Name: Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez un assay sphéroïde pour mesurer l'invasion induite par TGF-β dans des gels de collagène 3D avec les lignées MCF10A. Cette méthode quantifie l'aire invasive et permet d'étudier les modulateurs de la progression du cancer du sein.

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Nous sommes reconnaissants à Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, Etats-Unis) pour les réactifs et Fred Miller (Barbara Ann Intitute cancer Karmanos, Detroit, Etats-Unis) pour les lignées cellulaires.

1. Préparation de la solution méthocel (500 ml) <ol><li> Autoclave 6 g de méthylcellulose dans une bouteille de 500 ml contenant un agitateur magnétique. </li><li> Dissoudre la méthylcellulose dans 250 ml de DMEM/F12 sans sérum préchauffé (60 ° C) pendant 20 min. </li><li> Ajouter 250 ml de DMEM/F12 (RT) contenant du sérum de cheval à 10%. Mélanger la nuit (4 ° C). </li><li> Effacer la solution par centrifugation (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li> Prenez la solution claire très visqueux dans un nouveau tube (environ 90-95% de la solution mère). </li><li> Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. </li></ol> 2. La culture Sphéroïde <ol><li> Préparer une solution à 20% Methocel (10 ml et 40 méthocel milieu de croissance ml). </li><li> Laver les cellules deux fois avec PBS, ajouter 0,1% de trypsine et les cellules incuber à 37 ° C </li><li> Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance et de compter les cellules. </li><li> Préparer une suspension de 10 000 cellules par ml dans méthocel 20%. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire à la S 96 puits à fond rondplaques USPENSION (100 pi par puits). </li><li> Le jour suivant, vérifiez la formation sphéroïde dans les plaques de suspension. Sphéroïdes sera prêt à l'emploi après 1-3 jours. </li></ol> 3. Préparation du collagène <ol><li> Préparer sur la glace une solution de collagène 8 ml, 1 ml PBS 10X, 1 ml de NaOH 0,1 N et 3 gouttes de HCl 0,1 N. Vérifiez si le pH est de 7,4 en repérant certains de la solution sur les bandes indicatrices de pH. Ajuster le pH si hors de portée. </li><li> Ajouter 50 ul de solution de collagène neutralisé dans le puits d'une plaque à 96 puits </li><li> Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est solidifié (90 min). </li><li> Préparer méthocel-collagène-ligand des solutions sur la glace: pour chaque pipette ligand 1 partie de la solution de collagène. Ajouter 20 ng par ml de TGF-β collagène. Après dilution avec méthocel et la diffusion sur les différentes couches, la concentration finale de TGF-β sera de 5 ng / ml Mélanger au vortex. Ajouter une partie de méthocel-solution. Mélanger au vortex. </li></ol> 4. Sphéroïde intégrerDing <ol><li> Placez une extrémité 200 pi, qui a environ 5 mm de la pointe coupée, sur une pipette 200 pi. Aspirez une sphéroïde avec la pipette et soigneusement Répartir le milieu dans une assiette vide. Regardez si le sphéroïde reste à l'intérieur de la pointe. Le sphéroïde est visible comme un point blanc. Sans relâcher le piston, sucer jusqu'à 100 ul collagène méthocel mélange et se dispenser de l'ellipsoïde dans le mélange de collagène dans un revêtus de collagène de 96 puits. Faites cela pour 12 sphéroïdes pour chaque condition. </li><li> Laissez collagène solidifier au moins 30 minutes à 37 ° C </li><li> Retirer les bulles d'air avec une pointe de 200 pi. </li><li> Ajouter 50 ul de milieu avec du sérum de 1,6% et les inhibiteurs dissous dans du DMSO. Pour le SB-431542 ajouter 4 ul de la solution mère (10 mm) à 1 ml de milieu. Après la diffusion, la concentration finale de l'inhibiteur sera de 10 uM. Le TGF-β et les inhibiteurs maintiendra le cap de l'expérimentation. Prenez des photos de sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X. </li><li> Après 48h de stimulation par le TGF-β et / ou inhibiteurs, prendre des photos des sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X. </li><li> Mesurer la surface des sphéroïdes envahir après 2 jours et soustraire la zone de départ. Mesure de la surface d'un sphéroïde: Ouvrir l'image à partir du sphéroïde dans Adobe Photoshop Extended (figure 2A) et sélectionnez l'outil Sélection rapide (figure 2B). Le pointeur de la souris se transforme en un cercle avec un «plus» (+) signe (figure 2C). Tout en faisant glisser le curseur sur le sphéroïde, Photoshop reconnaître les frontières de la sphéroïde. Si une zone à l'extérieur de l'ellipsoïde est sélectionné, cette région ne peut être exclu de la sélection en appuyant sur la touche Alt ou en utilisant l'outil