Name: Conception dun bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Découvrez la conception d'un bioréacteur à pression cyclique pour étudier la mécanobiologie des valves cardiaques aortiques ex vivo. Cette méthode permet d'analyser les réponses biologiques tissulaires.

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Les auteurs sont reconnaissants à Shad Schipke et Daniel Chesser pour leur aide à la conception et la fabrication du système et Myles Valtresa de l&#39;aide pour la préparation du manuscrit.

1. Récolte et préparation des tissus <ol><li> Valves aortiques doivent être prélevés sur des porcs adultes pesant pas plus de £ 120 immédiatement après la mort. </li><li> Lavez les vannes à deux reprises avec une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS) et le transport au laboratoire sur la glace. </li><li> Toutes les étapes suivantes devraient être effectuées dans des conditions stériles. </li><li> Assurez-vous que des tracts ne montrent aucun signe de dégénérescence, déchirure ou de calcification. Retirer des tracts de la racine aortique en coupant 1 / 3 de la distance de l'anneau. </li><li> Placez des dépliants dans les puits individuels d'une plaque de six puits et incuber pendant la nuit avec 3ml de Dulbecco Modified Eagle Médium complété avec une solution anti-biotic/anti-mycotic 1% et 10% de sérum fœtal bovin à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Comme alternative, les cellules isolées peuvent être ensemencées dans des plaques de culture à six puits et utilisée dans le dispositif de pression. L'isolement des cellules endothéliales et les cellules de soupape interstitielle peut être effectuée comme décrit précédemment 13, 14. </li></ol> 2. Les études de pression <ol><li> Un système de pression faits sur mesure a été conçu pour étudier les effets de la pression cyclique mécanobiologique sur le tissu de la valve aortique 15. </li><li> Connectez-vous à l'ordinateur et ouvrez le programme LabVIEW (Figure 1). </li><li> Calibrage: <ol><li> Avant l'expérimentation, le système doit être correctement étalonné. </li><li> Branchez l'alimentation sur le circuit. Ceci fournit la puissance aux électrovannes qui contrôlent le flux d'air entrant et sortant de la chambre. </li><li> Assurez-vous que l'air comprimé est connecté au système et ouvrir l'alimentation en air à la vitesse plein. </li><li> Allumez l'amplificateur de signal. Assurez-vous que la lecture de tension est de 0,00. Ajustez si nécessaire </li><li> L'interface LabVIEW a un commutateur marqué «TEST / RECORD". Assurez-vous que le commutateur est réglé sur "TEST". Cliquez sur le bouton marqué "Air Supply" pour ouvrir l'électrovanne d'admission. </li><li> En utilisant le régulateur de pression de gaz, sous pression de la chambre à air comprimé à 1 PSI. La pression dans la chambre peut être lu en utilisant le manomètre numérique situé à l'arrière plaque d'extrémité de la chambre. Une fois que la pression a équilibré, d'enregistrer la lecture de tension de l'amplificateur de signal. Répétez l'opération pour PSI 2, 3, 4 et 5. </li><li> Construire une courbe d'étalonnage de pression fonction de la tension. La pression doit être converti à partir PSI mmHg. L'équation à partir du graphique peuvent être placés dans le code du programme LabVIEW </li></ol></li><li> Retirez la plaque avant en aluminium de la chambre de pression et de pulvérisation de la chambre avec 70% d'éthanol. Laisser un minimum de 10 minutes pour permettre à des vapeurs d'éthanol résiduel se dissipe. </li><li> Placer la plaque de six puits contenant les échantillons dépliant dans la chambre et de remplacer la plaque frontale. S'assurer que le joint est étanche par serrage des écrous situés sur les quatre tiges filetées (situés à chaque coin de la plaque d'extrémité) à la main. Placez la chambre de pression dans l'incubateur 37 ° C. Un diagramme schématique de la chambre de pression est montré dans la figure 2. </li><li> L'interface invite l'utilisateur à fournir la quantité de temps entre les cycles du système d'air comprimé d'entrée et de sortie. Ceux-ci devraient être mis à 0.6s et 0.4s pour imiter les conditions systolique et diastolique, respectivement, à une fréquence de 1Hz. L'utilisateur doit également entrer un chemin vers le fichier de données. </li><li> Dans LabVIEW, cliquez sur Exécuter et passer le «TEST / RECORD" toggle pour "enregistrer". </li><li> Assurez-vous que la pression est au niveau souhaité à l'aide du graphique de l'interface LabVIEW. La pression peut être ajustée en utilisant le régulateur de pression de gaz. </li><li> Exécutez le programme pour la longueur de temps désirée. </li><li> Une fois l'expérience terminée, cliquez sur le bouton d'arrêt sur LabVIEW, éteignez l'alimentation en air et d'ouvrir la soupape d'échappement sur la chambre de pression. </li><li> Retirer la plaque d'extrémité avant de la chambre et récupérer des échantillons de plaque de six puits contenant. Les échantillons peuvent maintenant être analysées pour l'expression des gènes, l'expression des protéines, l'histologie, les propriétés mécaniques etc </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Le système de pression est capable de simuler les pressions maximales observées sous transvalvulaire normotendus, de phase I et II des conditions hypertendus. Cependant, la pression n'a pas été capable d'imiter le gradient de pression systolique, qui est essentiellement nul in vivo. Fréquence est maintenue à 1Hz, avec un temps d'entrée d'air de 0,6 s et un temps d'échappement de 0,4 s. Courbes de pression représentant des conditions de pression normales et élevées obtenues par le système peut être vu dans la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1: Capture d'écran de l'interface LabVIEW. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="Figure 2"> Figure 2: Schéma de la vue la pression chambre A. isométrique de la chambre de pression; B. Vue latérale de la chambre de pression;C. Vue du haut de la chambre de pression. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="Figure 3"> Figure 3: Graphe de simulation de pression dans la chambre de pression en (A) normotendus, (B) Stade I hypertendus, et (C) Phase II des conditions hypertendus.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le système de pression avec succès exposés tracts valve aortique à des pressions cycliques qui sont représentatifs de la pression diastolique transvalvulaire. Toutefois, il n&#39;a pas été capable d&#39;imiter la pression systolique transvalvulaire, comme la seule pression a chuté à 40 mmHg. Pression transvalvulaire est la différence entre la pression dans l&#39;aorte ascendante et le ventricule gauche. Pendant la diastole, lorsque le clapet est fermé, la différence de pression est 80mmHg dans des conditions normotendus...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Sigma </td><td> D5652 </td><td></td></tr><tr><td> Solution Anti-mycotic/antibiotic </td><td> Sigma </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Vannes à membrane Viton électrovanne </td><td> McMaster Carr </td><td> 4868K11 </td><td></td></tr><tr><td> Capteur de pression </td><td> Omega Engineering, Inc </td><td> PX302-200GV </td><td></td></tr><tr><td> Conditionneur de cellule de charge </td><td> Encore Electronics, Inc </td><td> 4025-101 </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition de données (DAQ) Module </td><td> Measurement Computing </td><td> PMD1608 </td><td></td></tr></tbody></table>

conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique ex vivo Étude des valves cardiaques aortiques

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

La valve aortique, situé entre le ventricule gauche et l&#39;aorte, permet la circulation sanguine unidirectionnelle, en prévenant le refoulement dans le ventricule. Des tracts de la valve aortique sont composés de cellules interstitielles en suspension dans une matrice extracellulaire (MEC) et sont bordées d&#39;une monocouche de cellules endothéliales. La vanne résiste à un environnement difficile et dynamique et est constamment exposée à de cisaillement, de flexion, la tension et de compression. La recherche a montré des lésions calcifiées dans les valves malades se produisent dans les zones de fortes contraintes mécaniques en raison de perturbations ou dommages endothéliales matrice interstitielle 1-3. Par conséquent, il n&#39;est pas surprenant que les études épidémiologiques ont montré une pression artérielle élevée est un facteur de risque important dans l&#39;apparition de la maladie de valve aortique 4. La seule option de traitement actuellement disponibles pour la maladie de valve est le remplacement chirurgical de la valve malade par une valve mécanique ou bioprothèse 5. Une meilleure compréhension de la biologie de soupape en réponse à des stress physiques aiderait élucider les mécanismes de la pathogenèse de la vanne. En retour, cela pourrait aider dans le développement de thérapies non invasives telles que l&#39;intervention pharmaceutique ou de prévention. Bioréacteurs Plusieurs ont déjà été développés pour étudier la mécanobiologie des valves cardiaques natives ou conçu 6-9. Bioréacteurs pulsatile ont également été développées pour étudier une gamme de tissus, y compris le cartilage 10, 11 os et de la vessie 12. Le but de ce travail était de développer un système de pression cyclique qui pourrait être utilisée pour élucider la réponse biologique de tracts de la valve aortique à des charges de pression accrue. Le système se composait d&#39;une chambre d&#39;acrylique dans lequel placer des échantillons et de produire une pression cyclique, vannes à membrane viton électrovannes pour contrôler la synchronisation du cycle de pression, et un ordinateur pour contrôler des appareils électriques. La pression a été contrôlée à l&#39;aide d&#39;un transducteur de pression, et le signal a été conditionné à l&#39;aide d&#39;un conditionneur cellule de charge. Un programme LabVIEW réglementées utilisant la pression d&#39;un périphérique analogique à la pompe à air comprimé dans le système au taux approprié. Le système a imité les niveaux dynamiques de pression transvalvulaire associés à la valve aortique, une vague en dents de scie produit une augmentation progressive de la pression, typique du gradient de pression transvalvulaire qui est présent à travers la vanne pendant la diastole, suivie d&#39;une forte chute de pression représentant ouverture de la vanne de systole. Le programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l&#39;ampleur et la fréquence de la pression cyclique. Le système a été en mesure de soumettre des échantillons de tissus à des conditions de pression physiologique et pathologique. Ce dispositif peut être utilisé pour accroître notre compréhension de la façon dont les valves cardiaques de réagir aux changements dans l&#39;environnement local mécanique.

