Name: Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette daffinité bispécifiques petits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez une méthode de purification orthogonale en deux étapes utilisant une étiquette d'affinité bispecifique pour isoler des protéines recombinantes très pures. Cette technique simplifiée s'applique à diverses protéines.

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Ce projet a été financé par le Knut et Alice Wallenberg Foundation et le Conseil de recherche suédois.

1. Clonage de la fusion de cibles gene/ABDz1-tagged construire <ol><li> Préparer des fragments PCR du gène ABDz1 flanqué par des sites de restriction appropriée pour N-terminal de la ligature du gène cible dans le plasmide d'expression (un plasmide contenant ABDz1 est disponible gratuitement grâce à un accord de transfert de matériel). </li><li> Enchaînement d'expression purifiée vecteur et fragments PCR avec des enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction appropriée. Purifier les produits avant la ligature. </li><li> Ligaturer les restreint ABDz1 fragment dans le vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt et de transformer le produit de ligature à E. coli (dans la méthode originale la souche RR1ΔM15 a été utilisé 8). Fais cellules transformées sur des plaques d'agar supplémenté avec des antibiotiques appropriés pour la sélection. </li><li> PCR écran un peu de colonies et la séquence de vérifier la cassette d'expression résultant par séquençage d'ADN. </li><li> Préparer plasmidique à partir d'une culture de nuit d'une séquence verifcolonie IED et de transformer la souche d'expression préféré (dans la méthode de E. coli d'origine Rosetta (DE3), organise un PRARE plasmidique pour améliorer la production des protéines codées par les gènes humains, ont été utilisés). </li></ol> 2. L'expression des protéines <ol><li> Inoculer une seule colonie bactérienne dans 10 ml de bouillon de soja tryptique supplémenté avec 5 extrait de levure g / l et des antibiotiques appropriés. Incuber à 150 rpm à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Inoculer 1 ml de culture de la nuit dans 100 ml de milieu frais et d'induire l'expression des protéines (à l'origine une mM d'isopropyl-β-D-thiogalactoside quand un opéron lac a été utilisé) quand les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique. </li><li> Incuber à 150 rpm à 25 ° C durant la nuit les cellules et la récolte par centrifugation. </li></ol> 3. Purification par affinité orthogonale <ol><li> Reprendre le culot dans 25 ml de tampon de fonctionnement (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (p / v) de Tween 20, pH 8,0) et perturber èmee cellules par sonication à une amplitude de 60% et 1.0/1.0 impulsions pendant 3 min. Centrifuger l'échantillon et le filtre de la protéine cible contenant surnageant (0,45 um) avant une purification supplémentaire. </li><li> Equilibrer soit un 1 ml HSA Sépharose colonne ou une colonne de NHS-activated, précédemment couplé avec HSA selon les recommandations du fournisseur, avec 10 volumes de colonne (CV) de course de tampon à 1 ml / min sur un système de purification de protéines adéquat. Chargez le lysat bactérien à 0,5 ml / min, puis remettre le débit à 1 ml / min. </li><li> Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration suivies de 5 CV de tampon de lavage (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). </li><li> Eluer l'échantillon avec le tampon d'élution (0,5 M HAC, pH 2,5) à 1 ml / min et de recueillir des fractions, l'absorption à 280 nm suivre pour sélectionner les fractions du pic élué d'une purification supplémentaire. </li><li> Piscine les fractions avec la plus forte concentration de protéines, diluer deux fois en tampon de migration Sure (phosphate 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) etAssurez-vous que le pH se situe autour de neutre. Ajouter 1 M Tris-HCl pH 8 pour augmenter le pH si nécessaire. </li><li> Chargez l'échantillon à 0,5 ml / min sur une colonne de 1 ml MabSelect HiTrap SuRe qui a été équilibrée avec 10 CV de tampon de migration sûr à 1 ml / min. Réinitialiser le débit à 1 ml / min après le chargement. </li><li> Laver la colonne avec 5 CV de tampon de migration Sure (étape 5) et éluer les protéines avec 0,2 M HAC, pH 2,7. Pour les protéines cibles sensibles de l'éluat peut être neutralisé directement sur la collecte par addition de Tris-HCl. </li></ol> Si les étapes chromatographiques sont inversés l'éluat de la colonne de MabSelect sûr qu'il puisse être dilués dans un tampon (étape 3.1) et l'augmentation du pH à environ 8 par addition de 1 M Tris-HCl. En général, plus étroit pics sont observés lorsque la matrice Sure est employé dans la deuxième étape. 