Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d'affinité bispécifiques petits

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des protéines recombinantes très pures par une procédure de purification d'affinité en deux étapes. Pour ce faire, une étiquette de purification bispécifique basée sur un domaine de liaison à l'albumine est clonée dans un vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt, puis la protéine de fusion est exprimée dans *E. coli*. Dans une deuxième étape, le lysat bactérien contenant la protéine cible est purifié par chromatographie sur colonne à l'aide d'albumine sérique humaine (HSA) immobilisée.

Cela est suivi par une purification supplémentaire sur une colonne MAB select superior resistance ou sure contenant un domaine Z immobilisé dérivé de la protéine A staphylococcique. Cela donne un produit hautement pur, adapté à des applications exigeantes. Ensuite, la pureté est évaluée par électrophorèse SDS-PAGE et, si nécessaire, par spectrométrie de masse afin de s'assurer que la protéine d'intérêt a été correctement purifiée jusqu'à l'homogénéité. Les résultats montrent une purification efficace après deux étapes successives, comparée à une seule étape utilisant la nouvelle étiquette de purification bispécifique employée dans ce protocole. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la purification par affinité en une seule étape, est qu'une protéine pure peut être obtenue grâce à un protocole simple utilisant un seul marqueur d'affinité, indépendamment des propriétés ou de la protéine cible.

Cette méthode peut être utilisée pour des protéines aux caractéristiques très diverses. De plus, étant donné que la marque est très petite, elle est facilement produite par l'hôte bactérien. En général, les personnes novices dans cette procédure de purification la trouveront très simple et directe.

Une étape cruciale consiste à ajuster le pH de votre échantillon avant de le charger sur la deuxième colonne. Une petite étiquette de purification possédant deux affinités intrinsèques a été développée en incorporant un site de liaison supplémentaire dans un domaine de liaison à l'albumine existant, dérivé de la protéine G streptococcique. Le domaine de liaison à l'albumine de 46 acides aminés se replie en un faisceau stable de trois hélices et contient un site de liaison pour l'albumine sérique humaine, principalement situé sur la deuxième hélice ; en randomisant génétiquement 11 acides aminés exposés en surface localisés sur la première et la troisième hélice, de nouvelles surfaces de liaison ont été conçues. Plusieurs cycles de tri biologique par panning contre un domaine Z dérivé de la protéine A staphylococcique, à l'aide d'une bibliothèque combinatoire exprimée sur phage, ont abouti à une molécule bispéficique appelée A BDZ un, ayant une affinité pour l'HSA et le domaine Z. Pour préparer le plasmide d'expression de la fusion bispéficique, préparez par PCR les fragments du gène A BDZ un encadrés par des sites de restriction appropriés en amont et en aval du gène cible dans le plasmide d'expression, puis coupez les fragments PCR d'A BDZ un et le vecteur d'expression purifié contenant le gène d'intérêt à l'aide des enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction adapté, et purifiez les produits avant la ligature.

Ensuite, liger le fragment A BDZ restreint dans le vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt et transformer le produit de ligation dans des cellules de e coli. Étaler les cellules transformées sur des plaques d'agri, supplémentées avec des antibiotiques appropriés pour la sélection. Effectuer un criblage PCR de quelques colonies et vérifier par séquençage ADN la cassette d'expression obtenue.

Enfin, préparez le plasmide à partir d'une culture de 24 heures d'une colonie dont la séquence a été vérifiée, puis transformez-le dans la souche d'expression privilégiée afin d'exprimer la protéine cible. Avec la nouvelle étiquette fusionnée à ses extrémités, inoculez d'abord une colonie bactérienne unique dans 10 millilitres de bouillon de soja tryptique enrichi avec 5 grammes par litre d'extrait de levure et les antibiotiques appropriés, puis incubez à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, inoculez 1 millilitre de la culture de 24 heures dans 100 millilitres de milieu frais et induisez l'expression de la protéine.

Lorsque les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique. Après l'induction des protéines, incuber les cellules à 150 tr/min et à 25 degrés Celsius pendant la nuit, puis récolter les cellules le lendemain par centrifugation. La purification par affinité orthogonale de la protéine de fusion A BDZ1 est réalisée par une purification initiale sur une colonne contenant de l'HSA immobilisée ou du zoma. Une étape de purification successive est ensuite effectuée, en exploitant la seconde affinité de la balise bispsécifique.

