Détection multiplex de bactéries dans les échantillons complexes cliniques et environnementaux à l'aide d'oligonucléotides couplés microsphères fluorescentes

Bonjour, je suis Tim Duso, d’Agriculture et Agroalimentaire Canada. Dans cette vidéo, nous allons démontrer un protocole permettant de déterminer la présence et l’abondance de micro-organismes spécifiques dans un échantillon clinique ou environnemental complexe à l’aide d’un instrument de bioplex. Ce protocole utilise des billes de polystyrène fluorescentes qui sont couplées chimiquement à une sonde oligonucléotidique spécifique à l’espèce.

Un amplicon est généré à partir de l’échantillon à l’aide d’amorces PCR universelles et l’amplicon est hybridé aux billes couplées à la sonde. Deux signaux sont générés avec l’instrument bioplex. L’un identifie la bille et l’autre quantifie le signal d’hybridation.

L’objectif global de la procédure est de déterminer un profil du microbiote d’intérêt de manière rapide et semi-quantitative. Nous avons appliqué cette technique pour déterminer les profils bactériens dans les écouvillons vaginaux et utilisons les données générées pour diagnostiquer la vaginose bactérienne, une condition clinique caractérisée par une modification du microbiote dans laquelle les organismes lactobacilles deviennent moins répandus et d’autres organismes tels que Gardnerella, vais et apoian vae deviennent détectables dans les écouvillons vaginaux. Il est important de garder à l’esprit que cette technique peut être appliquée à tout autre microbiote pour lequel un test multiplex rapide est souhaitable.

Commençons par décrire le fonctionnement de la procédure. Un profil microbien est généré en amplifiant une protéine et un gène d’enrobage chaperon chez 60 de tous les organismes présents dans un extrait d’ADN de l’écouvillon. L’une des amorces d’amplification universelles est modifiée par l’ajout de biotine, ainsi que par l’inclusion de bases modifiées par le phosphoate.

À l’extrémité cinq prime, l’amplicon est rendu simple brin à l’aide de la nucléase d’exon T sept, ce qui dégrade uniquement le brin antisens. Étant donné que le brin sensible est protégé par une amorce PCR modifiée au phosphoate, des sondes oligonucléotidiques complémentaires au brin restant sont couplées de manière covalente à des billes de polystyrène fluorescent. Chaque couleur de bille unique contenant une sonde détectant un organisme différent, jusqu’à cent billes différentes peuvent être utilisées pour un seul échantillon.

Le produit de PCR simple brin de l’écouvillon vaginal est hybridé à un mélange de billes couplées à une sonde contenant des sondes pour tous les organismes d’intérêt. On ajoute un rapporteur fluorescent FICO ethin qui se lie aux sondes biotinylées par l’intermédiaire d’un conjugué streptocoque din. Enfin, le mélange d’hybridation est analysé sur un instrument luminex ou bioplex, qui examine chaque bille individuellement pour l’identité et le signal d’hybridation.

Les résultats de cette analyse indiquent la présence de micro-organismes spécifiques et l’intensité du signal d’hybridation est corrélée à l’abondance de cet organisme. Dans l’échantillon, la présence d’organismes apparentés à la VB peut être utilisée pour diagnostiquer la VB. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la grande coloration, est que des informations sont générées sur la présence de micro-organismes spécifiques et leur abondance.

Jennifer Town, assistante de recherche. Dans notre laboratoire, les microsphères seront suspendues en tourbillonnant pendant environ 20 secondes. Transférez 400 microlitres de microsphères dans une centrifugeuse à tube einor à 14 000 fois G pendant une minute, retirez et jetez le snat Resus. Suspendez les microsphères dans 50 microlitres de MES 0,1 molaire pH 4,5.

Ajoutez un animo d’oligo de capture aux microsphères et mélangez par vortex. Ajoutez 2,5 microlitres de solution EDC fraîche aux microsphères. Incuber la réaction à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité.

Jetez la solution d’EDC préparée précédemment et préparez un nouvel échantillon de 10 milligrammes par millilitre d’EDC dans de l’eau. Comme ci-dessus, ajoutez encore 2,5 microlitres de solution EDC fraîche aux microsphères et vortex pendant cinq secondes. Incuber à nouveau à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité.

