> 3. Immunohistochimie sur coupes flottantes VNO Le but de cette procédure est de vérifier l'intégrité des tranches de tissu VNO obtenus dans la section 2). Acétylé-tubuline est un marqueur de microtubules / cytosquelette exprimées dans les dendrites et les microvillosités des neurones sensoriels VNO. Pour des expériences d'imagerie calcique, allez directionTLY à la section 4) du Protocole. La méthode immunohistostaining sur des tranches flottantes VNO peuvent être adaptés à l'évaluation de l'expression d'une protéine d'intérêt. À cette fin, nous vous recommandons de fixer le VNO pour 1h à 4 ° C dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) après le point 1.7) du protocole et de l'utilisation de cette PBS à pH 7,6 points plutôt que solution de l'ACSF. <ol><li> Dans la plaque de culture tissulaire, fixer vos tranches d'intérêt dans une solution de fixation (paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,6) 1h à 4 ° C. </li><li> Bloc vos tranches de tissu une nuit à 4 ° C dans une solution de PBS contenant END (sérum normal de chèvre) 10% et le Triton X-100 à 0,5%. </li><li> Incuber tranches avec l'anticorps primaire (anticorps anti-tubuline acétylée, souris, 1:2000) pendant 16 heures à température ambiante (TA) dans une solution de PBS contenant 5% de NGS et de Triton X-100 à 0,25%. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec une solution de PBS contenant 2% de NGS. </li><li> Incuber dans l'obscurité avec le secoNdary anticorps (Cy5 conjugués de chèvre anti-souris, 1:200) dans une solution de PBS contenant 2% de NGS pour 1h à température ambiante. </li><li> Lavez 3 fois pendant 5 minutes avec du PBS contenant 2% de NGS, PBS END 1% et PBS. </li><li> Mont vos tranches dans un média fluorescents montage (contenant ou non DAPI) en les plaçant au centre des zones délimitées hydrophobe (utiliser un stylo hydrophobe) et couvrir les tranches avec des lamelles. </li><li> Faire des observations et des acquisitions avec la microscopie confocale et un logiciel permettant des reconstructions 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Imagerie calcique sur des tranches de VNO <ol><li> Les procédures suivantes auront lieu dans l'obscurité. Incuber tranches VNO pour 1h à 37 ° C dans une solution de chargement composé de froid ACSF avec Fura-deux heures (7 uM; solution stock de 1 mM dans le DMSO) et pluronic 0,1% (p / v; solution stock à 20% dans le trou DDH 2 O). </li><li> Gardez les tranches chargé sur la glace avec oxycarbonation jusqu'à utilisation. Loaded tranches peuvent être conservés pour3-4h. </li><li> Placer les tranches de chargement avec une brosse dans une chambre de perfusion contenant ACSF et de maintenir les tranches avec une ancre coupe de tissu (figure 3A). </li><li> Placer la chambre de perfusion sur la scène d'un microscope à l'imagerie calcique (Fig. 3B) et en continu perfuser avec oxycarbonated ACSF à RT. La température peut être adaptée à l'utilisation d'un régulateur de température bipolaire. </li><li> Observations des tranches de VNO chargé (Fig. 3C-E) sont réalisées avec un microscope inversé à fluorescence, avec un objectif 25x ou 63x et un CooL SNAP-HQ caméra. L'éclairage est fait de manière séquentielle (340/380 nm) avec un instrument polychromateur et enregistrés à une fréquence de 5Hz. D'émission filtrée est fait à 510 nm. Intracellulaire de calcium changements de rapport (AF = 340 nm/380 nm) sont surveillés par un logiciel approprié. </li><li> Chemostimulation doit être choisi en fonction de vos propres fins expérimentales. Ici, des perfusions de ACSF contenant une phéromone mix (isobutylamine, la 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, diméthylpyrazine, α / β-farnésène, 10 -6 M), 2-heptanone (10 -6 M) ou fraîchement récoltés mâle et femelle (1: 1) l'urine de souris (1:100) sont effectuées 32. Perfusion d'ATP (125 uM) est utilisé comme un test de viabilité à la fin de l'expérimentation (Fig. 3F) et devraient indiquer une proportion d'environ 80% des neurones viables. Dans ces conditions, les tranches peuvent être utilisés jusqu'à 2 heures. </li><li> Sous-populations GFP-tagged de neurones sensoriels sont visualisés par illumination spécifique (ici, les neurones exprimant V1rb2) et peuvent être analysées