Les milieux chromatographiques avec le domaine Z immobilisé, tels que MA select sure, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps. Alors que l'albumine sérique humaine (HSA) peut être chimiquement couplée à des milieux pour fournir la seconde matrice afin de procéder à une purification affine orthogonale, resuspendre le culot dans 25 millilitres de tampon de migration. Ensuite, lyser les cellules par sonication à une amplitude de 60 % et des impulsions d'une seconde, suivies d'une pause d'une seconde, pendant une durée totale de trois minutes.

Après centrifugation de l'échantillon, filtrer le surnageant contenant la protéine cible à l'aide d'un filtre de 0,45 micron avant une purification supplémentaire. Ensuite, équilibrer une colonne de 1 millilitre de sphéros HSA ou une colonne activée au NHS couplée à l'HSA avec 10 volumes de colonne de tampon de migration à un débit de 1 millilitre par minute sur un système approprié de purification des protéines. Une fois l'équilibrage terminé, charger le lysat bactérien à un débit de 0,5 millilitre par minute, réajuster le débit à 1 millilitre par minute, puis laver la colonne avec 5 volumes de colonne de tampon de migration, suivis de 5 volumes de colonne de tampon de lavage.

Éluer l'échantillon avec le tampon d'élution à un millilitre par minute et recueillir les fractions. Surveiller l'absorption à 280 nanomètres pour sélectionner les fractions issues du pic élué. Pour une purification supplémentaire, rassembler les fractions présentant la concentration protéique la plus élevée, puis les diluer deux fois.

Assurez-vous que le tampon de migration est présent et que le pH est proche de la neutralité. Cette étape est cruciale pour la liaison des protéines au domaine Z. Ajoutez du tris HCl 1 M, pH 8, pour augmenter le pH si nécessaire.

Ensuite, chargez l'échantillon à 0,5 millilitre par minute sur une colonne de piégeage haute MA de un millilitre qui a été équilibrée avec du sure. Après avoir réajusté le débit à un millilitre par minute, lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de course sure. Puis éluisez les protéines avec de l'acide acétique 0,2 M, pH 2,7, pour les protéines cibles sensibles.

L'EIT peut être neutralisé directement après sa collecte par l'ajout de T tris. La page H-C-L-S-D-S peut être utilisée pour évaluer la pureté des protéines. Il est important de réduire complètement l'échantillon, car un cyte libre dans un BDZ A pourrait provoquer la dimerisation du produit en conditions non réductrices.

En tant qu'étape finale, la masse moléculaire du produit purifié peut être analysée par spectrométrie de masse après purification selon le protocole orthogonal sur une colonne d'albumine sérique humaine (HSA), suivie d'une colonne MA select sure. Différents échantillons recueillis à plusieurs points de purification ont été analysés par électrophorèse SDS-PAGE. Les échantillons comprenaient la protéine-tag A BDZ one elle-même, ainsi que trois protéines cibles humaines différentes fusionnées à AB DZ one, représentant diverses classes de solubilité, masses moléculaires et points isoélectriques.

Les bandes une à quatre montrent les lysats protéiques avant purification pour les trois différentes protéines de fusion AB DZ un et la marque AB DZ un elle-même. Les bandes cinq à huit montrent les résultats de l'étape de purification HSA des protéines. Enfin, les bandes neuf à douze proviennent de l'étape finale de purification par sélection de mAb Sure.

En outre, les échantillons obtenus à partir des mêmes lysats purifiés dans l'ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés ici. Les pistes une à trois montrent les lysats avant purification, tandis que les pistes quatre à six ont été prélevées après la première étape de purification sur la colonne MAB Select Sure. Les produits de haute pureté des pistes sept à neuf résultent de la purification finale de l'HSA.

Les résultats montrent clairement l'utilité d'une double étiquette et de deux étapes de purification hautement spécifiques. Même si une pureté raisonnable est obtenue après la première étape de purification, comme le montrent les gels, l'étape suivante produit un produit très pur, particulièrement adapté à des applications exigeantes. Une fois maîtrisée, l'étape de purification centrale de cette méthode peut être réalisée en quelques heures par une seule personne afin d'obtenir une protéine recombinante hautement pure, adaptée à de nombreuses applications différentes.

Par exemple, après avoir suivi cette procédure, les biomolécules purifiées peuvent être utilisées pour d'autres applications, telles que des études d'interaction afin de répondre à des questions comme la force de liaison d'un complexe. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière d'obtenir un produit protéique véritablement pur en utilisant cette double balise d'affinité.