Name: Lidentification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Découvrez l'identification des cibles de microARN humaines avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant des constructions reporter 3'UTR et des mimics de microARN dans des cellules adhérentes. Cette méthode permet de valider les interactions microARN-UTR dans des cellules vivantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Présentation Les microARN sont apparues comme d'importants régulateurs de l'expression génique qui modulent l'activité de nombreux processus biologiques importants. Avec plus de 700 miARN humains identifiés jusqu'à présent 1, il n'est pas surprenant que les mutations et la régulation inappropriée de miARN ont été liés à une variété de désordres physiologiques tels que le cancer et les maladies cardiaques 2,3. Des études récentes ont montré que la majorité des miARN réglementaires des sites de liaison se trouvent dans 3'UTRs 4,5, et certains chercheurs ont estimé qu'il ya des centaines de cibles par miARN dans la cellule 6. Compte tenu de l'importance biologique des miARN, le grand nombre de miARN qui existent et le grand nombre d'objectifs pour chacun d'eux, il est essentiel que les chercheurs sont en mesure d'identifier de manière fiable les cibles endogènes des miARN, de préférence sur des plates-formes se prêtent à haut débit études. Tout en utilisant des outils informatiques tels que miRBase, TargetScan et PicTar 1,6,7 est un moyen puissant pour générer des listes de cibles ARNm putatifs pour toute miARN, les prédictions ne sont pas encore assez précises pour être fier seuls 8. Par conséquent, les chercheurs tirent également parti d'un certain nombre d'approches expérimentales pour identifier les cibles de novo ou de valider des cibles prévues. De nombreuses équipes se sont appuyés sur les mesures à haut débit des taux d'ARNm ou de protéines état ​​stationnaire pour identifier les gènes dont les variations d'expression lorsque l'activité est perturbée miARN 4,9,10. Ces changements sont sans doute biologiquement significative et représentent une première étape importante, mais la mesure des changements dans l'expression globale ne fait pas de distinction entre les effets directs d'un miARN sur une transcription et indirects ou en aval des effets de signalisation. Autres outils puissants qui fournissent des preuves directes pour les miARN-ARNm interactions sont chromatine immunoprécipitation (ChIP) les stratégies que les protéines Argonaute cross-link (et donc le complexe RISC) pour miARN et ARNm, bien identifier les partenaires d'interaction n'a pas immédiatement indiquer les effets fonctionnels d'un tel événement de liaison 5,11. Ainsi, 3'UTR-reporter tests fonctionnels qui fournissent des preuves pour un effet un miRNA sur un particulier UTR sont devenus une composante importante d'une étude approfondie miARN. Ces données d'analyse basée sur des cellules prises ensemble avec les prédictions cibles de calcul ou d'expression et des données de protéomique fournit des preuves solides qu'un 3'UTR particulier est directement réglementé par le miARN d'intérêt. Dans un essai 3'UTR-reporter, le 3'UTR d'un gène d'intérêt est fusionnée à la fin d'un gène rapporteur luciférase. Si le 3'UTR est une cible d'un miARN, la stabilité transcription journaliste et / ou son efficacité de traduction va changer avec variation de la concentration miARN fonctionnels. Donc, contrairement à la transcription seule base des dosages, les dosages journaliste aider à identifier les effets sur les deux ARNm état stable et des niveaux de protéines. Reporter systèmes peuvent également être utilisées pour étudier les effets fonctionnels de mutagenèse un site putatif de liaison miARN dans un 3'UTR de confirmer qu'il est effectivement nécessaire pour la interaction8. Et tandis études à grande échelle en utilisant des tableaux d'expression, les techniques de protéomique, et ChIP Argonaute fournir de précieux échelle du génome de données pour un petit nombre de conditions expérimentales, des tests basés sur les cellules journaliste sont les mieux adaptés à l'élargissement pour l'étude des miARN-3 ' interactions UTR dans des centaines ou des milliers de conditions que peut devenir nécessaire pour criblage à haut débit de petites molécules ou d'autres à base de bibliothèque effecteurs. De nombreux scientifiques ont appliqué la technologie de dosage de journaliste à l'étude des miARN-3'UTR interactions. Cependant, avec l'idée que de nombreux miARN chaque cible de centaines transcriptions différentes, il a été difficile pour les chercheurs à utiliser cette approche puissante sur une échelle de haut débit, car les étapes du clonage, de validation et d'optimisation pour créer des milliers de différentes 3'UTR- vecteurs rapporteurs sont souvent des coûts prohibitifs. Dans un effort pour faire de petites et grandes 3'UTR-reporter d'études accessibles à tout chercheur, nous avons créé une collection échelle du génome des humains 3'UTRs pré-cloné dans le système hautement optimisé LightSwitch Luciferase Assay. Le système rapporteur comprend également des vecteurs de contrôle validé, un ensemble de plus de 700 constructions de miARN synthétiques journaliste de cible pour l'utiliser comme contrôles positifs, et une série de protocoles expérimentaux standardisés. En utilisant le protocole suivant, vous pouvez demander si une 3'UTR humain particulier est une cible de votre miARN d'intérêt. Les étapes essentielles de ce flux de travail sont la conception expérimentale, la transfection des constructions rapporteurs et imite miARN, des dosages rapporteur de la luciférase, et l'analyse des données. Pour la conception expérimentale, il est important de sélectionner judicieusement une lignée cellulaire