L'identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3'UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

L'objectif général de cette procédure est de co-transfecter des constructions rapporteuses avec un analogue de microARN afin de valider des cibles prédites de microARN dans des séquences trois brins de Ts humaines. Cela est réalisé en élaborant d'abord un plan expérimental incluant le choix d'une lignée cellulaire et la sélection d'analogs de microARN ainsi que de constructions rapporteuses expérimentales et témoins de l'UTR trois brins Go Clone. Les cellules adhérentes sont ensuite semées environ 24 heures avant la transfection. L'étape suivante de la procédure consiste à co-transfecter chaque construction rapporteuse expérimentale ou témoin de l'UTR trois brins Go Clone avec un analogue de microARN ou un contrôle non ciblant, suivie d'une incubation de 24 à 48 heures. Enfin, le réactif de dosage luciférase Light Switch est ajouté directement aux cellules en culture, et le signal luminescent est mesuré à l'aide d'un luminomètre de plaque.

Des résultats finaux peuvent être obtenus afin d'identifier quels UTR 3' humains sont ciblés par un microARN donné, grâce à la mesure de la diminution du signal de luciférase par une technologie de test rapporteur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les chercheurs en microARN, car elle fournit un test fonctionnel permettant de valider les interactions prédites entre un microARN et les régions UTR 3' dans des cellules vivantes. La conception expérimentale commence par le choix d'une lignée cellulaire appropriée présentant une forte adhérence et un bon taux de transfection ; les tests utilisant des analogues de microARN fonctionnent mieux dans des lignées cellulaires ayant de faibles niveaux d'expression endogène du microARN.

Ensuite, sélectionnez le couple de mimétique de microARN et de contrôle non ciblé ; inclure un contrôle non ciblé est essentiel, car la cotransfection d'un plasmide et d'un oligonucléotide d'ARN petit entraîne un signal inférieur à celui obtenu avec le plasmide seul. Puis, sélectionnez les constructions rapporteuses préclonées d'UTR 3' Go Clone provenant de la collection à l'échelle du génome de Switchgear. Rendez-vous sur le catalogue en ligne et cliquez sur le bouton de recherche d'UTR.

Après avoir saisi la liste des noms de gènes, des symboles génétiques ou des numéros d'accession, le résultat de la recherche fournira des informations sur le vecteur et la séquence, ainsi que l'état des stocks. Sélectionnez maintenant les constructions rapporteuses de contrôle. Choisissez des constructions de contrôle avec des séquences ur en trois prime, peu susceptibles d'être ciblées par le microARN sélectionné, telles que des urs de gènes ménagers ou des fragments aléatoires, afin de contrôler les effets non spécifiques de la surexpression du microARN sur la santé globale des cellules ou sur le signal du test.

Envisagez également d'utiliser un rapporteur synthétique cible d'ARN micro comme témoin positif de l'activité du mimétique le premier jour, en semant des cellules de faible passage adhérentes, afin qu'elles atteignent une confluence de 80 à 100 % avant la transfection 24 heures plus tard. L'utilisation de cellules très confluentes est essentielle pour obtenir de bons résultats. Semez les cellules dans une plaque de culture tissulaire blanche de 96 puits, avec un volume total de 100 microlitres.

En parallèle. Observer le nombre approprié de cellules dans une plaque claire pour une confluence soudaine au jour 2, 24 heures après l'ensemencement des cellules. Préparer le dégel pour la transfection.

Effectuez le clonage des constructions rapporteuses et des microARN à température ambiante. Une fois décongelés, mélangez soigneusement et diluez les microARN à une concentration de travail de deux micromoles par litre dans de l’eau exempte d’ARN. L’ADN plasmidique est fourni à une concentration de 30 nanogrammes par microlitre et ne nécessite aucune dilution supplémentaire. Pour préparer le mélange de transfection, tenez compte du fait que chaque combinaison ADN-ARN doit être transfectée en triple exemplaire ; le volume doit être ajusté en fonction du nombre d’essais à réaliser.