avec précision (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Pour établir un dosage fonctionnel pour enquêter sur la transduction du multi voies en prenant place dans le VNO souris, ou d'identifier de nouvelles phéromones récepteurs paires, nous profitons de la ligne VG de la souris (fig. 1A (figure 1E), nous préparons aiguë tranches VNO (figure 2C). Nous fixons une fraction d'entre eux, afin de vérifier et de valider l'intégrité tissulaire de la préparation en effectuant immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline (Fig. 2D-F). L'autre fraction des tranches est utilisé pour des expériences d'imagerie calcique. Pour cela, les tranches sont chargés avec Fura-2 heures (Fig. 3C-E) et le niveau de calcium intracellulaire de chaque neurone est surveillé comme un ratio AF (figure 3F). Viabilité des neurones est évaluée par la perfusion d'ATP (125 uM), après quoi augmentation rapide et transitoire du ratio AF est attendu (figure 3F). L'urine étant une source importante de phéromones, la perfusion de produits fraisl'urine de souris Ly collectées (1:100) est utilisé comme un contrôle endogène. Il déclenche transitoires calciques dans environ 50% des neurones enregistrés (cellules 1 et 2, Fig. 3F). Sous un éclairage GFP, V1Rb2 neurones positifs sont observables, et la perfusion de son ligand phéromonal connue, la 2-heptanone, initie l'activation cellulaire (cellule 1, Fig. 3I). Fait intéressant, les activations neuronales sont également observables en une fraction de neurones qui n'expriment pas le récepteur V1Rb2 (neurones GFP négatifs) (cellule 2, fig. 3I), démontrant la complexité de la phéromone de codage dans le VNO. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dissection de l'organe voméronasal de la souris. (A) Une souris à partir de la ligne VG. (B) Après l'euthanasie de la souris, la tête pleine est placé sous un microscope binoculaire et la mâchoire inférieure est enlevée afin de visualiser le palais. Une petite incision horizontale est faite(Ligne noire en pointillés). (C) Après l'enlèvement du voile du palais, la cloison nasale alignés avec le VNO est coupé dans la partie supérieure et la partie inférieure (blanc pointillé) pour faciliter l'extraction VNO. (D) Le VNO est positionné dans une solution de l'ACSF et séparés (insérer: Vue de puissance plus élevé des deux parties). (E) La capsule cartilagineuse du VNO est délicatement retiré, et le VNO sans capsule cartilagineuse est utilisé pour le reste de l'expérimentation. Barres d'échelle sont les suivants: BE, 1 mm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Souris voméronasal préparation de tranches aiguës et de l'intégrité tissulaire. (A) Le VNO est verticalement intégré la souris dans une solution d'agar à 3%. La température de la gélose doit être inférieure à 41 ° C. (B) Le bloc d'agar est coupé en une forme pyramidale et 100 um sections VNO (ligne noire en pointillés) sont générés dans l'ACSF. (C) tranches VNO peut être sélectionné sous un stéréomicroscope fluorescentes afin de visualiser un particulierpopulation de neurones sensoriels marqués. (DF) de l'intégrité tissulaire peut être évalué par immunohistostainings contre la protéine acétylée-tubuline, une vue plus grande puissance de l'V1rb2 génique ciblée les neurones de démontrer la parfaite conservation de la préparation. Neurones avec leurs dendrites longues atteignant la surface de la lumière (E) ainsi que l'expression de la protéine structurelle des boutons dendritiques et microvillosités peuvent être observées (F). Barres d'échelle sont les suivantes: B, 5 mm; C, 60 um; D, 40 um; EF, 20 um. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Imagerie calcique Figure 3. Et la détection des phéromones dans les tranches de tissu voméronasal aiguë. (A) Après un Fura-2 heures phase de chargement, des tranches de VNO sont placés dans une chambre de perfusion et sont maintenues avec une ancre adaptée (vue de forte puissance). (B) des expériences sont effectuées dans les tranches sombre et VNO sont continuellement perfusées avec ACSF à TA avec un système de vide. La température peut être chosfr en utilisant un système de régulateur de température composé d'un élément bipolaire Pelletier et une sonde thermique. Cette expérience particulière a été réalisée à température ambiante. (CE) tranches VNO sont observables sous contraste de phase Hoffman (C, HV) ou l'illumination Fura 380 nm avant (D) et lors de l'activation neuronale (E, ici avec l'ATP). (F) la viabilité neuronale est évalué avec une perfusion d'ATP (125 pM). Ici, chemostimulation est fait avec de l'urine (urine, 1:100) ou avec un mélange de phéromones de la souris (ph mix., 10 -6 M) à un débit constant de 165 ml / h. Les niveaux de calcium intracellulaire (AF) peuvent être enregistrées individuellement pour chaque cellule (cellule 1 à 3). (G) Un neurone V1Rb2 est visualisée sous un éclairage GFP (1). (H) Le chargement de ce neurone (1) ainsi que d'un neurone non V1rb2 exprimer (2) est montrée. (I) Le neurone est V1rb2 mesure de répondre à la 2-heptanone avec une augmentation du calcium intracellulaire. Ce particulier la non-V1rb2 neurone répond également à exprimer la 2-heptanone (cellule 2). Barres d'échelle sont: CE, 20 um; GH,15 um; AF = 340 nm / 380 nm. (F et I) Durée d'application de relance est indiquée par des barres sous chaque trace. L'échelle de couleurs arbitraires représente l'intensité de fluorescence.

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<li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li>
<li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li>
<li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li>
<li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode d&#39;imagerie calcique présenté ici permet d&#39;enregistrer, dans une préparation de tranches aiguës, les réponses des phéromones de neurones VNO souris. Avec cette approche, la dissection de l&#39;animal à l&#39;neurones voméronasal est, avec une certaine pratique, facilement réalisable et offre une préparation de tissu vivant longtemps. Il permet de temps des expériences comme les enquêtes pharmacologiques ou l&#39;étude du codage phéromonal. Avec cette technique, physiologiques, des populations importantes ainsi que des sous-populations précises de neurones peut être analysée spécifiquement. En outre, cette méthode peut être facilement adapté à des approches immunohistochimiques ou des expériences à base de colorants de calcium. L&#39;utilisation de ces méthodes combinées va sûrement permettre l&#39;identification de nouveaux ligands pour les phéromones chémorécepteurs orpheline de nombreux exprimée dans l&#39;organe voméronasal de la souris.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> L&#39;adénosine 5&#39;-triphosphate disodique solution de sel (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> De façon préférentielle pour l&#39;immunohistochimie </td></tr><tr><td> Agar (bas point de fusion) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> De préférence pour l&#39;imagerie calcique </td></tr><tr><td> CL-100 Contrôleur de température bipolaire </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure chèvre anti-souris IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Protéger de la lumière </td></tr><tr><td> DMSO (diméthylsulfoxyde) </td><td> Merck </td><td> 317 275-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Incorporation de moules, de Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescent montage de médias (Vectashield avec DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-deux heures </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Protéger de la lumière </td></tr><tr><td> Glisseal N (graisse à vide, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Grand bain de chambre d&#39;enregistrement (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (logiciel pour l&#39;imagerie calcique; v.7.6.5.0) </td><td> Systèmes Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonaux anti-tubuline, acétylerd anticorps de souris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme pour les chambres (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (flacon doseur, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 chauffe double solution en ligne / Cooler </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Ancrage Slice (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> PEN PAP Super (hydrophobestylo) </td><td> Pelco international </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93 420-250ml </td><td></td></tr><tr><td> Lame vibrante microtome VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome système à haute vitesse polychromateur </td><td> Systèmes Visitron </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane logiciels scientifiques </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie phéromones détection dans une souris vomeronasal tissus préparation trancher aiguë

