Name: Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez la production et le titrage de vecteurs viraux rAAV pour la thérapie génique en utilisant des cellules HEK 293. Cette méthode efficace évite l'ultracentrifugation et les matériaux toxiques tout en assurant des rendements élevés.

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Voir Figure 1 pour une illustration résumant le protocole suivant. Note de sécurité: Tous les documents qui ont été en contact avec les particules virales assemblées doit être désinfecté avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. 1. Préparation des stocks d'ADN plasmidique (~ 2 jours) <ol><li> Les plasmides suivants sont requis 1: <ul><li> pRV1 - Contenant de la Rep AAV2 et des séquences Cap </li><li> PH21 - Contenant de la Rep AAV1 et des séquences Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-plasmide helper </li><li> Plasmide AAV contenant la cassette d'expression recombinante flanqué AAV2 signaux d'emballage (répétitions terminales inversées, RTI) </li></ul></li><li> Bien pFdelta6 doivent être cultivées dans Stbl2 cellules compétentes pour empêcher la suppression partielle, pRV1 et PH21 peuvent être cultivés dans des cellules DH5alpha compétentes. Plasmides AAV peuvent être cultivés dans des cellules Stbl2 si délétions partielles se produisent dans les cellules DH5alpha. </li><li>L'ADN plasmidique devrait être de haute qualité et exempts de contaminants ARN. Les plasmides peuvent être sélectionnés pour l'intégrité en utilisant les suivantes digère: <ul><li> pRV1 - digérer par Xbal pour donner des bandes de 7,5 kb et 3,8 kb </li><li> PH21 - digérer par EcoRI pour donner des bandes de 4,5 kb, 2,8 kb et 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digérer avec HindIII pour donner des bandes de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb et 1,5 kb </li></ul></li></ol> 2. Préparation de l'Homme cellules rénales 293 (HEK293) embryonnaires pour la transfection (2 - 3 jours) <ol><li> Deux plaques de 80% confluentes de 150 cm 2 flacons de cellules HEK293 en cinq plats 15 cm de diamètre de culture de tissus Nunc. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence avant la transfection (environ 48 heures après placage). Cellules en culture en milieu standard Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec faible taux de glucose contenant 10% de sérum de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> 3 heures avant la transfection retirer DMEM et le remplacer par Iscove«Moyen s de Dulbecco modifié (IMDM) contenant 5% de sérum de veau foetal. </li></ol> 3. La transfection de plasmides viraux (~ 1 heure pour la transfection, 3 jours d'incubation) <ol><li> Préparer les informations suivantes pour un seul lot (5 x 15 cm des plaques de culture de tissu) du virus: <ul><li> 62,5 ug de plasmide AAV </li><li> 125 ug pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg PH21 </li><li> 1650 ul de 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> Dans une classe de filtre 2 capot de culture de tissus stériles le mélange de transfection dans un tube de 50 ml. </li><li> Alors vortex de la solution, ajouter rapidement 13 ml de HEPES x 2 saline tamponnée (pH 7,05). Replacer le couvercle du tube de 50 ml et de continuer à vortex pendant 15 secondes. Laisser reposer pendant 1 minute 45 secondes, un fin précipité blanc doit se former. </li><li> Doucement ajouter 5 ml de la solution de transfection pour chaque plat de 15 cm de culture de tissu. Swirl plaques pour mélanger et retourner à l'incubateur. </li><li> 16 heures après transfection retirer milieu IMDM et remplacer par du DMEM. </li></ol> 4. Lyse des cellules et la récolte de rAAVs (2 heures) <ol><li> 72 heures après transfection, retirez le support de plaques de culture cellulaire et le jeter. Tous les déchets doivent être traités avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. </li><li> Lavez délicatement les cellules de phosphate de 1x chaude saline tamponnée (PBS, pH 7,4). </li><li> Ajouter 25 ml de PBS chaude à chaque plaque et retirez délicatement les cellules avec un racleur de cellules. Recueillir suspension dans des tubes de 50 ml. </li><li> Pellet cellules à 800 xg pendant 10 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 150 mM de NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, utiliser 10 ml par plaque de culture tissulaire. Scindé en deux tubes de 50 ml. </li><li> Préparer une nouvelle solution de désoxycholate de sodium à 10% en DH 2 O. Ajouter 1,25 ml de cette dans chaque tube pour une concentration finale de 0,5%. Ajouter benzonase nucléase à une concentration finale de 50 unités par ml. Mélanger soigneusement le tube. </li><li incuber c pendant heure.