de sélection négative qui est indiqué par un signe - dans la barre d'outils (). Le curseur se transforme en un cercle avec un «moins» (-) signe et en faisant glisser le curseur sur la zone sélectionnée à tort, cette zone est retiré de la sélection (figure 2D). Si nécessaire, plusieurs régions peuvent être sélectionnées en appuyant sur le ShBouton ift. Pour travailler avec plus de précision, de la taille du pointeur de la souris peut être ajustée en changeant le diamètre pinceau dans la barre d'outils (figure 2e). Lorsque le sphéroïde entier est sélectionné, la zone de la sélection est calculée par l'analyse-mesure dans la barre de menu ou en appuyant sur Ctrl + Maj + M (figure 2F). La fenêtre d'enregistrement de mesure apparaîtra indiquant le nom du fichier et le domaine de la sélection en pixels, ainsi que d'autres données (figure 2G). Si plusieurs sélections sont mesurées, la première ligne indique la somme de tous les domaines. Les mesures des sélections individuelles sont présentées dans les lignes ci-dessous. Les données de toutes les mesures peuvent être exportées dans un fichier texte et ouvert dans Excel. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un exemple de l'essai sphéroïde MCF10A1 (M1) cellules mammaires normales épithéliales, H-Ras transformée MCF10AneoT (M2) et des cellules dérivées de M2 ​​MCF10CA1a (M4) est donnée dans la Figure 3. Cellules M1 a montré que l'invasion faible sansstimulation, mais envahie significativement meilleure lors de la stimulation par le TGF-β. En revanche, le RAS-transformé M1-M2 dérivés ont envahi déjà efficacement sans plus de stimuli, et ce fut encore augmenté fois 4-5 lors du TGF-β traitement. Cellules M4 a montré la plus forte invasion, à la fois avec et sans le TGF-β plus. Ensuite, nous avons examiné si nous pouvions interférer avec le TGF-β induite par l'invasion de ce modèle sphéroïde en utilisant des inhibiteurs chimiques. À cette fin, nous avons utilisé le SB-431 542, un analogue de l'ATP et inhibiteur sélectif de l'activité kinase de TβRI, ainsi que l'activine de type IB récepteur (ActRIB) et l'activine receptor-like kinase (ALK) 7 12. Comme prévu, le SB-431542 inhibe puissamment le TGF-β induit l'invasion de M1, M2 et M4 cellules (Fig. 4), indiquant que le TGF-β invasion induite est TβRI-kinase dépendante. En outre, l'invasion basale des sphéroïdes a également été fortement inhibée, ce qui suggère que l'invasion basale est également deindépendante sur le TGF-β. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Organigramme Figure 1. De l'analyse 3D sphéroïde. Tout d'abord, les cellules sont plaquées sous conditions non-adhérentes en plaques suspensions en forme de U. Cellules attestation globale en sphéroïdes multcellular et peuvent être intégrés dans une matrice de collagène. Dans cette matrice de collagène, ils sont capables d'envahir. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Quantification de la zone des sphéroïdes en utilisant Adobe Photoshop Extended. (A) L'image du sphéroïde est ouvert dans Adobe Photoshop élargie du (B) Choix de l'outil de sélection rapide (C) Glisser le curseur sur le sphéroïde pour sélectionner la zone du sphéroïde (D) Suppression d'une zone incluse wongly utilisant le négative outil Sélection rapide (E) Ajustement de la taille du pinceau de l'outil Sélection rapide pour sélectionner plus précisément la zone (F) Sélection de laMesure commande à enregistrer (G) Exemple d'un enregistrement de la mesure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. TGF-β induite par l'invasion de sphéroïdes spontanément immortalisé MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformé MCF10AneoT (M2 (B) et son dérivé métastatique MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 et M4 sphéroïdes embarqué en collagène ont été traités avec 5ng/ml du TGF-β pour les 48h comme indiqué. AC images représentant prises à la journée d'intégration et deux jours plus tard. D invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de 13. <img alt="Figure 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La figure 4a"> <img alt="Figure 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4b"> Invasion de la figure 4. Sphéroïde basocellulaire et le TGF-β-induite est inhibée bSB-431542 Y. Sphéroïdes M1, M2 et M4 ont été intégrés dans le collagène et traités avec le TGF-β 5ng/ml et / ou 10 uM SB-431 542 comme indiqué. Images représentant prises après 2 jours (A). L'invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0 (B). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de 13.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts.