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson et Martin Lüscher utilisé la phéromone terme pour la première fois en 1959 pour décrire une chimiques utilisés pour la communication intra-espèces. Les phéromones sont volatiles ou non volatiles courte durée molécules sécrétées 2 et / ou contenus dans les fluides biologiques 3,4, tels que l&#39;urine est un liquide connu pour être une des principales sources de phéromones 3. La communication phéromonale est impliqué dans une variété de modalités d&#39;animaux tels que les interactions clés kin 5,6, 3 et les organisations hiérarchiques interactions sexuelles 7,8 et sont par conséquent directement corrélée avec la survie d&#39;une espèce donnée 9,10,11. Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l&#39;organe voméronasal (VNO) 10,12, une structure paire située à la base de la cavité nasale, et enfermé dans une capsule cartilagineuse. Chaque VNO a une forme tubulaire avec un lumen 13,14 permettant le contact avec les vérificateurs externesmonde chimique. Le neuroépithélium sensorielle est principalement composé de neurones bipolaires voméronasal sensorielles (VSN) 15. Chaque VSN s&#39;étend une dendrite unique pour la lumière se terminant en une poignée de grandes dendritiques portant jusqu&#39;à 100 microvillosités impliquées dans la détection chimique 16. Sous-populations de nombreux VSN sont présents. Ils sont différenciés par la chémorécepteurs qu&#39;ils expriment et donc éventuellement par le ligand (s) qu&#39;ils reconnaissent 17,18. Deux principales familles de récepteurs voméronasal, V1Rs et V2Rs 19,20,21,22, sont composés respectivement de 240 et 120 23 24 membres et sont exprimés dans des couches distinctes du neuroépithélium. Les récepteurs olfactifs (OR) 25 et les récepteurs de peptides formyl (FPRs) 26,27 sont également exprimés en VSN. Que ce soit ou non ces sous-populations neuronales utiliser la même voie de signalisation en aval des phéromones de détection est inconnue. Malgré un rôle majeur joué par un calcium-perméable canal (TRPC2) présents dans les microvillosités des neurones matures 28 TRPC2 canaux de transduction indépendante ont été suggérées 6,29. En raison du nombre élevé de sous-populations neuronales et la morphologie particulière de l&#39;orgue, les enquêtes pharmacologiques et physiologiques des éléments de signalisation présentes dans le VNO sont complexes. Ici, nous présentons une préparation tissulaire aiguë tranche de la VNO la souris pour effectuer des examens d&#39;imagerie calcique. Cette approche physiologique permet des observations, dans le milieu naturel d&#39;un tissu vivant, des sous-populations générale ou individuelle du VSN préalablement chargé avec Fura-deux heures, un colorant de calcium. Cette méthode est également commode pour étudier tout récepteur GFP-tagged phéromone et est adaptable pour l&#39;utilisation d&#39;autres sondes fluorescentes de calcium. Comme exemple, nous utilisons ici une souris VG ligne 30, dans laquelle la traduction du récepteur de phéromones V1rb2 est liée à l&#39;expression de la GFP par une stratégie polycistronique. </p&gt;

Chez la souris, la capacité à détecter des phéromones est principalement médiée par l&#39;organe voméronasal (VNO). Ici, une préparation tissulaire aiguë tranche de VNO pour effectuer l&#39;imagerie calcique est décrite. Cette approche permet des observations physiologiques des sous-populations et / ou des neurones individuels dans un tissu vivant et est commode pour récepteur-ligand d&#39;identification.

Imagerie phéromones détection dans une souris Vomeronasal tissus Préparation Trancher aiguë

Peter Karlson et Martin Lüscher ont utilisé pour la première fois le terme phéromone en 19591 pour décrire des substances chimiques utilisées pour la communication intraspécifique. ...