><li> Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 xg pendant 15 minutes. Transfert à tube de 50 ml frais, s'assurer que tous les débris cellulaires a été enlevée pour empêcher le blocage des colonnes d'héparine (voir étape 5). A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C avant de continuer. Nous avons stocké des échantillons pendant plusieurs semaines à -20 ° C sans réduction de l'infectiosité. </li></ol> 5. Purification sur colonne d'héparine de rAAVs (2 - 3 heures) <ol><li> Configuration des colonnes HiTrap héparine en utilisant une pompe péristaltique afin que les solutions de flux dans la colonne à 1 ml par minute pour les étapes 5.2 à 5.4. Il est important de s'assurer qu'aucune bulle d'air sont introduits dans la colonne d'héparine. </li><li> Equilibrer la colonne avec 10 ml de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> Appliquer 50 ml solution de virus de la colonne et permettre de circuler à travers. </li><li> Laver la colonne avec 20 ml de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> En utilisant une seringue de 5 ml de continuer à laver les colonnes wvec 1 ml de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, puis 1 ml de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. Jeter l'effluent à travers. </li><li> Utiliser seringues de 5 ml et éluer une légère pression du virus de la colonne en appliquant: <ul><li> 1,5 ml de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> Collectionnez ces dans un tube à centrifuger de 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. Concentration et la filtration stérile de rAAVs (1 heure) <ol><li> Concentré vecteur en utilisant Amicon ultra-4 unités de filtration centrifuge avec une coupure 100 000 poids moléculaire. Charge de 4 ml d'éluat de la colonne dans le concentrateur et centrifuger à 2000 xg pendant 2 minutes (à température ambiante). Jeter accréditives et le concentrateur de rechargement avec une solution de virus restants et centrifugation répéter. Le volume concentré devrait être d'environ 250 pi. Si le volume de concentré est beaucoup plus que cela, jeter le flux de trâce et de continuer à centrifugeuse dans une minute jusqu'à ce que les mesures de volume est d'environ 250 pi. </li><li> Ajouter 250 pi de PBS au virus pour un volume final de 500 pl et retirer du concentrateur. </li><li> Filtrer à travers un vecteur de diamètre filtre de 0,2 um 13 mm seringue. Vecteur devraient être aliquotés et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. </li></ol> 7. Titrage des stocks viraux (3 jours) Cela nécessite un promoteur qui est actif dans les cellules HEK293 conduire un gène rapporteur ou un produit du gène immunocytochimique détectable. Lorsque la production d'un vecteur qui n'est pas compatible avec les cellules HEK293 autres lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires peut être utilisé. <ol><li> Préparer 18 poly-L-lysine lamelles de verre enduit ou 18 puits de diapositives chambre de Nunc par ensemencement des cellules HEK293 de sorte qu'ils sont 40 - 50% confluentes. Pour le titrage de Cre dépendant rAAVs utiliser les cellules HEK293 qui expriment de façon stable la recombinase Cre 2. </li><li> Infect chaque puits avec de série Dilutions du vecteur AAV (figure 2A). Utilisez 3 puits par dilution. Nous avons régulièrement ajouter des virus directement à chaque puits. </li><li> Après 72 heures corriger les cellules HEK293 en ajoutant un volume égal de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à moyenne (ce qui donne une concentration finale de 2% PFA) pendant dix minutes à température ambiante. </li><li> Laver la cellule à trois reprises dans du PBS, rincer à l'dH 2 O et lamelle. </li><li> Comptez le nombre de cellules transduites par les trois puits qui ont le plus haut facteur de dilution, mais contient encore des cellules infectées, trouver le moyen de ces derniers et le multiplier par le facteur de dilution de donner le nombre d'unités infectieuses par microlitre (figure 2B). </li></ol> 8. Résultats prévus HEK293 transduites avec un encodage virus renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) sont