transfectables, constructions rapporteurs expérimentaux et de contrôle, et imite miARN et non-ciblage des contrôles. Commune très transfectables adhlignées cellulaires comme les érents HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, et autres ont souvent bien travailler avec ce protocole. Notes importantes sur la conception expérimentale Le système LightSwitch Luciferase Assay est un système rapporteur entièrement optimisé qui comprend des constructions GoClone utilisant le gène de la luciférase et RenSP Réactifs LightSwitch Luciferase Assay. Utilisez toutes les composantes du système LightSwitch tel que recommandé pour obtenir des résultats optimaux de dosage journaliste. La co-transfection des oligos / plasmides avec des constructions de commutation journaliste GoClone réduit l'ensemble des signaux luciférase de manière non-spécifique. Par conséquent, il est important d'effectuer les combinaisons de transfection suivantes: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-ciblage, et le journaliste + miARN spécifiques. Notre vecteur empty_3UTR (promoteur fort, aucun UTR) offre un très haut niveau de signal de la luciférase et sert de contrôle positif pour l'efficacité de transfection, et un vecteur miARN synthétiques cibles journaliste peut servir de contrôle positif pour simuler l'activité. En outre, nous recommandons d'utiliser les contrôles GoClone ménage 3'UTR et de contrôles aléatoires pour séparer précisément séquence-spécifique vs des effets non spécifiques. Étude de votre protocole et si possible faire des master mix pour diminuer la variabilité dans vos données dues aux erreurs de pipetage ou l'évaporation. Ce protocole utilise réactifs de transfection DharmaFect Duo (Dharmacon). Jour 1 Conseil important: Choisissez votre lignée cellulaire à bon escient. Pour de meilleurs résultats, utilisez une lignée cellulaire qui est connu pour être transfectables. Nous avons également constaté que la réponse mesurable d'un journaliste 3 'UTR d'un miRNA synoptique est atténué dans des lignées cellulaires avec des niveaux élevés endogènes de ce miARN particulier. Si vous ne savez pas combien miARN votre ligne cellulaire exprime, essayez cibles SGG microARN synthétique qui mesure indirectement l'abondance d'un miARN particulier dans une cellule ainsi que vous informer que la plage dynamique de votre test. 1. Cellules pour produire des semences confluent ≥ 80% au moment de la transfection. <ol><li> Cellules des graines dans un 96-TC et plaque blanche au volume total 100 pi. </li><li> En parallèle, les graines, le nombre approprié de cellules dans une plaque de 96 puits claires pour évaluer la confluence. </li></ol> ASTUCE IMPORTANTE 1: Confluence est la clé pour obtenir de bons résultats dans une expérience imiter. Pour knockdown optimale, les cellules doivent être à 100% confluentes au moment de la transfection. ASTUCE IMPORTANT 2: Utilisation des cellules passage bas pour obtenir les meilleurs résultats. Les cellules qui ont été repiquées trop de fois ont tendance à produire des données de transfection bruyant. Jour 2 Préparer des constructions et des miARN GoClonereporter, puis transfecter dans les cellules confluentes. 2. Préparer Construit <ol><li> Construit GoClone Thaw (ADN plasmidique) à température ambiante. Mélangez bien. </li><li> Centrifugeuse pour enlever la condensation de la PAC. </li></ol> 3. Préparer ARN Micro <ol><li> MicroARN Thaw (imite spécifiques et non-ciblage des contrôles) à température ambiante et centrifuger pour enlever la condensation des chapeaux. </li><li> Diluer à une concentration de travail de 2 uM dans l'eau sans RNase. </li></ol> En plus d'un miARN expérimentale imitent toujours inclure un contrôle de miARN non-ciblage. Co-transfection d'un plasmide et un petit ARN oligo entraîne une baisse du signal que la transfection du plasmide seul. Inclure un ou plusieurs contrôles positifs. Pensez à utiliser l'une des centaines de vecteurs synthétiques miARN journaliste de cible dans le catalogue de SGG. Inclure un ou plusieurs contrôles négatifs ou non spécifiques. SGG a une série de contrôles dont UTR 3 'de gènes de ménage, des fragments aléatoires et / ou le vide (pas d'insérer UTR) de contrôle. L'utilisation d'un ou plusieurs de ces contrôles aux côtés d'une construction expérimentale vous permettra de normaliser les effets non spécifiques liés à la surexpression de votre miRNA spécifique ou le contrôle non-ciblage. 4. Préparer transfections <ol><li> Pour chaque transfection combiner les réactifs suivants pour un dosage unique: </li></ol> Mélange 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Individuels journaliste GoClone: </td><td> 3,33 uL </td></tr><tr><td> microARN: </td><td> Variable * </td></tr><tr><td> Milieux exempts de sérum: </td><td> à 10 uL </td></tr></tbody></table> * Concentration efficace des miARN peut varier de 10 nM-100 nM. Consulter le fabricant pour les miARN concentration appropriée. Conseil important: Ne pas ajouter trop d'imiter. Une fourchette raisonnable pour imiter les concentrations est de 10 à 50 nM dans la réaction finale 100ul. Effectuer au moins trois répliquestransfections TE pour chaque traitement / combinaison UTR et comprennent un volume supplémentaire pour permettre de pipetage erreur. Par exemple, multiplier les volumes seule réaction par 3,5 pour obtenir mélange de transfection assez pour trois puits de transfection de reproduire, y compris un supplément pour le pipetage d'erreur ou d'évaporation. Pour chaque journaliste, mis en place se réplique dans les cas suivants: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-cible et reporter + miARN spécifiques. Mettre en place des transfections pour les microARN ciblant à la fois identiques à celles d'un contrôle non-ciblage. <ol start="2"><li> Faire remonter la