4. Evaluation de la pureté par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide (SDS-PAGE) <ol><li> Chargez les fractions purifiées sur uneréduire SDS-PAGE et, si désiré, d'analyser le poids moléculaire du produit purifié par spectrométrie de masse. Il est important de réduire complètement l'échantillon depuis une cystéine libre dans ABDz1 peut provoquer la dimérisation du produit sous conditions non réductrices. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Comme une preuve de principe, de purification par affinité orthogonale facilitée par la balise ABDz1 a été évaluée pour trois protéines cibles humaines représentant les classes de solubilité différentes, des poids moléculaires et points isoélectriques (tableau 1). Le gène a été génétiquement fusionné ABDz1 aux gènes cibles et les constructions ont été exprimées dans E. coli, la figure 2 montre un organigramme pour toutes les étapes de la méthode consécutivement. Après purification par le protocole orthogonales, les échantillons prélevés à différents points ont été analysés par SDS-PAGE (figure 3). Les résultats montrent clairement l'utilité d'une balise double et deux étapes de purification très spécifique. Même si la pureté raisonnable est achieved après l'étape de purification initiale comme on le voit à partir des gels, l'étape successive donne un produit très pur bien adapté pour des applications très exigeantes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Conception de la bibliothèque combinatoire utilisée pour la sélection de l'bispécifique ABDz1 tag. Les 46 acides aminés se replie de domaine albumine contraignant dans un bundle stable à trois hélices et il contient un site de liaison pour l'albumine sérique humaine principalement situés à la deuxième hélice. Par génétiquement aléatoire onze surface exposée acides aminés situés dans la première hélice et de la troisième, une surface nouvelle liaison était conçu. Les onze positions sont indiquées sur la figure et numérotés selon Kraulis et al. 9. Après biopanning contre un dimère de la Z-domaine de la protéine A du staphylocoque à la bibliothèque combinatoire exprimé sur phage, la molécule bispécifique ABDz1 a été identifié. <img alt='"Figure' src='"/' files> Figure 2. Un organigramme simplifié pour le protocole de purification par affinité orthogonale. Une PCR-fragment contenant la séquence ABDz1 est ligaturé (N-terminale) avec un gène d'intérêt dans un vecteur d'expression approprié. Le produit de ligation est transformé en E. coli pour la vérification de séquence et préparation de plasmide. Suite à la transformation d'un hôte d'expression, d'une culture à grande échelle pour l'expression de protéines recombinantes est mis en place à partir d'une culture initiale pendant la nuit. Les bactéries sont récoltées par centrifugation et lysées par sonication pour produire lysat bactérien contenant la protéine cible. Après une étape de filtration pour éliminer les résidus de particules solides, le lysat est soumis à la purification par affinité orthogonale sur un système de manipulation des liquides en subissant deux étapes de purification dans la succession. Pics élués des deux étapes de purification sont échantillonnés et évalués par SDS-PAGE pour évaluer la pureté et par rapport à tIl lysat avant purification. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Analyse SDS-PAGE de protéines cibles exprimées et purifiées en fusion avec ABDz1. Des échantillons prélevés dans le lysat bactérien de trois protéines exprimées dans la fusion à ABDz1, représentant des propriétés différentes, et la balise elle-même étaient ABDz1 collectés avec des échantillons provenant des pics correspondants provenant de la purification sur une colonne de HSA-suivi par un MabSelect Sure-colonne (A) . Pistes 1-4 représentent des échantillons à partir de lysats avant la purification, les voies de l'HSA 5-8 de purification (première étape) et les voies 9-12 de la purification MabSelect Sure (deuxième étape). Les échantillons sont chargés dans l'ordre suivant: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 et ABDz1. En outre, les échantillons acquis à partir des lysats même purifiée dans l'ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés (B). Pistes 1-3 représentent des échantillons à partir de lysats avant purification, pistes 4-6 fROM MabSelect Sure-purification (première étape) et les ruelles de 7-9 HSA-purification (deuxième étape). Les échantillons ont été chargés dans le même ordre que dans (A) mais la balise elle-même n'est pas inclus. De ces résultats, il est clair que cette méthode en deux étapes rendements protéines hautement purifiées indépendamment de l'ordre dans lequel les étapes sont appliquées. <table border="1"><tbody><tr><td> B Nom </td><td> Protéine cible Uniprot c </td><td> Moléculaire poids (kDa) </td><td> Solubilité Classe D </td><td> Poids moléculaire du produit de fusion (kDa) </td><td> Point isoélectrique du produit de fusion </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Poids moléculaire de ABDz1 tag seul est de 6,3 kDa, point isoélectrique 6,7. </li><li> Protéine cible représente une partie de la protéine Uniprot. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Classe de solubilité du fragment de la protéine N-terminal avec son 6 ABP 10. </li></ol> Tableau 1. Protéines cibles et des produits de fusion avec une étiquette de ABDz1 évaluée dans une étude de validation de principe. Trois protéines humaines uniques avec un poids moléculaire différent, la solubilité et le point isoélectrique ont été choisis pour l'expression et la purification par l'approche par affinité orthogonale.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le protocole de purification par affinité orthogonale présentée ici permet une purification efficace d&#39;une large gamme de protéines cibles. En combinant le site inhérentes liaison du domaine albumine contraignant avec une surface nouvelle liaison, une petite protéine tag bispécifique a été développé. Il est très simple à utiliser la balise car il peut simplement être cloné et exprimé dans la fusion à une protéine d&#39;intérêt dans tout vecteur d&#39;expression privilégié. L&#39;équipement standard disponible dans la plupart des laboratoires peuvent être employées pour la purification des protéines en deux étapes. Puisque la fonction de l&#39;étiquette ABDz1 dépend repliement correct du domaine d&#39;exposer efficacement ses deux surfaces de liaison, la méthode est limitée aux protéines exprimées sous forme soluble et ne conviennent pas pour des purifications dans des conditions dénaturantes. Les agents réducteurs devraient également être évités car ils interfèrent avec la liaison de ABDz1 au Z-domaine sur le MabSelect matrice sûr. Orthogonal affinité purificationtion fournit une alternative utile aux méthodes traditionnelles afin de satisfaire les exigences de protéines hautement purifiées dans de nombreuses applications exigeantes. Dans le même temps, cette méthode élimine le besoin de marquage combinatoire lorsque des stratégies de purification différents sont utilisés dans la succession. Pour les applications nécessitant une protéine cible natif, un site de clivage de la protéase peuvent être introduits pour rendre élimination enzymatique de la balise ABDz1 possible 11. Par ailleurs, la balise ABDz1 est le premier domaine bispécifique petite protéine et plié décrites à ce jour. Il est unique car elle fournit une stratégie de purification qui repose sur deux interactions cibles affinité spécifique. Dans l&#39;avenir, il serait intéressant d&#39;étendre ce concept en développant de nouvelles étiquettes qui portent bispécifique nouvelles surfaces de liaison qui sont compatibles avec facilement disponibles et peu coûteux des résines chromatographiques. Par exemple, en remplaçant les acides aminés impliqués dans la liaison albumine avec des résidus de base, un tag compatible avec isur la chromatographie d&#39;échange peut être réalisable. Un concept similaire a été prouvé efficace par le génie chargé de la Z-domaine pour générer les balises connue sous le nom d&#39;acide Z 12 et Z 13 de base compatible avec les anions et de cations échange, respectivement.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Bouillon de soja tryptique </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> L&#39;extrait de levure </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Sonicateur cellules Vibra </td><td> Sonics et les matériaux </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sépharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Ancien produits </td></tr><tr><td> HiTrap SuRe MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS-activated colonne HP </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