présentés dans la figure 2B. Nous avons généralement d'atteindre des titres cohérents d'environ 6 x 10 6 particules infectieuses par litre micro. Nous utilisons régulièrement ces vecteurs pour stéréotaxique Injection dans le cerveau de rongeurs adultes. Ceci fournit une technique puissante pour la région spécifique l'expression des gènes 2. Pour combiner cette spécificité région avec un type de cellule d'expression génique sélective nous injectons de la recombinase Cre dépendant rAAVs dans les régions cibles de Cre-souris transgéniques 2. Figure 2C-E montre des exemples d'injections stéréotaxiques de Cre dépendant rAAVs encodage eGFP dans différentes régions du cerveau des souris adultes parvalbumine-Cre transgéniques 3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Illustration schématique du protocole pour la production de rAAV. . 1) les cellules HEK293 sont plaquées et cultivées à 70 - 80% de confluence. 2.) Plasmides AAV et d'aide sont préparés et transfecté dans les cellules HEK293. 3.) Medium est modifié pour revenir à DMEM 16 heures après transfection et les cellules HEK293 sont cultivées pour un autre 56 heures. 4.) HEK293 sont récoltées et lysées. vecteurs rAAV sont séparés des débris cellulaires par centrifugation. 5.) Les particules virales sont purifiées à travers des colonnes d'héparine avant la concentration et la stérilisation. 6.) HEK293 sont cultivés sur des plaques de 24 puits et les infecter avec des dilutions en série du vecteur AAV pour déterminer le nombre d'unités infectieuses. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Titrage et en application in vivo de rAAV1 / 2. (A) l'installation des cellules HEK293 pour la mesure de titre viral. Cellules HEK293 sont transduites avec des dilutions en série de rAAVs. C, le contrôle non infectés, N, 1 pl de stock viral non dilué. (B) Hek293 cellules infectées par rAAVs exprimant eGFP. (CE) expression de l'EGFP virale est limitée à Cre-neurones exprimant dans les régions cibles différentes de souris transgéniques parvalbumine-Cre après l'injection stéréotaxique de Cre-activé rAAVs. Des exemples montrent des images immunoréactivité GFP dans (C) pallidus l'réticulaire du thalamus et le globus, (D) le gyrus denté et (E) de la région CA1 de l'hippocampe. DG, deNtate gyrus; RT, le noyau réticulaire thalamique; GP, le globus pallidus. Barres d'échelle: B, 500 um; C, 100 um; D, 100 um; E, 500 um.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

vecteurs rAAV sont de plus en plus précieuse pour les études in vivo chez l&#39;animal. Ici, nous avons décrit un protocole simple et peu coûteuse pour produire rAAVs, ce qui peut faciliter l&#39;application généralisée de ce vecteur utile en évitant l&#39;externalisation coûteuse de la production de virus pour les entreprises. Le protocole (basé sur la référence 1) décrit la production de chimères rAAV1 / 2 vecteurs contenant des protéines de capside des deux sérotypes parental à 4 rapports égaux. La purification des vecteurs rAAV en se liant à l&#39;héparine colonnes repose sur l&#39;expression des protéines de capside AAV2, mais peut être combiné avec d&#39;autres sérotypes que AAV1 décrites ici. En outre, les AAV6 a été signalé à lier à l&#39;héparine, mais avec une affinité réduite, et pourrait potentiellement être purifié par des colonnes d&#39;héparine en utilisant cette procédure 5,6. Il faut noter cependant que d&#39;autres sérotypes nécessitera différentes concentrations de NaCl pour élution sur colonne d&#39;héparine 5,7. Emballage génomes rAAV a été montré pour être optimal entre 4,1 et 4,9 kb avec une forte réduction de l&#39;efficacité des emballages jusqu&#39;à 5,2 kb 8. Cette limite de l&#39;emballage peut être considéré comme le plus grand inconvénient du système rAAV, puisque le type spécifique de cellules régulation de l&#39;expression du transgène est généralement réalisée par des éléments agissant en cis grands qui ne peuvent pas être logés dans les particules de petite AAV. Pour surmonter lots titre faible, tels que ceux résultant de tenter de gènes colis qui sont proches de la limite d&#39;emballage AAV nous sommes séparés lots combinant virale concentrée à 250 ul dans un lot de 500 ul, plutôt que d&#39;ajouter du PBS comme décrit dans l&#39;étape 6.3. Fiable type cellulaire transduction spécifiques peuvent être obtenus en combinant Cre-pilote des souris et des cassettes rAAV conditionnelle (voir