Nous avons établi un modèle dans lequel sphéroïde MCF10A1 cellules malignes et de ses dérivés envahissent dans une matrice de collagène de manière TGF-β-dépendante. Tout d&#39;abord, sphéroïdes sont formés dans les plaques rondes de 96 puits de suspension en bas, en présence de méthylcellulose. Bien sûr, aussi en forme de U en poly-HEMA plaques revêtues peuvent être utilisés à cette fin. La méthylcellulose est absolument nécessaire dans cette étape, puisque les cellules vont mourir en l&#39;absence de méthylcellulose. L...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Méthyl-cellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Avancé Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> bandes indicatrices de pH </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits de suspension plaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits d&#39;adhésion TC plaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

assay sphéroïde pour mesurer le tgf-β induit invasion

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

Le TGF-β a opposés rôles dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur dans la phase initiale, mais stimulant l&#39;invasion et les métastases à 1,2 ultérieurement. Par ailleurs, le TGF-β est fréquemment surexprimé dans le cancer du sein et son expression est corrélée à un mauvais pronostic et les métastases 3,4. Les mécanismes par lesquels le TGF-β induit l&#39;invasion ne sont pas bien comprises. Le TGF-β provoque ses réponses cellulaires via le TGF-β de type II (TβRII) et de type I (TβRI) récepteurs. Sur le TGF-β induit la formation de complexes hétéromériques, TβRII phosphoryle la TβRI. Le TβRI activé initie sa voie de signalisation intracellulaire canonique par Smad récepteurs phosphorylant (R-Smad), c&#39;est à dire Smad2 et Smad3. Ces activé R-Smad former des complexes avec les hétéromériques Smad4, qui s&#39;accumulent dans le noyau et régulent la transcription des 5 gènes cibles. En plus des déjà described voie Smad, les résultats activation du récepteur dans l&#39;activation de plusieurs autres non-Smad voies de signalisation, par exemple Mitogen protéine kinase activée (MAPK) voies 6. Pour étudier le rôle du TGF-β dans les différents stades du cancer du sein, nous avons fait usage du système de pile à MCF10A. Ce système est constitué de cellules MCF10A1 spontanément immortalisé sein (M1) épithéliales 7, le H-Ras transformée M1 dérivés MCF10AneoT (M2), qui produit des lésions précancéreuses chez les souris 8, et le M2 MCF10CA1a dérivés (M4), qui a été établi à partir xénogreffes M2 et les formes de haute qualité avec des carcinomes de la capacité à métastaser au poumon 9. Cette série offre MCF10A la possibilité d&#39;étudier les réponses des cellules avec différents grades de malignité qui ne sont pas biaisées par un fond génétique différent. Pour l&#39;analyse du TGF-β induite par l&#39;invasion, nous avons généré homotypique MCF10A cellules sphéroïdes embe culturesdded dans une matrice de collagène 3D in vitro (figure 1). Ces modèles ressemblent tumeurs humaines in vivo par l&#39;établissement d&#39;un gradient d&#39;oxygène et de nutriments, résultant en cellules actives et invasives sur les cellules à l&#39;extérieur et de repos ou même nécrotiques dans l&#39;intérieur du 10 sphéroïde. Sphéroïde tests basés ont également été montré pour une meilleure résistance aux médicaments que récapituler cultures en monocouche 11. Ce système MCF10 modèle 3D nous a permis d&#39;étudier l&#39;impact du TGF-β de signalisation sur les propriétés invasives des cellules mammaires à différents stades de malignité.