protein purification orthogonal animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

En raison des coûts élevés associés à la purification de protéines recombinantes les protocoles doivent être rationalisées. Pour haut-débit efforts, il existe une demande pour des méthodes générales qui ne nécessitent pas l&#39;optimisation des protéines cibles spécifiques 1. Pour y parvenir, les balises de purification qui peut être génétiquement fusionné au gène d&#39;intérêt sont couramment utilisés 2. La poignée de l&#39;affinité la plus largement utilisée est la balise hexa-histidine, qui est approprié pour la purification de fois dans des conditions natives et dénaturantes 3. La charge métabolique pour la production de la balise est faible, mais il ne fournit pas que la spécificité élevée que chromatographie d&#39;affinité 1,2 concurrentes stratégies. Ici, une étiquette de purification bispécifique avec deux différents sites de fixation sur un acide aminé 46, le domaine petite protéine a été développée. Le domaine d&#39;albumine contraignant est dérivé de la protéine G streptococcique et a une forte affinité inhérente à l&#39;albumine sérique humaine(HSA). Onze exposées à la surface des acides aminés, ne participent pas à l&#39;albumine contraignant 4, ont été randomisés pour produire génétiquement une bibliothèque combinatoire. La bibliothèque de protéines avec le roman disposées au hasard de surface de liaison (figure 1) ont été exprimées sur les particules de phages pour faciliter la sélection des liants par la technologie d&#39;affichage de phages. Grâce à plusieurs cycles de biopanning contre un dimère Z-domaine dérivé de la protéine staphylococcique A 5, une petite molécule bispécifique avec une affinité pour les deux HSA et la nouvelle cible a été identifié 6. Le domaine nouvelle protéine, appelée ABDz1, a été évaluée comme une étiquette de purification pour une sélection de protéines cibles avec des poids moléculaires différents, la solubilité et le point isoélectrique. Trois protéines cibles ont été exprimés dans Escherichia Escherishia avec le tag roman fusionnée à leur N-terminaux et par la suite purifiés par affinité. La purification initiale soit sur une colonne avec immobilisé HSA ou Z-domaine conduit à relativement des produits purs. Deux étapes de purification par affinité avec le tag bispécifique conduit à une amélioration substantielle de la pureté des protéines. Supports chromatographiques avec le Z-domaine immobilisées, par exemple MabSelect sûr, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps et des HSA peuvent être facilement couplés chimiquement à des médias pour fournir la deuxième matrice. Cette méthode est particulièrement avantageux quand il ya une forte demande sur la pureté de la protéine cible récupéré. Le bifonctionnalité de la balise permet à deux différentes étapes de chromatographie pour être utilisés pendant le fardeau métabolique sur l&#39;hôte d&#39;expression est limitée en raison de la faible taille de l&#39;étiquette. Il offre une alternative compétitive à ce qu&#39;on appelle le marquage combinatoire, où plusieurs balises sont utilisées en combinaison 1,7.

Un roman et très efficace en deux étapes chromatographie d&#39;affinité protocole a été élaboré et est décrite en détail. La méthode est basée sur une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes et est applicable à un large éventail de protéines cibles avec des propriétés différentes.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

En raison des coûts élevés associés à la purification des protéines recombinantes, les protocoles doivent être rationalisés. Pour les travaux à haut débit, il existe un...