ci-dessous) pour éviter d&#39;étirer à la limite de l&#39;emballage. Fait à noter, tout ce protocole tente de fournir facile à suivre les instructions sur la production de t hauteITER rAAV, elle nécessite la présence de fragments de protéine de capside AAV2 pour la purification par chromatographie d&#39;affinité d&#39;héparine. Sérotypes autres que AAV2 doit être purifiée en utilisant des procédures de rechange 9. Un avantage de purification sur colonne d&#39;héparine est il est censé produire des vecteurs AAV qui ont un taux plus infectieux que ceux produits en utilisant un gradient de chlorure de césium 10. Cependant, il ya aussi quelques inconvénients à cette méthode. Par exemple, d&#39;autres protéines qui se lient l&#39;héparine peut également être présents dans le stock viral purifié. Alors que le tropisme de l&#39;héparine purifiée vecteurs peuvent être influencés par le titre en vecteur 10, notre approche pour cibler spécifiquement soit 20 excitateurs ou inhibiteurs des neurones (Fig. 2) emploie Cre induit l&#39;activation de l&#39;expression du transgène AAV-médiatisée et est indépendante du titre. Une alternative à la purification sur colonne d&#39;héparine est l&#39;utilisation d&#39;un gradient de densité iodixanol, qui produit un titre supérieur et de la préparation virale plus pur que l&#39;utilisation deun gradient de chlorure de césium 10. Cette méthode peut également être combiné avec purification sur colonne d&#39;héparine pour produire un vecteur qui est supérieure à 99% pur 11. Par conséquent, un examen attentif doit être pris par des groupes individuels quant à la méthode de purification virale est le meilleur pour leur application particulière aval. Le problème le plus fréquent associé à ce protocole est faible titre viral. Dans notre expérience, cela peut généralement être attribuée à l&#39;efficacité de transfection faible, ou l&#39;élution du virus à partir des colonnes d&#39;héparine. Tous les matériaux de transfection doit être à température ambiante avant la transfection, et transfections test doit être effectué à trouver les conditions optimales dans chaque laboratoire. D&#39;autres méthodes de transfection, tels que la lipofectamine, sont très efficaces, mais peut être prohibitif. En outre, la concentration et du pH des solutions d&#39;héparine élution de la colonne est critique pour l&#39;élution complète des virions à partir witho colonnes d&#39;héparinedommages ut. Un autre point important est que les cellules de conditionnement doit bien adhérer à la surface des boîtes de culture tissulaire. Si les cellules se détachent à un certain stade de la procédure, il est conseillé de mettre fin à l&#39;expérience et le dégivrage d&#39;un nouveau flacon de cellules. Spatio-temporelle contrôle de l&#39;expression du transgène chez les rongeurs est facilement réalisé en ciblant anatomiques précis et le stade de développement de l&#39;animal. Efficace le transfert de gène AAV-médiatisée a été démontré in utero 12,13. Dans le cerveau adulte, la zone infectée avec des particules rAAV après l&#39;injection stéréotaxique peut être réglée de très petites régions ciblées, à des domaines beaucoup plus grande, non seulement par des changements dans le titre viral mais aussi en modifiant les paramètres d&#39;injection. Il s&#39;agit notamment du volume et de rapidité d&#39;injections et de l&#39;inclusion du mannitol polyol avec la suspension de 14 virus. Le mannitol peut aussi être utilisé pour améliorer l&#39;infection d&#39;une variété de tissus après injection systémique rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. La capacité de conditionnement de rAAV (environ 4,7 kb) est probablement le facteur le plus limitant en termes de gènes qui peuvent être exprimées à partir de ces vecteurs viraux. Cependant, des études récentes ont montré que cela peut être partiellement surmonté par fractionnement gènes plus ou cassettes d&#39;expression dans des vecteurs rAAV séparées et l&#39;introduction d&#39;une séquence de transition, initier l&#39;expression des gènes lors des virions infectent la même cellule 16. Les niveaux d&#39;expression des gènes portés par les vecteurs rAAV peut aussi être grandement améliorée en utilisant l&#39;auto-gratuit vecteurs rAAV 17. Injection stéréotaxique de vecteurs rAAV fournit une méthode rapide, peu coûteux et puissant pour induire l&#39;expression des gènes de façon spécifique à la région. En