Une introduction à guêpes parasites Drosophila Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Les objectifs généraux de cette procédure sont de montrer comment maintenir des cultures de guêpes parasitoïdes sur des hôtes drosophiles et comment disséquer les glandes lymphatiques et le corps adipeux. Ceci est accompli en élevant d’abord des guêpes sur des larves de drosophile. Les animaux sont ensuite disséqués pour isoler les glandes lymphatiques des larves, ce qui implique de décoller la cuticule et d’enlever les corps adipeux et d’autres structures plus fines pour isoler les glandes lymphatiques.

De même, les corps adipeux eux-mêmes peuvent être isolés en utilisant une procédure similaire utilisant l’immunochimie et la microscopie à fluorescence. L’expression des gènes et les changements spécifiques aux cellules sont visualisés dans les tissus immunitaires. Après une infestation de guêpes, nous étudions un système unique d’infection et d’immunité qui utilise la drosophile et sa guêpe parasite.

Notre laboratoire est l’un des rares où des cultures de parasitoïdes de drosophile sont maintenues. Ainsi, on nous demande souvent de partager nos techniques. Les parasitoïdes sont des ennemis naturels de nombreux insectes.

Les espèces que nous étudions s’attaquent aux stades larvaires de nombreuses espèces de drosophiles. En laboratoire, nous utilisons la drosophile melan gastro pour comprendre comment le système immunitaire des insectes est affecté par les attaques de parasitoïdes. Deuxièmement, nous voulons découvrir les stratégies utilisées par wass pour surmonter la défense de l’hôte.

En général, les personnes qui débutent dans les dissections pour la graisse du corps et les glandes lymphatiques ont des difficultés car, bien que les larves d’oph soient faciles à cultiver, elles sont de taille assez petite et il faut une familiarité considérable pour disséquer régulièrement ces organes de Laval avec facilité. Après avoir découvert que l’activation constitutive de la signalisation NF kappa B conduit à une encapsulation auto-immune des tissus cellulaires, nous nous sommes intéressés à savoir comment cette réaction se produirait chez les mutants oph fla. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’encapsulation induite est sa contrepartie naturelle et nous avons développé ces protocoles standard que nous allons démontrer. Aujourd’hui, je vais maintenant démontrer comment préparer et maintenir les cultures de guêpes.

Commencez par préparer un flacon de nourriture fraîche pour mouches avec une petite noisette de pâte de levure fraîchement préparée. Transférez 50 à 60 jeunes mouches sauvages dans le flacon pour pondre des œufs pendant 48 heures à 24 degrés Celsius. Après deux jours de ponte, retirez les mouches du flacon et ajoutez une goutte de miel dans le bouchon de buzz.

Et enfin, récapitulez le flacon. Réduisez le flux de dioxyde de carbone avant d’anesthésier les guêpes, car elles sont plus sensibles au gaz que les mouches. Une fois prêts à anesthésier les guêpes, triez six à huit guêpes femelles et six à huit guêpes mâles et ajoutez-les dans le flacon.

Avec les œufs et les larves de drosophile. Placez délicatement le flacon sur le côté jusqu’à ce que les guêpes se réveillent. Placez ensuite le flacon dans un incubateur à 24 degrés Celsius.

L’hôte gilo non affecté et les hôtes qui réussissent à se défendre vont peindre à l’heure normale du développement. Ils peuvent être enlevés avant le guêpes e explosion. Les guêpes ferment généralement environ 25 à 30 jours pour préparer les guêpes au même stade de développement.

Élevez les guêpes avec des œufs d’hôtes pondus sur une période de deux à six heures au lieu d’une période de 48 heures pour récolter les larves infectées pour disséquer les tissus immunitaires ou les parasites. Transférez le contenu des flacons de mouches dans une petite boîte de Pétri en verre ou en plastique. Ensuite, à l’aide d’un stéréomicroscope et d’une pince, choisissez soigneusement six à 10 larves.

Placez d’abord les larves dans un puits avec un XPBS, puis transférez-les successivement dans de l’eau, de l’eau à 70 % d’éthanol et un XPBS. Le but de ces étapes est de libérer les animaux de la nourriture contre les mouches et de nettoyer et stériliser soigneusement leur surface. Sur la platine de dissection d’un microscope de dissection Zes 1000, placez une boîte à lumière qui permet à la lumière incidente d’être transmise à travers l’échantillon.

À l’aide d’une pince fine, sélectionnez une larve de troisième stade errante nettoyée dans le PBS. Placez les larves sur une lame de microscope. À l’aide d’une pince, positionnez l’animal avec le côté ventral vers le haut.

Éloignez la source lumineuse de l’échantillon afin que l’organisme apparaisse transparent et que les organes internes soient visibles. Lorsque vous transférez les larves sur la lame, vous voulez vous assurer qu’il n’y a pas d’excès de PBS, car cela peut parfois rendre la section plus difficile. À l’aide de deux paires de pinces, tenez l’animal de chaque côté de l’extrémité postérieure et tirez doucement sur la cuticule pour introduire une petite déchirure superficielle dans la cuticule.