DharmaFECT DUO (Dharmacon) du mélange comme suit pour chaque transfection: </li></ol> Mélange 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0,15 uL </td></tr><tr><td> Milieux exempts de sérum: </td><td> 9,85 uL </td></tr></tbody></table> Le montant de DharmaFECT Duo à ajouter peut être une lignée cellulaire dépendante. Les montants indiqués ci-dessus sont appropriés pour des cellules HT1080. Consultez la documentation du fabricant pour déterminer le montant approprié pour votre lignée cellulaire. Astuce: Faites un mélange de transfection grands en multipliant les volumes ci-dessus par le nombre de journalistes, le nombre de répétitions et le nombre de miARN d'être testé. Lors du calcul de la quantité de mélange de transfection à préparer, être sûr d'inclure une petite quantité supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage et l'évaporation. <ol start="3"><li> Laisser le mélange Duo DharmaFECT à incuber à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Après 5 minutes, ajouter 10 ul du mélange Duo DharmaFECT (mélange 2) à chaque tube préparé des 10uL plasmide et / ou miARN (mélange 1). Chaque tube devrait alors contenir un volume de 20 pi par transfection répliquer. </li><li> Incuber chaque mélange pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Après 20 minutes, ajouter 80 ul de pré-chauffée (37 ° C), sans antibiotique, milieu complet par répétition dans chaque tube pour un total de 100 ul par transfection répliquer. Un bloc de puits profonds peuvent être utilisés pour la préparation de beaucoup de répétitions et d'échantillons simultanément. Mélanger la solution par aspiration et refoulement. </li><li> Retirer la plaque de tête de série de l'incubateur. Vérifiez que les cellules sont au moins 80% de confluence. </li><li> Soigneusement pipette hors les médias de chaque puits. </li><li> Ajouter 100 ul du mélange de transfection (20ul ADN / réactif mix + 80uL médias) à chaque puits. </li><li> Placez la plaque dans l'incubateur pendant la nuit. </li></ol> Ne pas trop incuber. La plupart imite va produire des résultats significatifs sur bona fide des cibles dans les 24 heures. Le niveau de répression mesurable à 48 heures peut être plus grande, mais ce sera bien à la variabilité du bien. Mimic expériences sont plus faciles que les expériences inhibiteur. Alors que la plupart imite de manière significative réprimer les véritables cibles dans les 24 heures, d'importantes dé-répression attribuable à l'inhibiteur peut prendre 48 heures pour être mesurables et sera presque toujours moins prononcé que l'effet de l'imiter. Jour 3 Remarque: des tests luciférase peut être effectuée immédiatement ou les plaques peuvent être congelés à -80 ° C (congélation augmente généralement la lyse des cellules et le signal de la luciférase). Gel et dégel de vos cellules, avant doser pour obtenir les meilleurs résultats. N'oubliez pas de laisser décongeler les cellules gelées à la température ambiante avant d'ajouter réactif de dosage LightSwitch. 5. Mesurer l'activité luciférase avec AssayReagents LightSwitch <ol><li> Retirer la plaque de l'incubateur et amener à température ambiante. </li><li> Préparer des réactifs de dosage LightSwitch (pour le kit LS010, les protocoles de tailles kit d'autres peuvent être trouvés en ligne): <ol><li> Substrat Reconstituer 100X en ajoutant 100 pi de substrat solvant au tube de substrat Assay lyophilisée. Protéger de la lumière et de minimiser le temps à température ambiante. Substrat 100X peuvent être conservés à-20C pour le 2-3 semaines. Pour de meilleurs résultats, utilisez substrat fraîchement reconstitué. </li><li> Préparer la solution de dosage par la fonte bouteille de 10ml de tampon de dosage dans le bain d'eau à température ambiante et ajouter 100 ul de substrat 100X reconstitué avant utilisation. Mélangez bien. </li></ol></li><li> Utiliser une pipette multi-canaux à ajouter 100 ul de solution de dosage LightSwitch (tampon + substrat) directement à chaque échantillon (contenant 100 ul cellules + média) dans une assiette blanche de 96 puits. Si les cellules ont été cultivées dans un autre format de plaque ou flacon, le transfert des échantillons d'une plaque blanche de 96 puits dans le volume total 100 pi (médias ou PBS). </li><li> Recouvrir la plaque, protéger de la lumière, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Si titrant plus d'une plaque, étaler addition d'une solution de dosage afin que chaque assiette incube pendant 30 minutes avant la lecture. </li><li> Lisez chaque puits pendant 2 secondes dans une plaque de Luminometer (SpectraMax L ou équivalent). </li><li> Calculer le knockdown en calculant rapport signal luciférase pour chaque construction de miARN spécifiques pour le contrôle non-ciblage (= la luminescence miRNA spécifique / non-cible de contrôle). Utilisez les données de l'entretien ménager, au hasard, et les constructions vides à contrôler pour les non-UTR effets des traitements spécifiques. </li></ol> Les résultats représentatifs Cibles 3'UTR de la présence d'un miARN ciblant montrent knockdown luciférase. Le knockdown de l'activité du rapporteur 3'UTR-luciférase par let-7a a été mesurée dans des cellules HT1080 par co-transfection 100 ng de chaque journaliste de construire avec 20nm laissez-7a de contrôle imiter ou non-ciblage, 24 heures d'incubation, puis en lisant le journaliste luminescents signal de l'aide de réactifs LightSwitch Luciferase Assay. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1. 3'UTRs ponctua et ARID3B humains sont des cibles de l'microARN let-7a. Signaux de journalistes 3'UTR humaines pour la ponctua et les gènes sont significativement ARID3B renversé dans la présence du microARN let-7a imitent alors que les signaux d'entretien ménager et séquence aléatoire UTR sont pas.