Lavez les billes en ajoutant un millilitre de 0,02 % de vortex Tween 20 pour remettre en suspension la centrifugeuse à 14 000 fois G. Pendant une minute, retirez et jetez le surnageant. Lavez à nouveau les perles en ajoutant un millilitre de 0,1 % de SDS Resus. Suspendez les billes dans 100 microlitres de tampon.

Énumérer les billes dans un hémocytomètre pour déterminer la concentration du stock. Préparez un mélange maître de microsphères en diluant chaque bille à une concentration finale de 100 billes par microlitre dans le pool tampon les billes couplées selon le plex souhaité du test Conservez le mélange maître de microsphères à quatre degrés dans l’obscurité. Ce mélange peut être stocké pendant des mois s’il est conservé dans ces conditions, générer un produit PCR pour chaque échantillon.

Incluez l’ensemble d’amorces à cinq premiers verres modifiés au phospholate et à la biotine immédiatement après la fin de la PCR. Ajoutez deux microlitres d’exonucléase T sept dans chaque tube PCR et incubez à température ambiante pendant 40 minutes. À la fin de cette incubation, ajoutez 12,5 microlitres de 0,5 molaire E-D-T-A-P-H 8.0 dans le mélange.

Cela donne un total d’environ 64,5 microlitres de produit PCR simple brin. Mélange maître Resus Bend Microsphere à l’aide d’une pipette. Versez une quantité appropriée dans un tube einor.

Boucher le tube et sonicer dans un bain-marie sonica pendant deux minutes. Distribuez 17 microlitres de produit PCR simple brin dans les puits appropriés d’un profil bas de 96. Plaque de puits ajoutez 33 microlitres de mélange de billes soniquées en suspension à chacun.

Couvrez bien la plaque avec un couvercle en silicone et tapotez. Placez délicatement la plaque dans le thermocycleur avec un programme de 95 degrés pendant cinq minutes, 60 degrés pendant 10 minutes, maintien à 60 degrés ou pause de 60 degrés pendant cinq minutes. Finez, démarrez le programme.

Préparez une solution fraîche de streptocoque Aden FICO Ethin. Vous aurez besoin de 25 microlitres par puits. Préparez du streptocoque et de l’éthylène FICO en diluant la tige à un milligramme par millilitre.

Un sur 50 à 20 microgrammes par millilitre avec un tampon tmac une fois. Lorsque le thermocycleur atteint l’étape de maintien à 60 degrés, ouvrez le couvercle, retirez le couvercle en silicone et ajoutez la solution d’éthyline FICO directement à chacun. Bien replacer le couvercle en silicone, fermer le couvercle du thermocycleur et reprendre le programme.

Une fois le programme terminé, sortez la plaque et transférez-la rapidement sur la machine à bioplex pour qu’elle la lise. La planche doit être lue dans les 10 minutes. Lisez la plaque à 60 degrés.

Assurez-vous que le bio plex a été préchauffé à cette température. Celui-ci montre les résultats des colorations de Gram et des profils luminex correspondants d’échantillons longitudinaux d’un seul individu au temps zéro. La coloration de Gram est compatible avec un diagnostic clinique de BV, et cela est corroboré par un test Fiveplex Luminex qui montre des signaux d’hybridation positifs pour les organismes associés à la VB, y compris Gardner Relic, vais et Apoian Vae.

Lactobacillus Iners est également détecté à de faibles niveaux au fil du temps. Cet individu passe d’un microbiote VB à un microbiote normal, comme le montrent les colorations de Gram. L’analyse Luminex de ces mêmes échantillons montre que l’abondance de Gardnerella Vaginalis atteint des sommets et diminue tandis que les lactobacillus iners augmentent pour devenir l’organisme dominant au point temporel final.

En utilisant cette méthode de profilage du microbiote, des informations sont générées sur la présence d’organismes spécifiques ainsi que sur leur abondance. Étant donné que la méthode est basée sur la séquence, la conception de la sonde peut être éclairée par une analyse de séquençage profond et les micro-organismes identifiés par les méthodes de séquençage de nouvelle génération peuvent être suivis dans les échantillons de manière rapide et relativement peu coûteuse. En regardant cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un profil microbien à partir d’un échantillon à l’aide de l’instrument Luminex ou Bio Plex.

Nous vous avons montré comment coupler des sondes oligonucléotidiques aux billes fluorescentes, générer de l’alicon simple brin à partir d’un échantillon clinique ou environnemental, effectuer une hybridation et déterminer les résultats sur un instrument Luminex ou Bio Plex. Bonne chance dans vos expériences.