Colorectal Cancer Cell Surface Protein profilage utilisant une biopuces d'anticorps et de multiplexage par fluorescence

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser le microréseau d'anticorps DOT scan pour établir un profil moléculaire des antigènes de surface présents dans les tissus atteints de cancer colorectal. En outre, un multiplexage fluorescent est utilisé pour distinguer les types cellulaires possédant des profils spécifiques au sein d'une population mixte. Les antigènes du cluster de différenciation, ou antigènes CD, ont été identifiés comme des biomarqueurs pronostiques ou métastatiques potentiels dans le cancer colorectal.

Ces antigènes constituent des biomarqueurs idéaux, car leur expression varie souvent en fonction de la progression tumorale ou des interactions avec d'autres types cellulaires. Dans cette vidéo, nous utilisons le micro-réseau d'anticorps DOT scan pour capturer des cellules vivantes via les antigènes membranaires exprimés. Le micro-réseau d'anticorps DOT scan est constitué d'une lame de verre recouverte d'une couche de nitrocellulose.

Le panneau de microréseaux d'anticorps DOT scan est délimité par des points d'alignement composés des CD29 et CD44. Des réseaux en double sont également disposés de chaque côté du réseau. Le premier panneau comprend les 82 anticorps d'origine du microréseau de leucémie DOT scan, et 40 anticorps supplémentaires ont été sélectionnés en fonction de leur potentiel pronostique pour former le microréseau satellite du cancer colorectal.

Et le dernier panneau comprend des anticorps contrôles de type isotopique. Ici, le tissu de cancer colorectal et la muqueuse intestinale normale sont digérés et filtrés afin d'obtenir une suspension viable de cellules individuelles. Cette suspension peut être congelée ou conservée pour une utilisation ultérieure.

La suspension cellulaire est utilisée pour la capture des cellules sur un micro-réseau d'anticorps DOT scan ; les antigènes exprimés sur différents sous-types cellulaires sont caractérisés par multiplexage fluorescent. Les profils d'expression obtenus montrent un changement significatif de l'expression des antigènes entre les cellules de cancer colorectal et la muqueuse intestinale normale. Cette différence se reflète également dans la population de leucocytes associée à la tumeur.

Le regroupement hiérarchique de plusieurs profils de tumeurs montre un regroupement des signatures de la maladie selon les stades du cancer colorectal. Bonjour, je suis Jerry de l'École des biosciences moléculaires de l'Université de Sydney en Australie, et aujourd'hui je vais vous montrer une expérience permettant le profilage des antigènes de surface sur des tissus de cancer colorectal. À l'aide d'une matrice microdistribuée d'anticorps avec multiplexage par fluorescence, ces matrices microdistribuées permettent le profilage d'environ 140 antigènes de surface sur des cellules cancéreuses vivantes accompagnées de leucocytes inflammatoires.

Des sous-ensembles de cellules capturés sur des puces à ADN peuvent être distingués à l'aide d'anticorps marqués par un fluorochrome qui se lient à un antigène marqueur fortement exprimé sur les cellules d'intérêt. Jusqu'à trois sous-ensembles différents de cellules peuvent être caractérisés sur une seule puce à ADN en utilisant des marquages fluorescents appropriés sur des anticorps présentant trois spécificités différentes. Le test de puce à ADN DOT scan est une méthode relativement simple et a déjà été utilisé pour le profilage de la surface cellulaire dans plusieurs types de cancers.

Une caractéristique essentielle du scan DOT est sa capacité à capturer des cellules vivantes via leurs antigènes de surface, de sorte que le profil d'interaction obtenu reflète le phénotype de surface de la cellule. Les antigènes de surface jouent un rôle important dans le développement tumoral, les métastases et la réponse inflammatoire destinée à combattre le cancer. Des profils de surface détaillés, ou phénotypes immunologiques, peuvent être utilisés comme signatures de maladie afin d'améliorer la classification des cancers, permettant ainsi un traitement optimal après la chirurgie.

Très bien, commençons. Dans l'expérience présentée ici, des échantillons tumoraux cliniques de cancer colorectal, de grades A à D, sont recueillis dans un tampon de Hank. Pour commencer, à l'aide de deux scalpels, couper soigneusement la tumeur en tranches d'un millimètre d'épaisseur.

Placer les tranches dans une solution de collagénase de type IV à 2 % et d'ADN à 10 % pour la digestion. Des sections de muqueuse intestinale normale provenant du même patient sont prélevées à 10 centimètres du site de la tumeur primitive. Ceci sert de témoin et est traité de manière identique à l'échantillon tumoral.

La digestion tumorale a lieu à 37 degrés Celsius pendant une heure afin de favoriser la dégradation du tissu conjonctif ; les D ns dégradent l'ADN provenant des cellules endommagées. Après l'incubation, la suspension tissulaire est filtrée à travers une passoire métallique, en rinçant avec du tampon de Hanks, tandis qu'un piston de seringue de 10 ml est utilisé pour aider à faire passer les cellules à travers la passoire. Ce processus est répété plusieurs fois jusqu'à ce que la majorité des cellules aient traversé le maillage métallique.