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de la génomique commutation qui font des outils et des réactifs apparaissant dans cet article. La production de cet article a été parrainé par la génomique appareillage.

Nous avons créé une collection échelle du génome de la pré-humain cloné 3&#39;UTR-reporter construit pour permettre des études de miARN-3&#39;UTR interactions dans les cellules vivantes. Ici, nous avons montré une méthode reproductible et à haut débit pour les miARN imite co-transfection avec 3&#39;UTR-reporters en utilisant un système rapporteur de la luciférase. Cette méthode repose sur des chercheurs utilisant une lignée cellulaire hautement transfectables et perturber l&#39;activité miARN avec une technique surexpression. Les chercheurs qui utilisent des lignées de cellules mal-transfectables peut envisager d&#39;utiliser notre compagnon lentiviraux 3&#39;UTR-reporter collection créée en collaboration avec Sigma (Mission 3&#39;UTR GoClones Lenti). Traitant les cellules avec miARN imite les résultats dans une expérience surexpression de type, et avec une telle étude, les chercheurs doivent tenir compte du fait que cela peut ou peut ne pas représenter réelle des conditions physiologiques. Pour répondre aux préoccupations surexpression, les chercheurs peuvent utiliser des inhibiteurs de miARN dans plus de mimiques pour étudier l&#39;interaction avec les deux types de perturbation 12-14. Une fois les objectifs miARN chances sont identifiés, les chercheurs peuvent souhaiter mutagénéiser les sites miARN putatif de liaison afin de déterminer si les sites sont nécessaires pour l&#39;interaction fonctionnelle. Ils peuvent également souhaiter évoluer jusqu&#39;à des centaines de tests différents UTR cible potentielle (Boutz). En outre, si les chercheurs sont intéressés de savoir si les miARN affecte la stabilité transcription ou de traduction d&#39;efficacité, les données rapporteur de la luciférase peut être comparé à des mesures de niveaux de transcription état stable. Tout changement dans le signal luciférase qui n&#39;est pas associée à un changement proportionnel dans les niveaux de transcription sera point à un effet sur l&#39;efficacité de traduction. Enfin, les chercheurs peuvent utiliser des vecteurs rapporteurs créer une courbe dose-réponse pour comparer la sensibilité relative des différents UTR à des changements dans la concentration 14 miARN.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Vendeur </td><td> Nombre de catalogue </td></tr><tr><td> Blanc plaques de culture tissulaire (96 puits fond solide) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Effacer plaques de culture tissulaire (96 puits) avec couvercle </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Réactif LightSwitch Luciferase Assay </td><td> Appareillage </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> Réactif de transfection DharmaFECT Duo (0,75 ml) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Sealing Tape Foil Plate </td><td> E &amp; K scientifique </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Respirant Sealing Tape Plate </td><td> E &amp; K scientifique </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Luminomètre Plate </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