Un bioréacteur pression cyclique capable de soumettre des tissus de valves cardiaques à des conditions de pression physiologique et pathologique a été conçu. Un programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l&#39;ampleur de pression, l&#39;amplitude et la fréquence. Ce dispositif peut être utilisé pour étudier la mécanobiologie des tissus de valves cardiaques ou des cellules isolées.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

La valve aortique, située entre le ventricule gauche et l'aorte, permet un flux sanguin unidirectionnel, empêchant ainsi le reflux vers le ventricule. Aortique ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la réponse biologique du tissu valvulaire aortique ou de cellules à une pression cyclique. Cela est réalisé en isolant d'abord le tissu valvulaire provenant de cœurs présentant un mauvais signe, puis en l'incubant dans un milieu de culture tissulaire toute la nuit. La deuxième étape de la procédure consiste à s'assurer que le système de pression est correctement étalonné. Suivant.Le tissu ou les cellules valvulaires sont placés dans le système de pression. La chambre est placée dans un incubateur à 37 degrés Celsius et le régime de pression cyclique est initié pendant la durée souhaitée, à l'amplitude et à la fréquence désirées. Enfin, le tissu est retiré du système pour une analyse biologique.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent comment une pression élevée affecte l'expression des gènes et des protéines par PCR en temps réel, immunoblot ou microscopie. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes capables de séparer les effets de la pression mécanique des autres forces mécaniques et des stimulants biochimiques. Cet avantage est supérieur à celui d'autres techniques telles que les modèles animaux, bien que celle-ci puisse nous aider à comprendre la manière dont les forces mécaniques influencent la biologie et la pathogenèse des valves cardiaques.Il peut également être utilisé pour développer des constructions issues du génie tissulaire. Toy Fate, étudiante diplômée dans mon laboratoire, nous démontre actuellement cette procédure afin de préparer le tissu sous pression.Les études prélèvent des valves aortiques de porcs femelles adultes pesant au plus 120 livres immédiatement après la mort. Laver les valves deux fois avec du PBS stérile, puis les placer sur de la glace et les transporter au laboratoire. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées en conditions stériles.Veiller à ce que les feuillets ne présentent aucun signe de dégénérescence, de déchirure ou de calcification. Retirer les feuillets de la racine aortique en coupant au tiers de la distance à partir de l'anneau. Placer les feuillets dans des puits individuels d'une plaque à six puits et les incuber avec trois millilitres de DMEM supplémenté d'une solution antibiotique antimycotique à 1 % et de 10 % de sérum de veau fœtal, pendant une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ce système de pression est sur mesure et a été conçu pour étudier les effets mécanobiologiques de la pression cyclique sur le tissu de la valve aortique. Pour utiliser le système, connectez-vous à l'ordinateur et ouvrez le programme LabVIEW. Vérifiez que l'air comprimé est raccordé au système et ouvrez l'alimentation en air à pleine vitesse.Activez l'amplificateur de signal. Assurez-vous que la lecture de tension est de 0,00. Ajustez si nécessaire.L'interface de vue du laboratoire possède un interrupteur marqué « test record », l’interrupteur étant positionné sur « test ». Cliquez sur le bouton marqué « air supply » pour ouvrir la vanne solénoïde d'entrée. À l’aide du régulateur de pression de gaz, comprimez l’enceinte avec de l’air comprimé à une livre par pouce carré. Lisez la pression dans l’enceinte à l’aide du manomètre numérique situé sur la plaque arrière de l’enceinte.Une fois que la pression a atteint l'équilibre, enregistrez la valeur de tension fournie par l'amplificateur de signal. Répétez l'opération pour 2, 3, 4 et cinq PSI. Ensuite, établissez une courbe d'étalonnage de la pression en fonction de la tension.Convertissez la pression de PSI en millimètres de mercure. Saisissez l'équation provenant du graphique dans le code du programme LabVIEW. Retirez la plaque frontale en aluminium de la chambre à pression et pulvérisez l'intérieur de la chambre avec de l'éthanol à 70 %.Placer la plaque à six puits contenant les échantillons de feuillet dans la chambre et remettre en place la plaque avant. S'assurer que le joint est étanche en serrant à la main les écrous situés sur les quatre tiges filetées. Placer la chambre sous pression dans l'incubateur à 37 degrés Celsius.Indiquez la durée pendant laquelle le système alterne entre l'entrée et la sortie d'air comprimé. Ces durées doivent être réglées à 0,6 seconde et 0,4 seconde pour imiter respectivement les conditions diastolique et systolique à une fréquence d'un hertz. Ensuite, saisissez un chemin de fichier de données dans LabVIEW.Cliquez sur exécuter et activez l'option d'enregistrement du test. Vérifiez que la pression est au niveau souhaité à l'aide du graphique sur l'interface LabVIEW. Si nécessaire, ajustez la pression à l'aide du régulateur de pression du gaz.Une fois l'expérience terminée, cliquez sur arrêter dans la vue du laboratoire, arrêtez l'alimentation en air et ouvrez la vanne d'évacuation sur la chambre de pression. Récupérez enfin le système de pression depuis l'incubateur. Retirez ensuite la plaque frontale de la chambre et récupérez la plaque de six puits.Les échantillons peuvent désormais être analysés pour l'expression génique, l'expression protéique, l'histologie et les propriétés mécaniques représentant les formes d'onde de pression normales et élevées. Les conditions obtenues à partir du système sont présentées ici dans des conditions in vivo. Il existe une différence de pression entre le ventricule gauche et l'aorte ascendante pendant la diastole, ce qui permet à la valve aortique de rester fermée dans des conditions physiologiques normales.Cette pression transvalvulaire est de 80 millimètres de mercure. Toutefois, lors de l'hypertension de stade un et de stade deux, la pression transvalvulaire peut augmenter respectivement à 90 et 100 millimètres de mercure. Le système de pression est capable de simuler les pressions transvalvulaires maximales observées dans des conditions normales, ainsi que sous hypertension de stade un et de stade deux.Des formes d'onde de pression représentatives dans des conditions de pression normale et élevée, obtenues à partir du système, sont montrées ici. Ainsi, en suivant cette procédure, nous sommes en mesure d'effectuer d'autres méthodes telles que la PCR, le Western blot et la microscopie sur les feuillets. Cela nous aide à comprendre des phénomènes tels que les changements d'expression génique et de synthèse protéique, et nous permet de mieux comprendre la transduction mécanique dans les valves cardiaques.Cette technique s'est révélée très utile pour nous aider à comprendre la biologie mécanique et les mécanismes des maladies, et elle a pu, ou pourra à l'avenir, nous aider à comprendre les modifications qui surviennent dans d'autres tissus susceptibles de subir des variations de pression in vivo.