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d&#39;autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d&#39;autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l&#39;invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Le TGF-&beta; joue des rôles opposés dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur lors de la phase initiale, tout en stimulant l'invasion et la métastase...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer l'effet de régulateurs potentiels de l'invasion induite par le TGF bêta dans un environnement tridimensionnel. Cela est réalisé en formant d'abord des sphéroïdes à partir des cellules. Les EHP sont ensuite inclus dans du collagène, ce qui fournit un environnement 3D.Ensuite, la zone invasive est quantifiée. Afin de déterminer l'effet du traitement sur l'invasion induite par le TGF bêta, les résultats montrent que les modulateurs de la voie TGF-bêta affectent la propriété invasive des stéroïdes dans une matrice de collagène 3D. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de migration (« scratch assay »), est qu'elle reproduit mieux l'environnement 3D.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des T lymphocytes, telles que l'identification de nouveaux gènes impliqués dans l'invasion induite par la TGF bêta. Pour préparer la solution de méthylcellulose destinée au test d'invasion induite par la TGF bêta, commencez par stériliser à l'autoclave six grammes de méthylcellulose dans un flacon de 500 millilitres contenant un agitateur magnétique. Dissolvez

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Médecine

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice...

Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Évaluation de Cancer de l&#39;ovaire Spheroid attachement et l&#39;invasion des cellules mésothéliales en temps réel

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Ici, nous décrivons un protocole rapide et flexible pour la formation de sphéroïdes cellulaires 3D par agrégation cellulaire. Il s’adapte facilement à plusieurs types de cellules et peut être utilisé dans une variété d’applications, notamment la migration cellulaire, l’invasion ou les tests d’anoïkis, ainsi que pour l’imagerie et la quantification des interactions cellule-matrice.

Une méthode d&#39;agrégation cellulaire efficace et flexible pour 3D Spheroid production

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

L’invasion est un phénomène biologique majeur dans le développement et la progression du cancer. Ce processus est influencé par les cellules non néoplasiques et les composants du microenvironnement tumoral. Le but de cette étude est de décrire une méthode alternative pour analyser l’invasion des cellules tumorales in vitro à l’aide de cultures tridimensionnelles (3D).

Stratégie alternative pour analyser l’invasion cellulaire in vitro de cultures 3D

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’interaction des macrophages primaires dérivés de monocytes humains avec un sphéroïde tumoral dans une matrice tridimensionnelle (3D) de collagène I, avec la possibilité de comparer l’impact des propriétés solubles et physiques du microenvironnement sur l’invasion cellulaire.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Découvrez un assay sphéroïde pour mesurer l'invasion induite par TGF-β dans des gels de collagène 3D avec les lignées MCF10A. Cette méthode quantifie l'aire invasive et permet d'étudier les modulateurs de la progression du cancer du sein.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

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