l&#39;identification des cibles de microarn humaine avec le système lightswitch luciferase assay utilisant 3&#39;utr-reporter construit et un microarn dans les cellules adhérentes mimic

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l&#39;expression génique et jouent un rôle dans de nombreux processus biologiques. Plus de 700 miARN humains ont été identifiés à ce jour ayant chacun jusqu&#39;à des centaines de ARNm cible unique. Outils de calcul, des essais d&#39;expression et de la protéomique, et la chromatine immunoprécipitation des techniques basées sur fournissent des indices importants pour identifier les ARNm qui sont des cibles directes d&#39;un miARN particulier. En outre, les 3&#39;UTR-reporter tests sont devenus une composante importante des études approfondies cibles miARN parce qu&#39;ils fournissent des preuves fonctionnelles et quantifier les effets des miARN spécifiques-3&#39;UTR interactions dans un système basé sur des cellules. Pour permettre à davantage de chercheurs de tirer parti de 3&#39;UTR-reporter dosages et de soutenir la montée en puissance de ces tests à haut débit les niveaux, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes 3&#39;UTR humaine luciférase dans la luciférase hautement optimisé LightSwitch système de dosage. Le système comprend également des constructions synthétiques miARN cibles journaliste pour servir de témoins positifs, diverses constructions rapporteurs 3&#39;UTR endogènes, et une série de protocoles expérimentaux normalisés. Nous décrivons ici une méthode pour la co-transfection des différents 3&#39;UTR-reporter construit avec un miARN imitent qui est efficace, reproductible et susceptible d&#39;analyse à haut débit.

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l&#39;expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

Les micro-ARN (miARN) sont des régulateurs importants de l'expression génique et jouent un rôle dans de nombreux processus biologiques. Plus de 700 miARN humains ont été...