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Protocole pour l&#39;évaluation hydrodynamique relative de Vannes polymères tri-leaflet

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Nous décrivons un interne conçu in vitro chambre modèle d’écoulement, qui permet à l’enquête de l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus.

Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

La régurgitation aortique est une maladie cardiaque valvulaire aortique. Ce manuscrit démontre comment l’imagerie par résonance magnétique à flux quadridimensionnel peut évaluer la régurgitation aortique à l’aide de valves cardiaques in vitro imitant la régurgitation aortique.

In vitro Évaluation de la régurgitation aortique à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique à flux quadridimensionnel

Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.

Conception d’un bioréacteur pour améliorer l’acquisition de données et modéliser le débit des tissus cardiaques modifiés

Ce protocole présente la mise en place et le fonctionnement d’un bioréacteur nouvellement développé, imprimé en 3D, pour la culture ex vivo de vaisseaux sanguins en perfusion. Le système est conçu pour être facilement adopté par d’autres utilisateurs, pratique, abordable et adaptable à différentes applications expérimentales, telles que la biologie fondamentale et les études pharmacologiques.

Ex Vivo Culture de perfusion de gros vaisseaux sanguins dans un bioréacteur imprimé en 3D

Nous présentons une méthode de montage d’une valve aortique porcine sur un duplicateur d’impulsions afin de tester ses propriétés hydrodynamiques. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer le changement de l’hydrodynamique après l’application d’une procédure expérimentale ou d’un nouveau dispositif médical avant son utilisation dans un modèle animal de grande taille.

Un modèle porcin ex vivo pour les essais hydrodynamiques de procédures expérimentales de valvules aortiques et de nouveaux dispositifs médicaux

Découvrez la conception d'un bioréacteur à pression cyclique pour étudier la mécanobiologie des valves cardiaques aortiques ex vivo. Cette méthode permet d'analyser les réponses biologiques tissulaires.

Conception d'un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

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