combinaison avec deux stratégies de génération de l&#39;interférence ARN ND 18 rAAVs peut également être utilisé pour la région spécifique du gène-assommer. rAAVs peut être combiné avec Cre-souris transgéniques ou de type cellulaire promoteurs spécifiques à atteindre et des circuits de type cellulaireSpécifiques à l&#39;expression des gènes, permettant les manipulations génétiques à haute résolution spatiale 2,19-21, tandis rAAVs raccord avec par exemple le système Tet ajoute le contrôle temporel sur le virus de l&#39;expression génique à médiation 22,23. Ces exemples illustrent l&#39;énorme potentiel combinatoire de ces vecteurs et prédisent une augmentation rapide de rAAV études basées sur les années à venir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Amicon Ultra filtres centrifuges </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nucléase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco Eagle modifié (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Supplément de 10% de SVF et 10 unités / ml penicillin/100 pg / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> Cellules HEK293 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td> Utilisez au passage de moins de 30 </td></tr><tr><td> HEPES solution saline tamponnée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap héparine cartouche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove Dulbecco modifié par support </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Supplément de 5% SVF </td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Faire une solution fraîche pour chaque lot </td></tr><tr><td> 15 cm plats culture tissulaire </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 cellules compétentes </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de Virkon </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Laisser pour désinfecter la nuit avant de les jeter à la vidange </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Spécifiques requises pour le protocole

production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Ces dernières années, adéno-associé recombinant vecteurs viraux (AAV) sont devenus de plus en plus précieux pour les études in vivo chez l&#39;animal, et sont également actuellement testé dans des essais cliniques humains. AAV de type sauvage est un membre non-pathogène de la famille des Parvoviridae et intrinsèquement réplication déficiente. Le profil de transduction large, faible réponse immunitaire ainsi que l&#39;expression du transgène forte et persistante obtenus avec ces vecteurs en a fait un outil populaire et versatile pour in vitro et in vivo de gènes. rAAVs peut être facilement et à moindre coût fabriqués en laboratoire et, en fonction de leur profil d&#39;innocuité favorable, sont généralement donnés une classification de sécurité faible. Ici, nous décrivons une méthode pour la production et du titrage rAAVs chimérique contenant les protéines de capside des deux AAV1 et AAV2. L&#39;utilisation de ces vecteurs dits chimérique combine les avantages des deux sérotypes parentale tels que les stocks de titres élevés (AAV1) et de la purificationpar chromatographie d&#39;affinité (AAV2). Ces sérotypes d&#39;AAV sont les mieux étudiés de tous les sérotypes AAV, et individuellement ont un modèle d&#39;infectivité large. Les vecteurs chimériques décrites ici doivent avoir les propriétés infectieuses de AAV1 et AAV2 et peut donc s&#39;attendre à infecter une large gamme de tissus, y compris les neurones, les muscles squelettiques, le pancréas, du rein, entre autres. La méthode décrite ici utilise purification sur colonne d&#39;héparine, une méthode cru donner un titre plus élevé virale et plus propre que les méthodes de préparation virale de purification d&#39;autres, comme la centrifugation à travers un gradient de chlorure de césium. De plus, nous décrivons comment ces vecteurs peuvent être rapidement et facilement titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux pour<em&gt; In vivo</em&gt; Les études chez l&#39;animal. Nous décrivons comment rAAVs peuvent être produites dans le laboratoire et la manière dont ces vecteurs peuvent être titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Ces dernières années, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) recombinants sont devenus de plus en plus précieux pour les études in vivo chez l'animal, et sont également actuellement...