L'objectif général de cette procédure est de co-transfecter des constructions rapporteuses avec un analogue de microARN afin de valider des cibles prédites de microARN dans des séquences trois brins de Ts humaines. Cela est réalisé en élaborant d'abord un plan expérimental incluant le choix d'une lignée cellulaire et la sélection d'analogs de microARN ainsi que de constructions rapporteuses expérimentales et témoins de l'UTR trois brins Go Clone. Les cellules adhérentes sont ensuite semées environ 24 heures avant la transfection. L'étape suivante de la procédure consiste à co-transfecter chaque construction rapporteuse expérimentale ou témoin de l'UTR trois brins Go Clone avec un analogue de microARN ou un contrôle non ciblant, suivie d'une incubation de 24 à 48 heures. Enfin, le réactif de dosage luciférase Light Switch est ajouté directement aux cellules en culture, et le signal luminescent est mesuré à l'aide d'un luminomètre de plaque.Des résultats finaux peuvent être obtenus afin d'identifier quels UTR 3' humains sont ciblés par un microARN donné, grâce à la mesure de la diminution du signal de luciférase par une technologie de test rapporteur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les chercheurs en microARN, car elle fournit un test fonctionnel permettant de valider les interactions prédites entre un microARN et les régions UTR 3' dans des cellules vivantes. La conception expérimentale commence par le choix d'une lignée cellulaire appropriée présentant une forte adhérence et un bon taux de transfection ; les tests utilisant des analogues de microARN fonctionnent mieux dans des lignées cellulaires ayant de faibles niveaux d'expression endogène du microARN.Ensuite, sélectionnez le couple de mimétique de microARN et de contrôle non ciblé ; inclure un contrôle non ciblé est essentiel, car la cotransfection d'un plasmide et d'un oligonucléotide d'ARN petit entraîne un signal inférieur à celui obtenu avec le plasmide seul. Puis, sélectionnez les constructions rapporteuses préclonées d'UTR 3' Go Clone provenant de la collection à l'échelle du génome de Switchgear. Rendez-vous sur le catalogue en ligne et cliquez sur le bouton de recherche d'UTR.Après avoir saisi la liste des noms de gènes, des symboles génétiques ou des numéros d'accession, le résultat de la recherche fournira des informations sur le vecteur et la séquence, ainsi que l'état des stocks. Sélectionnez maintenant les constructions rapporteuses de contrôle. Choisissez des constructions de contrôle avec des séquences ur en trois prime, peu susceptibles d'être ciblées par le microARN sélectionné, telles que des urs de gènes ménagers ou des fragments aléatoires, afin de contrôler les effets non spécifiques de la surexpression du microARN sur la santé globale des cellules ou sur le signal du test.Envisagez également d'utiliser un rapporteur synthétique cible d'ARN micro comme témoin positif de l'activité du mimétique le premier jour, en semant des cellules de faible passage adhérentes, afin qu'elles atteignent une confluence de 80 à 100 % avant la transfection 24 heures plus tard. L'utilisation de cellules très confluentes est essentielle pour obtenir de bons résultats. Semez les cellules dans une plaque de culture tissulaire blanche de 96 puits, avec un volume total de 100 microlitres.En parallèle. Observer le nombre approprié de cellules dans une plaque claire pour une confluence soudaine au jour 2, 24 heures après l'ensemencement des cellules. Préparer le dégel pour la transfection.Effectuez le clonage des constructions rapporteuses et des microARN à température ambiante. Une fois décongelés, mélangez soigneusement et diluez les microARN à une concentration de travail de deux micromoles par litre dans de l’eau exempte d’ARN. L’ADN plasmidique est fourni à une concentration de 30 nanogrammes par microlitre et ne nécessite aucune dilution supplémentaire. Pour préparer le mélange de transfection, tenez compte du fait que chaque combinaison ADN-ARN doit être transfectée en triple exemplaire ; le volume doit être ajusté en fonction du nombre d’essais à réaliser.Préparez le mélange de réactif de transfection en combinant 9,85 microlitres de milieu sans sérum et 0,15 microlitre de DharmaFECT DUO par transfection. Laissez le mélange s'incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Préparez ensuite le mélange ADN-ARN pour chaque essai en combinant 3,33 microlitres du construct rapporteur GoClone avec une quantité suffisante de mimétique de microARN pour atteindre la concentration finale souhaitée.Compléter le volume à 10 microlitres avec un milieu sans sérum. Ensuite, mélanger 10 microlitres du mélange de réactif de transfection avec 10 microlitres de chaque mélange ADN-ARN et bien homogénéiser. Le volume final est de 20 microlitres pour chaque essai.Couvrir la plaque et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajouter 80 microlitres de milieu complet sans antibiotique, préchauffé. Ajouter un volume total de 100 microlitres par puits individuel pour le dosage, ce qui donne des concentrations finales de mimique comprises entre 10 et 15 nanomolaires.Comme étape finale, retirez soigneusement le milieu de chaque puits contenant les cellules semées et remplacez-le par 100 microlitres du mélange de transfection final approprié. Replacez la plaque dans l'incubateur et incubez pendant 24 à 48 heures. La majorité du mélange produira des résultats significatifs dans les 24 heures.Une période d'incubation de 48 heures entraînera une plus grande variation d'un puits à l'autre du signal. Le jour 3, 24 heures après la transfection, réalisez des dosages de luciférase en utilisant les réactifs du dosage de luciférase Light Switch ; les cellules peuvent être dosées immédiatement ou congelées à moins 80 degrés Celsius puis dosées ultérieurement. L'ajout d'un cycle de congélation-décongélation permettra une lyse cellulaire améliorée et un signal du rapporteur plus élevé. Portez la plaque contenant les cellules transfectées à température ambiante.Ensuite, préparez la solution de dosage luciférase du commutateur lumineux conformément aux instructions du kit et versez-la dans un réservoir stérile. Utilisez une pipette multipuits pour ajouter directement 100 microlitres de la solution de dosage du commutateur lumineux à chaque échantillon. Dans chaque puits de la plaque blanche à 96 puits, couvrez la plaque, protégez-la de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante après l'incubation.Lisez chaque puits pendant deux secondes sur un luminomètre à plaque. La réduction de l'activité du rapporteur luciférase du trois prime UTR par LE sept A a été mesurée dans des cellules HT 1080 par co-transfection de chaque construit rapporteur avec un mimétique de let-sept A ou un contrôle non ciblé. Pour analyser les résultats, considérez le signal provenant du contrôle non ciblé comme étant de 100 % pour chaque construit.Calculez le pourcentage de silençage en divisant le signal provenant du mimétique spécifique de microARN par le signal du témoin non ciblé. Un mimétique donné de microARN peut avoir des effets non spécifiques sur la viabilité cellulaire globale ou sur le signal de dosage ; cela permet de corriger d’éventuels effets non spécifiques. Comparez le silençage observé avec une cible expérimentale d’UTR au silençage observé avec un témoin d’expression constitutive ou aléatoire T, comme illustré ici.Le PONC et l'ARID trois B humain trois prime URS sont des cibles des signaux de microARN let-7a. Les signaux provenant de rapporteurs d'UTR trois prime humains pour les gènes PUNC et ARID trois B sont significativement réduits en présence d'un mimétique du microARN let-7a, tandis que les signaux pour les URS de séquences aléatoires et des gènes de référence ne le sont pas. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place une co-transfection réussie de mimétiques de microARN et de constructions rapporteuses d'UTR trois prime dans des cellules vivantes, ainsi que de la lecture du signal au luminomètre afin de mesurer la répression du signal.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.

