Name: Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez un dosage sanguin entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries par bioluminescence en temps réel. Cette méthode évalue les interactions hôte-pathogène dans la tuberculose.

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Ce travail a été financé par des bourses personnelles par le Wellcome Trust à Beate Kampmann (056608, GRO77273).

1. Préparation de stock BCG journaliste Lux mycobactéries <ol><li> Cultivez le BCG lux (M. bovis BCG Montréal souche transformée avec le plasmide navette pSMT1) avec agitation à 200rpm à la mi-logarithmique de phase dans le bouillon Middlebrook 7H9 contenant 0,2% de glycérol, 0,05% tween 80 et 10% d'enrichissement ADC. </li><li> Préparer 1 ml d'une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire. </li><li> Chargez le tube contenant du N-décyle aldéhyde (substrat de l'enzyme luciférase) sur le dos de la machine et s'assurer que le couvercle est sécurisé et les tubes en place. </li><li> Premier luminomètre injecteur avec substrat par l'intermédiaire du programme Prime, mis à injecter 100 UCL x 3 dans chacun des trois tubes vides d'amorçage placés dans le luminomètre. </li><li> Chargez les 2 tubes dans le luminomètre et prendre des lectures à travers un programme fixé à l'injection de 100 UCL de substrat dans chaque tube et lire pendant 20 sec dans des intervalles de 1 sec. </li><li> Lorsque le stock a atteint 1x10 8 RLU / ml à 2x10 8 RLU / ml (cela prend environ 3-4 jours de croissance), ajouter un volume égal de glycérol 30% stérile à la culture dans un tube 50ml Falcon et mélanger délicatement. </li><li> Aliquoter 1.5ml volumes dans 2ml étiquetés à bouchon à vis microtube et stocker à -80 ° C. </li></ol> 2. Déterminer des stocks RLU / UFC de corrélation et le contenu des aliquotes <ol><li> Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent. </li><li> Ajouter 15μl d'hygromycine et 30μl de Tween 20%. </li><li> Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante (TA) dans l'armoire de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon. </li><li> Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 4 jours. </li><li> Chaque jour, maquillage série 10 dilutions (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 et 1:100.000) pour la détermination UFC. </li><li> Mettre en place les mêmes dilutions en parallèle et en double pour déterminer la luminescence (voir partie 1.2 à 1.6). </li><li> Préparer deux plaques à 3 compartiments de Middlebrook 7H11 agar (1 l de milieu liquide contenant du glycérol 0,5%, 10% de supplément OADC, 1 ml de Tween 20% et 1 ml d'hygromycine). </li><li> Plaque à 100 ul de chaque dilution sur un segment de chaque plaque à l'aide épandeurs séparée, en distribuant le liquide de manière égale entre la chambre individuelle. </li><li> Sceau de chaque plaque avec du parafilm, placer dans un sac en plastique stérile, sceller avec du ruban autoclave, et incuber à 37 ° C pendant 2 semaines avec des couvercles vers le bas. </li><li> Inspectez régulièrement jusqu'à UFC apparaissent (2-3 semaines). </li><li> Pour compter les colonies, enlever les plaques de l'incubateur et le placer sur un compteur de colonies. Calculer la moyenne pour chaque dilution des plaques en double. </li><li> Calculer le rapport RLU / UFC aide équivalente RLU et UFC pour chaque dilution. Le ratio devrait se situer entre 3 et 5 RLU / UFC. </li></ol> 3. Préparation du BCG Lux culture pour l'inoculation dans le sang total <ol><li> Ajouter 15 ml de milieu Middlebrook 7H9 la culture avec supplément ADC 10% à un erlenmeyer 200ml avec un bouchon à évent. </li><li> Ajouter 15μl d'hygromycine et 30μl de Tween 20%. </li><li> Retirer un flacon de BCG Lux du congélateur et décongeler à température ambiante dans l'enceinte de sécurité. Ajouter le contenu du flacon sur le support et serrer le bouchon. </li><li> Incuber sous agitation à 200rpm à 37 ° C pendant 2 à 4 jours. </li><li> Préparer 1 ml d'une dilution 1:10 de BCG Lux culture dans du PBS stérile dans un tube à luminomètre (900μl de PBS + 100 ul BCG Lux culture), en double exemplaire. </li><li> Luminomètre premier avec