Préparez le mélange de réactif de transfection en combinant 9,85 microlitres de milieu sans sérum et 0,15 microlitre de DharmaFECT DUO par transfection. Laissez le mélange s'incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Préparez ensuite le mélange ADN-ARN pour chaque essai en combinant 3,33 microlitres du construct rapporteur GoClone avec une quantité suffisante de mimétique de microARN pour atteindre la concentration finale souhaitée.

Compléter le volume à 10 microlitres avec un milieu sans sérum. Ensuite, mélanger 10 microlitres du mélange de réactif de transfection avec 10 microlitres de chaque mélange ADN-ARN et bien homogénéiser. Le volume final est de 20 microlitres pour chaque essai.

Couvrir la plaque et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Après l'incubation, ajouter 80 microlitres de milieu complet sans antibiotique, préchauffé. Ajouter un volume total de 100 microlitres par puits individuel pour le dosage, ce qui donne des concentrations finales de mimique comprises entre 10 et 15 nanomolaires.

Comme étape finale, retirez soigneusement le milieu de chaque puits contenant les cellules semées et remplacez-le par 100 microlitres du mélange de transfection final approprié. Replacez la plaque dans l'incubateur et incubez pendant 24 à 48 heures. La majorité du mélange produira des résultats significatifs dans les 24 heures.

Une période d'incubation de 48 heures entraînera une plus grande variation d'un puits à l'autre du signal. Le jour 3, 24 heures après la transfection, réalisez des dosages de luciférase en utilisant les réactifs du dosage de luciférase Light Switch ; les cellules peuvent être dosées immédiatement ou congelées à moins 80 degrés Celsius puis dosées ultérieurement. L'ajout d'un cycle de congélation-décongélation permettra une lyse cellulaire améliorée et un signal du rapporteur plus élevé. Portez la plaque contenant les cellules transfectées à température ambiante.

Ensuite, préparez la solution de dosage luciférase du commutateur lumineux conformément aux instructions du kit et versez-la dans un réservoir stérile. Utilisez une pipette multipuits pour ajouter directement 100 microlitres de la solution de dosage du commutateur lumineux à chaque échantillon. Dans chaque puits de la plaque blanche à 96 puits, couvrez la plaque, protégez-la de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante après l'incubation.

Lisez chaque puits pendant deux secondes sur un luminomètre à plaque. La réduction de l'activité du rapporteur luciférase du trois prime UTR par LE sept A a été mesurée dans des cellules HT 1080 par co-transfection de chaque construit rapporteur avec un mimétique de let-sept A ou un contrôle non ciblé. Pour analyser les résultats, considérez le signal provenant du contrôle non ciblé comme étant de 100 % pour chaque construit.

Calculez le pourcentage de silençage en divisant le signal provenant du mimétique spécifique de microARN par le signal du témoin non ciblé. Un mimétique donné de microARN peut avoir des effets non spécifiques sur la viabilité cellulaire globale ou sur le signal de dosage ; cela permet de corriger d’éventuels effets non spécifiques. Comparez le silençage observé avec une cible expérimentale d’UTR au silençage observé avec un témoin d’expression constitutive ou aléatoire T, comme illustré ici.

Le PONC et l'ARID trois B humain trois prime URS sont des cibles des signaux de microARN let-7a. Les signaux provenant de rapporteurs d'UTR trois prime humains pour les gènes PUNC et ARID trois B sont significativement réduits en présence d'un mimétique du microARN let-7a, tandis que les signaux pour les URS de séquences aléatoires et des gènes de référence ne le sont pas. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place une co-transfection réussie de mimétiques de microARN et de constructions rapporteuses d'UTR trois prime dans des cellules vivantes, ainsi que de la lecture du signal au luminomètre afin de mesurer la répression du signal.