L'objectif de cette procédure est de produire des virus adéno-associés recombinants, ou AAVr, pour une livraison efficace de transgènes in vitro ou in vivo. Cela est réalisé en transfectant d'abord des cellules HEK 293 avec des plasmides d'ADN codant pour le transgène et les gènes viraux. Les cellules transfectées sont ensuite raclées et lysées afin de récupérer les particules d'AAVr assemblées.Ensuite, les AAVr sont purifiés à partir du lysat cellulaire par purification sur colonne d'héparine. La dernière étape consiste à concentrer les stocks viraux. En définitive, les résultats montrent une expression forte et persistante des transgènes médiée par le virus, observée par microscopie en immunofluorescence.À ce stade, les AAV de sérotype A sont prêts à être utilisés dans des applications in vitro ou in vivo. Le principal avantage de notre technique par rapport à d'autres méthodes de purification, telles que la purification par gradient de chlorure de césium, réside dans le fait que nous n'avons pas besoin d'utiliser d'ultracentrifugeuse ni de substances toxiques. Nous obtenons également des vecteurs viraux plus abondants et plus purs.Avant le début de ce protocole, préparez un plasmide de haute qualité, des stocks d'ADN et vérifiez l'intégrité comme décrit dans le protocole écrit. Commencez par ensemencer deux flacons de 150 centimètres carrés contenant des cellules HEC 293 à 80 % de confluence dans cinq boîtes de culture tissulaire de 15 centimètres de diamètre. Faites croître les cellules dans un DMEM standard à faible teneur en glucose, contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Environ 48 heures après l'ensemencement, au jour de la transfection, les cellules doivent atteindre une confluence de 70 à 80 %, trois heures avant la transfection.Retirer le DMEM et le remplacer par le milieu modifié de Cove's Ice pour cellules CHO ou le milieu IMDM contenant 5 % de sérum de veau fœtal. Préparer le mélange de transfection pour un lot unique de virus selon le protocole écrit. Dans une hotte de culture tissulaire de classe II, filtrer stérilement le mélange de transfection dans un tube de 50 millilitres tout en ajoutant rapidement 13 millilitres de solution saline tamponnée au Hepes deux fois concentrée.Remplacez le couvercle du tube de 50 millilitres et continuez à vortexer pendant 15 secondes. Laissez reposer pendant une minute et 45 secondes. Un précipité blanc devrait se former. Ajoutez délicatement cinq millilitres de la solution de transfection à chaque boîte de culture tissulaire de 15 centimètres.Agiter doucement les plaques pour mélanger après une incubation de 16 heures. Retirer l’IMDM, la remplacer par du DMEM et poursuivre l’incubation des cellules. Pour récolter les R AAVs.Retirer le milieu des plaques de culture cellulaire. 72 heures après la transfection, les déchets doivent toujours être traités avec une solution de vercon ou tout autre désinfectant approprié. Laver doucement les cellules une fois avec du tampon salin phosphate réchauffé.Ajoutez 25 millilitres de PBS tiède dans chaque plaque et détachez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules. Après avoir recueilli la suspension dans des tubes de 50 millilitres, centrifugez les cellules à 800 ×g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et resuspendez le culot.Dans 10 millilitres de tampon de chlorure de sodium à 150 millimolaire par plaque de culture tissulaire, répartir la suspension dans deux tubes de 50 millilitres. Ensuite, incuber les cellules avec une solution fraîchement préparée de 10 % de dodécylsulfate de sodium. Puis ajouter la nucléase benzonase pour l'élimination des acides nucléiques.Après avoir soigneusement mélangé les tubes, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, éliminez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 ×g pendant 15 minutes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres en veillant à ce que tous les débris cellulaires aient été éliminés afin d'éviter l'obstruction de l'héparine.Colonnes pour la purification des AAVr. Ajouter 10 millilitres de tampon de chlorure de sodium à une seringue et installer les colonnes de héparine High Trap à l’aide d’une pompe péristaltique afin que les solutions traversent la colonne à raison d’un millilitre par minute. Il est important de s’assurer qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans la colonne de héparine.Équilibrez la colonne avec 10 millilitres de tampon de chlorure de sodium à 150 millimolaire. Appliquez 50 millilitres de solution de virus sur la colonne et laissez la solution s'écouler. Puis lavez la colonne avec 20 millilitres de tampon de chlorure de sodium à 100 millimolaire.