L’hémolymphe contenant les cytes, l’intestin et les corps adipeux commencera à s’échapper de la cavité corporelle. L’hémolymphe peut être prélevée à l’aide d’une pipette de 10 microlitres pour faire des frottis si nécessaire, en plaçant soigneusement les deux pinces sur le côté gauche de l’animal, juste sous les crochets buccaux. Faites une légère déchirure dans la cuticule.

Déplacez les deux pinces sur le côté droit de l’animal, juste sous les crochets buccaux, et faites soigneusement une autre petite déchirure. Maintenant, tout en tenant les crochets buccaux de l’animal, retirez doucement la cuticule vers l’extrémité postérieure de l’animal. Au fur et à mesure que la cuticule est retirée, le corps adipeux du cerveau, les disques imaginaux, les glandes salivaires et le ventricule éprouvé seront exposés.

La cuticule détachée à l’extrémité postérieure a le vaisseau dorsal auquel est attaché la glande lymphatique. La glande lymphatique se trouve sous le cerveau. Coupez le ventricule éprouvé et éloignez-le de la région des glandes lymphatiques.

Retirez soigneusement la graisse, le corps, l’intestin, les glandes salivaires et d’autres structures de la glande lymphatique. Attention à ne pas détacher la glande molle de la glande annulaire et du vaisseau dorsal situés à l’arrière du cerveau. Placez la glande lymphatique à plat contre la lame de microscope et retirez soigneusement tous les tissus supplémentaires jusqu’à ce que toute la glande se déploie des lobes antérieurs à l’ensemble final de cellules péricardiques.

La glande est maintenant prête à être fixée et colorée sur la platine de dissection d’un microscope de dissection Zes 1000. Placez une boîte lumineuse qui permet à la lumière incidente d’être transmise à travers l’échantillon. Placez une larve nettoyée du troisième stade sur un microscope.

Glissez 200 microlitres d’un XPBS. Inclinez la source lumineuse loin de l’échantillon afin que l’organisme apparaisse transparent et que les organes internes soient visibles. À l’aide d’une pince, positionnez l’animal de manière à ce que l’extrémité antérieure soit loin de vous.

À l’étape suivante, il est important de noter où vous positionnez vos pinces pour vous assurer de ne déchirer que la cuticule sans toucher les organes internes. Avec une paire de pinces, tenez la cuticule des larves sur le côté gauche de la bouche, crochetez avec l’autre pince. Déchirez doucement la cuticule de l’autre côté jusqu’à l’extrémité postérieure.

Arrêtez-vous avant d’arracher la cuticule du corps à l’extrémité postérieure, commencez très doucement à retirer l’intestin d’un côté. Retirez doucement le cerveau, les disques imaginaux et la glande annulaire avec la glande lymphatique qui traverse le vaisseau dorsal. Enfin, retirez délicatement la cuticule de chaque côté du corps adipeux.

N’enlevez pas les glandes salivaires car il y a des corps adipeux de chaque côté de ces glandes. Avant de procéder à la fixation et à la coloration du tissu, assurez-vous de retirer le PBS. Un échantillon de corps adipeux bien disséqué doit maintenir des contacts cellulaires normaux et doit avoir un minimum de globules graisseux autour de l’échantillon disséqué.

L’effet de l’infestation de guêpes sur l’expression des gènes est visualisé in vivo. En utilisant un rapporteur de GFP lié au promoteur Theso Mycin chez des animaux témoins non infectés, l’expression de la GFP n’a pas été détectée. Alors que le signal GFP est clairement détecté dans le cytoplasme des corps adipeux disséqués chez des animaux infectés par l Victoria.

Les ganglions lymphatiques ont été disséqués pour visualiser les changements cellulaires induits dans les lobes antérieurs après l’infection El Victoria. Des cytes nouvellement différenciés marqués par la GFP entraînée par l’amplificateur difforme sont visibles à la périphérie des lobes. Normalement, les glandes entourent le lobe en continu.

Cependant, l’intégrité des lobes antérieurs a été perturbée dans ces glandes car la membrane basale était discontinue après une infection par une guêpe à partir de ces mêmes dissections. Les cytes de l’hémolymphe ont été visualisés dans les frottis. Certains lymphocytes étaient engagés sous forme de capsule pour bloquer le développement du parasite afin de détecter l’expression de la bêtise.

Les ganglions lymphatiques disséqués. Les ganglions lymphatiques ont été colorés avec des anticorps polyclonaux anti-schpeil in vivo. Les niveaux de schpeil ont augmenté dans les cellules des glandes lymphatiques après une infection par les guêpes par rapport aux témoins non infectés.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de préparer les cultures œsophagiennes à l’âge biologique souhaité. Traitez-les avec douceur afin que la manipulation manuelle n’induise pas de réactions immunitaires. À la suite de cette procédure, nous pouvons utiliser les organes disséqués, le corps adipeux et la glande lymphatique pour extraire l’ARN et les protéines à l’aide de l’ARN ou de la protéine extraite.

Nous pouvons effectuer une analyse PCR ou Westin pour étudier l’expression des gènes et des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver. Parasite était sur des hôtes drosophiles et effectuait des dissections de tissus immunitaires pour l’immunohistochimie et d’autres applications.