Le tamis sépare les cellules de tout tissu conjonctif non digéré. Ensuite, filtrer davantage la suspension cellulaire en l'aspirant dans une seringue de 10 M et en la faisant passer à travers un filtre fcon de 200 micromètres, suivi d'un filtre fil con de 50 micromètres. Ces filtres plus fins doivent permettre l'élimination de l'excès de mucus ou d'ADN, ainsi que la dissociation des agrégats cellulaires afin d'obtenir une suspension monocellulaire viable.

Le même traitement est effectué pour la muqueuse normale. Nous avons observé que la muqueuse normale a tendance à contenir plus de tissu conjonctif et nécessite donc quelques lavages supplémentaires pour être filtrée à travers une maille, puis centrifugée afin d'obtenir une suspension cellulaire à 410 ×g pendant cinq minutes à 20 °C. En prévision du stockage à froid, nous suspendons le culot cellulaire dans 750 µL de sérum de veau fœtal, suivi de volumes équivalents de sérum de veau fœtal contenant du DMSO.

Ajouter la solution à ce DMS de manière goutte à goutte avec un mélange constant, puis prélever l'aliquote du surnageant dans un tube cryogénique et placer dans un contenant isolant. Ces échantillons peuvent être conservés à moins 80 pendant une durée allant jusqu'à un an.

L'isolant et le DMSO doivent garantir une congélation lente des cellules sans rupture. Un effet secondaire du stockage est la lyse de la population de globules rouges. Heureusement pour nous, ceux-ci ne sont pas nécessaires.

Pour l'expérience, sortez les échantillons du stockage et jetez-les rapidement. Dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, remettez en suspension la suspension cellulaire dans 10 mL de tampon de Hank ; le tampon doit aider à diluer le DMSO à 10 % et le sérum de veau fœtal. Incubez les cellules pendant cinq minutes à 410 ×g et à 20 degrés Celsius.

Ensuite, décantez le surnageant et resuspendez-le dans 500 microlitres de tampon de Hank ; quelques cellules peuvent être lysées au cours du processus de congélation et de décongélation, provoquant une libération d'ADN dans la suspension. Pour remédier à ce problème, incubez l'échantillon avec 0,1 % d'ADNase à température ambiante. Pendant cette période, un décompte de la viabilité cellulaire peut être effectué.

Mélanger des quantités égales de bleu de tripan avec 10 microlitres de suspension cellulaire et pipeter 10 microlitres du mélange dans un compteur de cellules. Au microscope, les cellules saines et viables apparaissent transparentes. En revanche, les cellules non viables, dont les membranes sont altérées, apparaissent bleues.

Un minimum de 4 millions de cellules viables est requis pour la capture cellulaire sur l'anticorps DOT scan. MICRORAY en chute. Le traitement par ADN a lavé les cellules une deuxième fois avec 10 mils de tampon de Hank, puis centrifugé à 410 ×g pendant cinq minutes à 20 °C.

Nous suspendons la palette cellulaire finale dans 200 microlitres de milieu RPMI. Ce milieu contient relativement plus de nutriments que le tampon de Hanks et est utilisé pour faciliter la capture des cellules sur le micro-réseau d'anticorps tout en maintenant la viabilité cellulaire. Le micro-réseau d'anticorps pour l'analyse par points du cancer colorectal est composé de 140 points d'anticorps différents, dupliqués sur la nitrocellulose.

Chaque point sur le réseau contient 10 nanolitres d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène de surface cellulaire. Pour préparer le réseau d'anticorps, plongez-le dans un bac de PBS afin d'humidifier la nitrocellulose, puis essuyez le bord en verre du réseau. À l'aide de lingettes Kim, prenez soin de ne pas toucher la section en nitrocellulose, placez le réseau microarray dans un bac et déposez au pipetage la suspension cellulaire sur la nitrocellulose.

Une répartition uniforme de la suspension cellulaire garantira que tous les anticorps puissent potentiellement capturer des cellules. Incubez la matrice de puces à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant l'incubation, différentes cellules descendront progressivement et entreront en contact avec les anticorps présents sur les cellules de la matrice.

La présentation d'antigènes membranaires correspondant à son anticorps permettra la liaison et la capture de la cellule après incubation. Éliminer les cellules non liées en plongeant délicatement les puces dans trois bains frais de PPS. Fixer les cellules fixées à 10 % par rapport à la hauteur extérieure et à la solution de PPS.

Verse doucement une quantité généreuse de fixatif pour couvrir la section chargée de la membrane nitrocellulosique. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, plonger les puces microarray trois fois dans du PBS frais.