le substrat (comme décrit ci-dessus), agiter doucement au vortex les 2 tubes et charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus). </li><li> Utilisez cette lecture afin de diluer le bas de la culture dans du PBS pour donner un équivalent de 7x10 6 RLU (cela donne un inoculum d'environ 2x10 5 UFC / ml de sang et un ratio de BCG pour les monocytes d'environ 1:1, en ​​supposant un nombre de monocytes du A propos de 2x10 5 à 4x10 5 monocytes par ml de sang). </li></ol> 4. Préparation de sang total <ol><li> Prendre 3 à 5 ml de sang veineux dans un tube contenant de l'héparine sans conservateur. </li><li> Transfert du sang dans un tube de 50ml Falcon et diluer avec un volume égal de milieu RPMI 1640 contenant HEPES glutamine et 25 mm (sans stylet / STREP). </li><li> 900μl aliquote de sang diluée dans des tubes en triple Bijou stérile pour chaque point dans le temps (6 tubes au total: 3. 0hrs pour et 3 pour 96h Mettre en place des tubes supplémentaires pour timepoints supplémentaires, si nécessaire. </li><li> 900μl de milieu Aliquoter Middlebrooks la culture 7H9 avec 10% ADC complément hygromycine + 50μg/ml (le même milieu que celui utilisé pour la culture du BCG lux) en double pour les contrôles de croissance. </li><li> Ajouter 100 pi de l'diluée BCG lux à chaque tube de sang, et à la lutte contre une croissance de 2tubes. </li><li> Mélangez bien et placez les 3 bijous pour le 96h de temps-point et les deux contrôles de la croissance de leur côté dans l'incubateur à bascule à 37 ° C, 20 tr / min (CO 2 n'est pas nécessaire). </li></ol> 5. Luminescence de mesure (à 0 HEURES et 96h) <ol><li> Centrifuger les trois bijous à 2000g pendant 10 min. </li><li> Retirez délicatement 300μl de surnageant sans perturber le culot et le placer dans 2ml bouchon à vis Microtubes à geler à -80 ° C pour l'analyse des cytokines suivantes. </li><li> Ajouter 300μl de PBS dans chaque bijou pour remplacer le volume de surnageant retiré. </li><li> Aspirer le contenu de chaque bijou dans le tube 50ml Falcon correspondante et ajouter 8ml eau distillée à chaque tube. Commencez une minuterie de 10 min. NB: Ceci est une étape sensible au temps, et cette incubation ne doit pas être une de plus de 10 min, à partir de quand les cellules entrent les premiers en contact avec l'eau. </li><li> Rincer chaque bijou avec 2 ml d'eau distillée et vortex pendant 5 secondes avant de basculer dans le tube correspondant faucon. </li><li> A la fin de l'incubation de 10 minutes, centrifuger les tubes Falcon à 2000g pendant 10 minutes. </li><li> Décanter le surnageant en désinfectant Surfanios. </li><li> Ajouter quelques perles de verre à chaque boulette et le vortex. </li><li> Ajouter 1ml de PBS stérile dans chaque tube et le vortex. </li><li> Dans les tubes luminomètre, faire des dilutions de 1:10 pour chaque échantillon en double avec du PBS (PBS 900μl échantillon + 100 ul) et au temps de 96h-point. Faire les dilutions de même pour chacun des contrôles de croissance. </li><li> Vortexer doucement les tubes et les charger dans le luminomètre et prendre des lectures (comme décrit ci-dessus) Nb: Lectures entre les triplets de l'échantillon devrait être la même dans les 15% d'une autre. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Il est important d'utiliser des bactéries en phase logarithmique de croissance pour l'ensemble des dosages sanguins lux, soit augmenté au cours 48-72 heures avant l'inoculation des échantillons, que l'activité métabolique n'est pas optimale si l'une des droites du congélateur ou dans la phase stationnaire. La croissance préalable devrait être standardisé pour une série d'expériences soit à 48 ou 72 heures pour éviter la variabilité. La figure 1 montre la courbe de croissance d'une culture de représentant du BCG lux. Le temps de doublement est d'environ 24 heures jusqu'à la phase stationnaire est atteint. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Courbe de croissance représentant du BCG lux pendant 96 heures dans un milieu 7H9 et la corrélation des RLU et UFC. Bien que les valeurs RLU toujours en corrélation avec UFC, le nombre de RLU correspond à une seule UFC peut varier en fonction du stock, ce qui explique pourquoi il est recommandé d'utiliser le même stock congelé à travers une série d'expériences afin de garantir une multiplicité cohérente de l'infection ( MOI). Le tableau 1 montre un exemple de date brute au moment de l'inoculation (T 0) et à 96 heures. Les ratios de croissance sont calculés selon la formule T 96 / T 0, mais d'autres intervalles de temps peuvent bien sûr également être mesurée. Il est toutefois conseillé de ne pas utiliser les cultures au-delà de 96 heures, comme la mort cellulaire significative survient. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Exemple de données brutes au moment de l'inoculation (T0) et à 96 heures (T96) et des ratios de croissance calculé à partir de 3 donneurs adultes. Selon les réponses spécifiques de l'antigène de la mémoire disponible et compter peut-être aussi des neutrophiles, des ratios de croissance varient selon les individus, comme montré ici dans la figure 2 dans le sang des enfants avec et sans infection par le VIH. En moyenne, les jeunes enfants ont des ratios de croissance plus élevés que les adultes, le test cutané à la tuberculine (TCT) + les individus ont des ratios avez de croissance inférieur à TST-ve individus, et les patients infectés ont des ratios de croissance élevé en raison de la carence de la population de lymphocytes T CD4, l'un des médiateurs clés de la réponse immunitaire cellulaire aux mycobactéries. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 Inter-bailleurs variabilité:. Ratios de croissance de T 0 versus 96 heures pour un ensemble de patients, selon le statut VIH sous-jacente. La reproductibilité des ratios de croissance sur une période de temps est montré dans la figure 3, qui résume les résultats de 64 donateurs saigné deux fois sur une période de 12 mois et d'un seul donneur saigné à plusieurs reprises pour des expériences de contrôle. Les causes potentielles de la variabilité pourrait être des changements dans la sensibilisation à mycobactéries ou de la variabilité dans les niveaux de cytokines hôte, comme observé dans les essais biologiques de nombreuses. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. (A) seul donateur à 12 reprises en 12 mois. (B) plusieurs (64) les bailleurs de fonds à 2 reprises sur 12 mois.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont bien implantés dans des modèles animaux, où ils sont appliqués à l&#39;écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l&#39;immunogénicité. La première génération de tests bactéricides humains ont été conçus en utilisant les macrophages seul, infectés par M. tuberculose. UFC a se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Société </td><td> Aucun chat </td></tr><tr><td> BCG Lux </td><td> Divers </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Le bouillon Middlebrook 7H9 </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC enrichissement </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC complément </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-décyle aldéhyde </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> PBS stérile </td><td> Dans Maison </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 avec L-Glutamine, HEPES 25mM </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée stérile </td><td> Dans Maison </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Équipement </td></tr><tr><td> Luminomètre Tube (port injectable obligatoire) </td><td> Berthold LB953 AutoLumat ou mono-tube de luminomètre Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminomètre tubes, 12 x 75mm, pyrex sans monture </td><td> Corning de VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer avec bouchon ventilé, stérile en polycarbonate 250ml </td><td> Corning via Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubes de prélèvement sanguin (sans conservateur héparine) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml tubes Falcon, conique </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin spécimen de polypropylène Bijou tubes </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin universelle des conteneurs (30 ml) </td><td> Laboratoire