L'objectif général de l'expérience suivante est de produire des protéines recombinantes très pures par une procédure de purification d'affinité en deux étapes. Pour ce faire, une étiquette de purification bispécifique basée sur un domaine de liaison à l'albumine est clonée dans un vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt, puis la protéine de fusion est exprimée dans *E. coli*. Dans une deuxième étape, le lysat bactérien contenant la protéine cible est purifié par chromatographie sur colonne à l'aide d'albumine sérique humaine (HSA) immobilisée.Cela est suivi par une purification supplémentaire sur une colonne MAB select superior resistance ou sure contenant un domaine Z immobilisé dérivé de la protéine A staphylococcique. Cela donne un produit hautement pur, adapté à des applications exigeantes. Ensuite, la pureté est évaluée par électrophorèse SDS-PAGE et, si nécessaire, par spectrométrie de masse afin de s'assurer que la protéine d'intérêt a été correctement purifiée jusqu'à l'homogénéité. Les résultats montrent une purification efficace après deux étapes successives, comparée à une seule étape utilisant la nouvelle étiquette de purification bispécifique employée dans ce protocole. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la purification par affinité en une seule étape, est qu'une protéine pure peut être obtenue grâce à un protocole simple utilisant un seul marqueur d'affinité, indépendamment des propriétés ou de la protéine cible.Cette méthode peut être utilisée pour des protéines aux caractéristiques très diverses. De plus, étant donné que la marque est très petite, elle est facilement produite par l'hôte bactérien. En général, les personnes novices dans cette procédure de purification la trouveront très simple et directe.Une étape cruciale consiste à ajuster le pH de votre échantillon avant de le charger sur la deuxième colonne. Une petite étiquette de purification possédant deux affinités intrinsèques a été développée en incorporant un site de liaison supplémentaire dans un domaine de liaison à l'albumine existant, dérivé de la protéine G streptococcique. Le domaine de liaison à l'albumine de 46 acides aminés se replie en un faisceau stable de trois hélices et contient un site de liaison pour l'albumine sérique humaine, principalement situé sur la deuxième hélice ; en randomisant génétiquement 11 acides aminés exposés en surface localisés sur la première et la troisième hélice, de nouvelles surfaces de liaison ont été conçues. Plusieurs cycles de tri biologique par panning contre un domaine Z dérivé de la protéine A staphylococcique, à l'aide d'une bibliothèque combinatoire exprimée sur phage, ont abouti à une molécule bispéficique appelée A BDZ un, ayant une affinité pour l'HSA et le domaine Z. Pour préparer le plasmide d'expression de la fusion bispéficique, préparez par PCR les fragments du gène A BDZ un encadrés par des sites de restriction appropriés en amont et en aval du gène cible dans le plasmide d'expression, puis coupez les fragments PCR d'A BDZ un et le vecteur d'expression purifié contenant le gène d'intérêt à l'aide des enzymes de restriction choisies dans un tampon de réaction adapté, et purifiez les produits avant la ligature.Ensuite, liger le fragment A BDZ restreint dans le vecteur d'expression contenant le gène d'intérêt et transformer le produit de ligation dans des cellules de e coli. Étaler les cellules transformées sur des plaques d'agri, supplémentées avec des antibiotiques appropriés pour la sélection. Effectuer un criblage PCR de quelques colonies et vérifier par séquençage ADN la cassette d'expression obtenue.Enfin, préparez le plasmide à partir d'une culture de 24 heures d'une colonie dont la séquence a été vérifiée, puis transformez-le dans la souche d'expression privilégiée afin d'exprimer la protéine cible. Avec la nouvelle étiquette fusionnée à ses extrémités, inoculez d'abord une colonie bactérienne unique dans 10 millilitres de bouillon de soja tryptique enrichi avec 5 grammes par litre d'extrait de levure et les antibiotiques appropriés, puis incubez à 150 tr/min et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, inoculez 1 millilitre de la culture de 24 heures dans 100 millilitres de milieu frais et induisez l'expression de la protéine.Lorsque les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique. Après l'induction des protéines, incuber les cellules à 150 tr/min et à 25 degrés Celsius pendant la nuit, puis récolter les cellules le lendemain par centrifugation. La purification par affinité orthogonale de la protéine de fusion A BDZ1 est réalisée par une purification initiale sur une colonne contenant de l'HSA immobilisée ou du zoma. Une étape de purification successive est ensuite effectuée, en exploitant la seconde affinité de la balise bispsécifique.Les milieux chromatographiques avec le domaine