À l’aide d’une seringue de cinq millilitres, continuer à laver la colonne avec un millilitre de tampon de chlorure de sodium à 20 millimolaire, suivi d’un millilitre de tampon à 300 millimolaire. Jeter le liquide qui s’écoule.Utilisez des seringues de cinq millilitres et une pression douce pour éluer le virus de la colonne en appliquant des tampons d'élution à force ionique croissante. Recueillez l'éluate dans un tube de centrifugation de 15 millilitres. Concentrez le vecteur à l'aide de filtres centrifuges Amicon Ultra quatre avec une limite de poids moléculaire de 100 000.Chargez quatre millilitres de l’éluate de colonne dans le concentrateur et centrifugez à 2000 ×g pendant deux minutes. Après répétition de la centrifugation, le volume concentré doit être d’environ 250 microlitres. Jetez le flux passant et rechargez le concentrateur avec la solution virale restante.Ajouter 250 microlitres de PBS au virus pour un volume final de 500 microlitres et retirer du concentrateur. Comme étape finale, filtrer le vecteur à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron de diamètre 13 millimètres afin de concentrer le stock viral. Préparer 18 lamelles en verre revêtues de polyol lysine en semant des cellules HEC 293 de manière à ce qu’elles atteignent une confluence de 40 à 50 % pour la titration des AAV dépendants du gène Cree.Utilisez des cellules HEC 2 9 3 exprimant de façon stable la recombinase Cre. Infectez chaque puits avec une dilution en série du vecteur RAAV comme décrit dans le protocole écrit, en utilisant trois puits par dilution. Après 72 heures, fixez les cellules HEC 2 9 3 en ajoutant un volume égal de formaldéhyde à 4 % dans le milieu pendant 10 minutes à température ambiante après incubation. Rincez les cellules trois fois dans du PBS puis une fois avec de l’eau distillée. Ensuite, à l’aide d’un milieu de montage, placez les lamelles sur les lames.Côté cellulaire vers le bas. Compter le nombre de cellules infectées dans les trois puits ayant le facteur de dilution le plus élevé tout en contenant encore des cellules infectées. Calculer la moyenne de ces valeurs et la multiplier par le facteur de dilution afin d'obtenir le nombre d'unités infectieuses par microlitre. Des cellules HEC 2 9 3 transduites avec un virus codant pour la protéine fluorescente verte améliorée sont présentées.Des titres constants d'environ six fois 10 puissance six particules infectieuses par microlitre sont généralement obtenus. On voit ici des exemples d'injections stéréotaxiques de VAA dépendants de la Cré recombinase, codant pour la protéine fluorescente verte, dans différentes régions cérébrales de souris transgéniques adultes exprimant la Cré recombinase sous le promoteur de la parvalbumine. L'expression virale de la protéine fluorescente verte est restreinte aux neurones exprimant la Cré recombinase dans diverses régions cibles.Dans cet exemple, l'immunoréactivité de la protéine fluorescente verte est observée dans le thalamus réticulé et le globus pallidus, le gyrus denté et la région CA1 de l'hippocampe. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept à huit jours pour la production du virus et en trois jours pour la titration, si elle est correctement exécutée.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un protocole de génération de vecteurs adénoviraux de grande capacité dépourvus de toutes séquences codantes virales est présenté. Le clonage des transgènes contenus dans le génome du vecteur est basé sur des endonucléases à tête chercheuse. L’amplification virale dans les cellules productrices cultivées en tant que cellules adhérentes et en suspension repose sur un virus auxiliaire fournissant des gènes viraux chez trans.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement &gt;1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) est largement utilisé pour l’administration de gènes cliniques et précliniques. Une utilisation sous-estimée des rAAV est la transduction robuste des cellules en culture sans avoir besoin de purification. Pour les chercheurs qui découvrent le rAAV, nous fournissons un protocole pour le clonage de cassettes transgéniques, la production de vecteurs bruts et la transduction de cultures cellulaires.

Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés

Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .

Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.

Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Découvrez la production et le titrage de vecteurs viraux rAAV pour la thérapie génique en utilisant des cellules HEK 293. Cette méthode efficace évite l'ultracentrifugation et les matériaux toxiques tout en assurant des rendements élevés.

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

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