Une plateforme de criblage à base de luciférase multiplexé pour interroger associée au cancer transduction du signal dans des cellules cultivées

Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer un siRNA ciblés écran "ubiquitome" pour identifier de nouveaux régulateurs de l'ubiquitine et ubiquitine de la réponse cellulaire médiée HIF1A à l'hypoxie. Ceci peut être adapté à n'importe quelle voie biologique où une lecture robuste de l'activité du rapporteur est disponible.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Dans le but de caractériser les changements dans les miARN sur les cellules souches neurales humaines différenciées (hNSCs), nous décrivons la différenciation des hNSC sur un système tridimensionnel, l’évaluation des changements dans l’expression des microARN par puce PCR miRNA, et l’analyse computationnelle pour la prédiction de la cible miARN et sa validation par double test de luciférase.

Différenciation d&#39;un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

L’identification luminescente d’éléments fonctionnels dans des régions 3' non traduites (3'UTRs) (3'LIFE) est une technique permettant d’identifier la régulation fonctionnelle dans les 3'UTR par des miARN ou d’autres facteurs régulateurs. Ce protocole utilise une méthodologie à haut débit telle que la transfection à 96 puits et les tests de luciférase pour cribler des centaines d’interactions présumées pour la répression fonctionnelle.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Découvrez l'identification des cibles de microARN humaines avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant des constructions reporter 3'UTR et des mimics de microARN dans des cellules adhérentes. Cette méthode permet de valider les interactions microARN-UTR dans des cellules vivantes.

Lidentification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic (Vidéo) | JoVE Journal

L'identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3'UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

Explorer plus de vidéos