L'objectif général de cette procédure est d'établir une préparation de tranches tissulaires aiguës de l'organe nasal RO ou de l'organe voméro-nasal (OVN) de la souris afin de réaliser des expériences d'imagerie calcique sur des sous-populations ou des neurones individuels dans un tissu vivant. Cette procédure consiste d'abord à extraire l'OVN du nez de la souris, puis à le disséquer minutieusement hors de sa capsule cartilagineuse au microscope stéréoscopique dans un liquide artificiel céphalo-rachidien (ACSF) froid. Ensuite, l'OVN isolé est positionné verticalement dans un bloc d'agarose et des tranches tissulaires coronales aiguës sont coupées à l'aide d'un microtome afin de vérifier l'intégrité du tissu.Quelques coupes sont observées après immunohistochimie au microscope confocal. D'autres coupes sont chargées avec un colorant sensible au calcium, puis perfusées avec des ligands phéromonaux présumés, et l'activation neuronale est observée à l'aide de l'imagerie calcique. Cette méthode peut aider à résoudre des questions clés dans le domaine olfactif.Par exemple, des centaines de récepteurs de phéromones sont exprimés dans l'organe nasal voméronasal, mais très peu d'entre eux ont des ligands identifiés. Les récepteurs de phéromones sont très difficiles à exprimer dans un système hétérologue. Nous devions mettre au point un essai in vivo efficace permettant d'associer des phéromones spécifiques à des récepteurs spécifiques.Nous pouvons utiliser des souris tactiles dans lesquelles une sous-population spécifique de neurones exprime des récepteurs inconnus et peut être identifiée par l'expression de la GFP. Nous pourrions également utiliser cet essai pour étudier pharmacologiquement les canaux ioniques et les enzymes impliqués dans la cascade de transduction de Fairmont en démontrant la procédure. Aujourd'hui, ce seront Julian et Fabian, deux chercheurs de mon laboratoire, avant de commencer la dissection.Préparez un liquide céphalorachidien artificiel frais et froid, A CSF, saturé d'oxy carb en combinant tous les ingrédients sauf le chlorure de calcium. Saturez la solution en la barbotant directement avec de l'oxy carb. Ajoutez ensuite le chlorure de calcium et ajustez au volume désiré avec de l'eau doublement distillée.Gardez la solution de LCR A sur de la glace jusqu'à son utilisation. Après l'euthanasie et la décapitation d'une souris adulte, préparez une boîte de Pétri contenant du LCR A froid et continuellement oxygéné et carbonaté. Après avoir retiré la mâchoire inférieure, placez la tête de la souris dans la boîte de Pétri.Positionner la tête de la souris sous le microscope stéréoscopique afin de visualiser le palais. Ensuite, pratiquer une incision horizontale dans la partie supérieure du palais à l’aide de ciseaux microchirurgicaux, puis retirer la membrane palatine à l’aide de pinces microdissectrices. Hydrater et nettoyer la cavité exposée avec un LCS.Coupez la partie supérieure et inférieure du septum nasal. Ensuite, extrayez délicatement le septum nasal contenant l'organe voméronasal (VNO) et placez-le directement dans du LCR propre, verticalement. Séparez les deux parties du VNO à l’aide de pinces de dissection microchirurgicales.Identifier la capsule cartilagineuse du VNO, puis la retirer délicatement en veillant à éliminer tous les fragments cartilagineux. Le VNO isolé, les fragments cartilagineux et le VNO non disséqué sont indiqués ici. La première année, préparez de l'agarose à faible point de fusion à 3 %, puis aménagez le poste de travail avec les outils nécessaires. Remplissez le moule d'inclusion avec de l'agarose et assurez-vous que la température soit inférieure à 41 degrés Celsius avant d'y plonger le VNO disséqué. Positionnez le tissu verticalement afin d'obtenir des coupes coronales.Placer le moule d'encapsulation sur de la glace pendant une minute, jusqu'à ce que l'augoir durcisse. Après une minute, retirer le bloc d'augoir, découper l'agar en forme paramétrale, puis le coller sur le support du microtome à l'aide du microtome pour découper des tranches coronales du VNO à une vitesse de 0,5 millimètre par seconde, avec une amplitude de 0,7 millimètre et une épaisseur de 100 micromètres dans un liquide céphalorachidien froid.Collecter les tranches de tissu à l’aide d’un pinceau et les placer dans une plaque de culture tissulaire remplie de liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) froid afin de vérifier l’intégrité structurelle des tranches de tissu, qui peuvent ensuite être fixées et soumises à une immunomarquage