Laisser les puces tremper dans le PBS pendant 30 secondes à chaque lavage, car un excès de hauteur peut interférer avec la multiplexion de la fluorescence. Nous pouvons maintenant vérifier la fixation cellulaire en plaçant une micropuce sous une source de lumière pour une analyse beaucoup plus précise. Le scanner DOT et le logiciel d'analyse permettent de numériser le profil de fixation et de produire des résultats quantifiés d'expression des antigènes dans une population cellulaire mixte.

Le logiciel compare l'intensité de la liaison cellulaire au bruit de fond sur une échelle de grains de 8 bits. Les unités d'intensité sont normalisées à une valeur maximale de 256. Pour faciliter la comparaison entre un réseau, toute liaison positive du témoin de type glace est soustraite des anticorps portant les isotopes IG correspondants.

Ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage sur la puce à ADN et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. En prévision d'une multiplexion par fluorescence, ajoutez dans 118 microlitres de tampon de blocage 10 microlitres d'anticorps marqués au colorant « fiery » dirigés contre le CD3 conjugué et 20 microlitres d'EpAM conjugués à l’Alexa. En outre, ajoutez également deux microlitres de sérum inactivé à une telle préparation afin d'éviter les liaisons non spécifiques.

Une fois le blocage terminé, le tampon de blocage est remplacé par la solution de multiplexage et incubé à l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, les trois anticorps conjugués se lieront aux lymphocytes T exprimant CD trois fixés sur le réseau, tandis que l'anticorps conjugué à EPAM se liera aux cellules épithéliales ou aux cellules de cancer colorectal présentes sur le réseau. Ensuite, rincez le réseau micro trois fois dans du PBS frais, laissez-les sécher à l’obscurité avant de procéder à la détection de la fluorescence.

La détection de la fluorescence s'effectue à l'aide d'un scanner Typhoon FLA 9 000 cd. Le profil FICO ery est scanné en utilisant un laser de 523 nanomètres et un filtre d'émission 580 BP 30 EP camm Alexa 647, tandis qu'Alexa 647 est scanné en utilisant un laser de 633 nanomètres et un filtre d'émission 670 BP 30. Les images de fluorescence obtenues sont converties au format tip pour analyse.

À l'aide d'un logiciel d'analyse DOT. Le multiplexage fluorescent nous permet de distinguer les profils d'antigènes de différentes populations cellulaires au sein d'un même échantillon tissulaire. Les images présentées ici proviennent d'un échantillon de cancer colorectal.

Ces trois images sont respectivement une analyse optique, une analyse de fluorescence pour les cellules exprimant CD trois et une analyse de fluorescence pour les cellules exprimant EPAM. Les résultats du microréseau DOT doivent montrer des profils de liaison cellulaire cohérents entre les deux lames identiques. Une liaison intense des points d'alignement le long du bord de la lame indique qu'une quantité suffisante de cellules a été capturée.

Un rapport PDF peut être généré pour fournir des valeurs quantitatives de la liaison cellulaire. Le graphique en barres. La représentation de la liaison cellulaire montre une différence d'expression des antigènes entre la muqueuse normale et l'échantillon tumoral.

Les résultats optiques offrent une représentation globale de l'expression des antigènes sur l'ensemble des types cellulaires présents dans l'échantillon, tandis que les résultats de multiplexage AAM montrent une image plus précise des différences d'expression des antigènes entre les cellules épithéliales normales et les cellules cancéreuses. Bien que bon nombre des antigènes exprimés de manière différentielle soient des biomarqueurs connus du cancer colorectal pris individuellement, ensemble ils fournissent une signature de la maladie nettement plus précise pour la stratification que ne pourrait jamais l'atteindre un seul biomarqueur. Les résultats de multiplexage CD trois révèlent une présence accrue de lymphocytes T dans l'échantillon cancéreux par rapport à l'échantillon normal.

Souvent, les lymphocytes T provenant du cancer expriment des marqueurs d'activation, ce qui suggère que ces cellules T pourraient être des lymphocytes infiltrant la tumeur ou des lymphocytes T associés à l'inflammation. Une analyse à grande échelle peut être réalisée à l'aide du logiciel gratuit Multi Experiment Viewer version 4.4, dédié à la création de cartes thermiques et à l'analyse de données. Le regroupement hiérarchique des échantillons de cancer colorectal peut être utilisé afin de rechercher une corrélation avec le stade de la maladie ou le pronostic du patient.

Une vaste bibliothèque de signatures de maladies constitue un outil précieux pour la prédiction du pronostic chez les patients atteints de cancer colorectal ou pour la détermination du traitement postopératoire à suivre. Nous venons de présenter notre procédure d'analyse de l'expression des antigènes de surface dans une population cellulaire mixte issue de tissu tumoral colorectal, en utilisant le microréseau d'anticorps DOT scan et la multiplexion par fluorescence. Un aspect important à retenir dans cette expérience est d'utiliser toujours un tissu frais et d'obtenir au moins 4 millions de cellules viables pour que l'expérience fonctionne. Merci d'avoir regardé cette vidéo et bonne chance dans vos expériences.