Z immobilisé, tels que MA select sure, sont facilement disponibles pour la purification des anticorps. Alors que l'albumine sérique humaine (HSA) peut être chimiquement couplée à des milieux pour fournir la seconde matrice afin de procéder à une purification affine orthogonale, resuspendre le culot dans 25 millilitres de tampon de migration. Ensuite, lyser les cellules par sonication à une amplitude de 60 % et des impulsions d'une seconde, suivies d'une pause d'une seconde, pendant une durée totale de trois minutes.Après centrifugation de l'échantillon, filtrer le surnageant contenant la protéine cible à l'aide d'un filtre de 0,45 micron avant une purification supplémentaire. Ensuite, équilibrer une colonne de 1 millilitre de sphéros HSA ou une colonne activée au NHS couplée à l'HSA avec 10 volumes de colonne de tampon de migration à un débit de 1 millilitre par minute sur un système approprié de purification des protéines. Une fois l'équilibrage terminé, charger le lysat bactérien à un débit de 0,5 millilitre par minute, réajuster le débit à 1 millilitre par minute, puis laver la colonne avec 5 volumes de colonne de tampon de migration, suivis de 5 volumes de colonne de tampon de lavage.Éluer l'échantillon avec le tampon d'élution à un millilitre par minute et recueillir les fractions. Surveiller l'absorption à 280 nanomètres pour sélectionner les fractions issues du pic élué. Pour une purification supplémentaire, rassembler les fractions présentant la concentration protéique la plus élevée, puis les diluer deux fois.Assurez-vous que le tampon de migration est présent et que le pH est proche de la neutralité. Cette étape est cruciale pour la liaison des protéines au domaine Z. Ajoutez du tris HCl 1 M, pH 8, pour augmenter le pH si nécessaire.Ensuite, chargez l'échantillon à 0,5 millilitre par minute sur une colonne de piégeage haute MA de un millilitre qui a été équilibrée avec du sure. Après avoir réajusté le débit à un millilitre par minute, lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de course sure. Puis éluisez les protéines avec de l'acide acétique 0,2 M, pH 2,7, pour les protéines cibles sensibles.L'EIT peut être neutralisé directement après sa collecte par l'ajout de T tris. La page H-C-L-S-D-S peut être utilisée pour évaluer la pureté des protéines. Il est important de réduire complètement l'échantillon, car un cyte libre dans un BDZ A pourrait provoquer la dimerisation du produit en conditions non réductrices.En tant qu'étape finale, la masse moléculaire du produit purifié peut être analysée par spectrométrie de masse après purification selon le protocole orthogonal sur une colonne d'albumine sérique humaine (HSA), suivie d'une colonne MA select sure. Différents échantillons recueillis à plusieurs points de purification ont été analysés par électrophorèse SDS-PAGE. Les échantillons comprenaient la protéine-tag A BDZ one elle-même, ainsi que trois protéines cibles humaines différentes fusionnées à AB DZ one, représentant diverses classes de solubilité, masses moléculaires et points isoélectriques.Les bandes une à quatre montrent les lysats protéiques avant purification pour les trois différentes protéines de fusion AB DZ un et la marque AB DZ un elle-même. Les bandes cinq à huit montrent les résultats de l'étape de purification HSA des protéines. Enfin, les bandes neuf à douze proviennent de l'étape finale de purification par sélection de mAb Sure.En outre, les échantillons obtenus à partir des mêmes lysats purifiés dans l'ordre inverse sur les mêmes colonnes ont été analysés ici. Les pistes une à trois montrent les lysats avant purification, tandis que les pistes quatre à six ont été prélevées après la première étape de purification sur la colonne MAB Select Sure. Les produits de haute pureté des pistes sept à neuf résultent de la purification finale de l'HSA.Les résultats montrent clairement l'utilité d'une double étiquette et de deux étapes de purification hautement spécifiques. Même si une pureté raisonnable est obtenue après la première étape de purification, comme le montrent les gels, l'étape suivante produit un produit très pur, particulièrement adapté à des applications exigeantes. Une fois maîtrisée, l'étape de purification centrale de cette méthode peut être réalisée en quelques heures par une seule personne afin d'obtenir une protéine recombinante hautement pure, adaptée à de nombreuses applications différentes.Par exemple, après avoir suivi cette procédure, les biomolécules purifiées peuvent être utilisées pour d'autres applications, telles que des études d'interaction afin de répondre à des questions comme la force de liaison d'un complexe. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière d'obtenir un produit protéique véritablement pur en utilisant cette double balise d'affinité.

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