d&#39;analyse LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Les perles de verre de 2mm de diamètre </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipettes et garçon pipette </td><td> toute </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl et 200 pl Pipettes et pointes à filtre </td><td> toute </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Général du matériel de laboratoire: </td></tr><tr><td> Classe II de sécurité du cabinet du cabinet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Réfrigérateur (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rocking agitateur plateforme (180 0) à mélanger des tubes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitateur incubateur réglé à 37 ° C pour grandir cultures bactériennes </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant reporter-gene tagged bcg ou m. tb (bcg lux / m. tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Tests fonctionnels ont longtemps joué un rôle clé dans la mesure de l&#39;immunogénicité d&#39;un vaccin donné. Ceci est classiquement exprimée que le sérum des titres bactéricides. Etudes de sérum titres bactéricides en réponse aux vaccins infantiles ont permis de développer et valider de coupure niveaux pour des réponses immunitaires protectrices et de tels seuils sont utilisés en routine. Pas de tels dosages ont été prises vers l&#39;avant dans l&#39;évaluation de routine des vaccins qui induisent surtout immunité à médiation cellulaire sous la forme de réponses des lymphocytes T effecteurs, tels que les vaccins contre la tuberculose. Dans le modèle animal, la performance d&#39;un candidat vaccin donné est systématiquement évaluée dans des essais standardisés bactéricides, et tous les courants roman TB-vaccins candidats ont été soumis à cette étape dans leur évaluation préalable à la phase 1 des essais humains. L&#39;évaluation de l&#39;immunogénicité et donc la probabilité de l&#39;efficacité protectrice du roman de vaccins anti-tuberculeux devraient idéalement subir une similaires par étapes d&#39;évaluation dans les modèles humains aujourd&#39;hui, y compris des mesures dans les essais bactéricides. Dosages bactéricides dans le cadre de la recherche sur les vaccins contre la tuberculose sont déjà bien établies dans les modèles animaux, où ils sont appliqués à l&#39;écran des vaccins candidats potentiellement prometteuse. Réduction de la charge bactérienne dans les fonctions de divers organes comme la principale lecture de l&#39;immunogénicité. Cependant, aucune de tels dosages ont été incorporées dans les essais cliniques pour de nouveaux vaccins anti-tuberculeux à ce jour. Bien qu&#39;il reste encore une incertitude sur les mécanismes exacts qui conduisent à la mort de mycobactéries dans les macrophages humains, l&#39;interaction des macrophages et des cellules T avec des mycobactéries est clairement nécessaire. L&#39;essai décrit dans ce document représente une nouvelle génération de dosages bactéricides qui permet des études sur ces principaux composants cellulaires avec tous les autres facteurs cellulaires et humorales présents dans le sang total, sans faire des hypothèses sur leur contribution individuelle relative. Le dosage décrit par notre groupe utilise de faibles volumes de sang total et a déjà été employée dans les études sur les adultes et les enfants dans les paramètres de la tuberculose est endémique. Nous avons montré l&#39;immunogénicité du vaccin BCG, l&#39;augmentation de la croissance des mycobactéries dans les patients séropositifs, ainsi que l&#39;effet de la thérapie anti-rétrovirale et la vitamine D sur la survie des mycobactéries in vitro. Nous résumons ici la méthodologie, et de présenter nos données de reproductibilité en utilisant ce modèle relativement simple, peu coûteuse et conviviale sur le terrain. Remarque: Définitions / Abréviations BCG lux = M. bovis BCG, la souche de Montréal, transformé avec pSMT1 plasmide navette transportant les gènes luxAB de Vibrio harveyi, sous le contrôle de l&#39;origine mycobactérienne GroEL (hsp60) promoteur. Unité UFC = Colony Forming (une mesure de la viabilité à mycobactéries).