pour des composants du cytosquelette ou d'autres protéines d’intérêt. Ici, l’immunomarquage dirigé contre la tubuline acétylée, en violet, démontre l’intégrité structurelle de la tranche de tissu. En outre, l’observation d’une population neuronale spécifique dans laquelle un récepteur de phéromone particulier a été marqué par la protéine fluorescente verte (GFP) montre la morphologie neuronale conservée : des neurones présentant des corps cellulaires petits et ovales, ainsi que de longs dendrites atteignant la surface de la lumière et se terminant par des microvillosités, peuvent être observés en travaillant dans une pièce sombre.Incuber les tranches de VNO dans une solution de chargement composée d'ACSF froid avec sept micromoles d'URA 2:00 AM et 0,1 % de ionique pendant une heure à 37 degrés Celsius après une heure. Conserver les tranches chargées sur de la glace avec oxygénation au gaz carbonique jusqu'à utilisation. Utiliser un pinceau pour placer les tranches chargées dans une chambre de perfusion contenant de l'ACSF et fixer les tranches à l'aide d'un ancrage pour tranches de tissu.Placez la chambre de perfusion sur la platine du microscope d’un dispositif d’imagerie calcique et effectuez une perfusion continue avec du LCR oxygéné-carbonaté à température ambiante. Observez les tranches de VNO chargées en utilisant les longueurs d’onde de fluorescence correspondant au colorant, soit de 340 à 380 nanomètres pour le 4-O-AM. Utilisez le logiciel approprié pour enregistrer les variations du rapport calcique intracellulaire. Un système de perfusion est nécessaire pour induire une stimulation chimique.Ici, une coupe coronale de tissu du VNO provenant d'une souris, dans laquelle la sous-population de neurones exprimant le récepteur phéromonal V1Rb2 exprime également la GFP, est immunomarquée contre la protéine tubuline acétylée, représentée en violet. Des vues à plus fort grossissement de la coupe montrent la préservation de l'intégrité du tissu. Des neurones dotés de longues dendrites sont visibles, s'étendant jusqu'à la surface de la lumière, et l'expression de la protéine structurelle peut être observée au niveau des boutons dendritiques et des microvillosités, en vue d'imagerie calcique.Les tranches de tissu chargées de FU sont d'abord visualisées en contraste de phase Hoffman afin de localiser le champ d'intérêt en partant du vaisseau sanguin, première flèche blanche ; l'observateur progresse lentement vers la lumière, deuxième flèche blanche, puis vers la région neuro-épithéliale. Le corps cellulaire ovalaire du neurone nasal RO. La troisième flèche blanche peut être identifiée par son dite long et fin.La quatrième flèche blanche s'étendant vers la lumière, le bouton dendritique neuronal. La cinquième flèche blanche indique des microvillosités en contact avec les cellules chargées de phéromones RA ; ici, celles-ci sont observées à trois 80 nanomètres, puis illuminées successivement à trois 40 et trois 80 nanomètres, et ce rapport de longueurs d'onde fluorescentes est tracé, correspondant aux variations de calcium intracellulaire dans les neurones sélectionnés, cercles noir, rouge et bleu. Un TP est utilisé pour déterminer la viabilité des neurones.Remarquez la variabilité des réponses calciques observées dans les trois neurones sélectionnés, ainsi le fait que le neurone numéro deux (cercle rouge) ne réponde pas à un TP et sera donc écarté de toute analyse ultérieure. La stimulation chimique est ensuite réalisée à l’aide d’urine et d’un mélange de phéromones murines, en examinant la profondeur de la coupe tissulaire. Une sous-population de neurones exprimant à la fois la GFP et le récepteur V one RRB two peut être localisée.Ici, un neurone exprimant à la fois la GFP et le récepteur V1RB2 est montré aux côtés d'un neurone n'exprimant pas V1RB2. Les deux cellules sont chargées avec URA 2:00 AM et le neurone exprimant V1RB2 présente un pic calcique en réponse à la perfusion du ligand du récepteur, le two he connu. Curieusement, le neurone n'exprimant pas V1RB2 répond également au two hep connu, démontrant la complexité du codage des phéromones dans l'ONV.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire et microdisséquer la souris afin d'isoler l'organe cochléaire pour préparer des tranches de tissu aiguës. Ce protocole peut également être adapté à des investigations physiologiques utilisant d'autres colorants calciques et différents montages microscopiques. Bonne chance dans votre expérience.

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