Nous décrivons une approche alternative à l&#39;énumération des mycobactéries<em&gt; In vitro</em&gt;, Qui utilise reporter-gènes marqués mycobactéries au lieu d&#39;unités formant colonie (UFC). «Survie» des organismes ainsi que réponse de l&#39;hôte-marqueurs sont mesurés simultanément, offrant un faible coût, un système polyvalent et fonctionnel pour les études de l&#39;hôte / pathogène interactions dans le contexte de la tuberculose.

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Les essais fonctionnels jouent depuis longtemps un rôle clé dans la mesure de l'immunogénicité d'un vaccin donné. Celle-ci est conventionnellement exprimée sous forme de titre bactéricide sérique...

Cet essai in vitro mesure l'activité métabolique des mycobactéries dans le sang total afin d'évaluer l'effet des interactions entre les mycobactéries et les cellules immunitaires de l'hôte. Tout d'abord, ajoutez des mycobactéries marquées par un gène rapporteur au sang total humain afin d'obtenir une lecture en temps réel au cours d'un suivi cinétique. Récupérez les surnageants des échantillons pour la mesure des cytokines et les sédiments cellulaires pour des analyses d'ARN, éliminez les globules rouges et mesurez l'activité métabolique des mycobactéries à l'aide de dilutions sérielles et de la bioluminescence.Enfin, calculez le rapport entre le signal de bioluminescence final exprimé en unités de lumière relative et le signal de bioluminescence au moment de l'inoculation. Les résultats indiquent la capacité de l'hôte à contenir les mycobactéries. Ce test génique rapporté sur sang total peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine.Par exemple, la présence de certaines cellules immunitaires effectrices dans un échantillon de sang a-t-elle un impact fonctionnel sur les organismes en question ? Microbacteria. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méth

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Immunologie et infection

Cette vidéo montre la préparation et la quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux à l’aide d’un test de bioluminescence et du dénombrement des unités formant des colonies. L’inoculum préparé peut être utilisé pour les études d’infection.

Préparation et quantification de l’inoculum de Mycobacterium bovis BCG lux pour l’infection

Cette vidéo présente la mesure in vivo de la charge bactérienne à l’aide de larves d’insectes infectées par le Bacillus Calmette-Guérin, le BCG, lux. Le processus implique l’homogénéisation des larves, le traitement avec un substrat de luciférase et la mesure de la bioluminescence pour déterminer les unités de lumière relatives qui sont en corrélation avec la charge bactérienne.

Mesure de la charge in vivo de bactéries exprimant la luciférase chez une larve d’insecte

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Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Une nouvelle technique pour l’affichage rapide de l’antigène sur la surface bactérienne est présente, ce qui implique biotinylation surface suivie d’une exposition à des protéines d’intérêt en fusion avec avidine monomère. Chargement de BCG avec certains antigènes avec succès améliore son immunogénicité, suggérant que la décoration de surfaces peut remplacer les approches génétiques traditionnelles.

Expression des antigènes exogènes dans le Mycobacterium bovis BCG par l’intermédiaire de décoration de Surface Non génétiques avec le système avidine-biotine

Galleria mellonella a été récemment établi comme un modèle d'infection reproductible, bon marché et éthiquement acceptable pour le complexe de mycobacterium tuberculosis. Ici nous décrivons et démontrons les étapes prises pour établir l'infection réussie de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux.

Utilisation de l'invertébré Galleria mellonella comme modèle d'infection pour étudier le complexe mycobacterium de tuberculose

Nous décrivons un test d’essai moléculaire de charge bactérienne de la tuberculose effectué après l’inactivation de chaleur des expectorations. L’inactivation de la chaleur rend les échantillons d’expectorations non infectieux et évite la nécessité de laboratoires de confinement de niveau 3 pour les tests moléculaires de la tuberculose.

Un essai de charge bactérienne moléculaire de la tuberculose (TB-MBLA)

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Découvrez un dosage sanguin entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries par bioluminescence en temps réel. Cette méthode évalue les interactions hôte-pathogène dans la tuberculose.

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux) (Vidéo) | JoVE Journal

Un dosage sanguin fonctionnelle entier pour mesurer la viabilité des mycobactéries, en utilisant Reporter-Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

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