Electroporation de Mesenchyme craniofaciale

L’objectif global de cette procédure est d’électro-opérer des macromolécules chargées dans le mésenchyme facial crânien. Pour ce faire, un embryon de stade 28 anesthésié est d’abord placé dans la chambre d’électroporation. L’étape suivante consiste à micro-injecter la solution contenant des macromolécules chargées dans le mésenchyme craniofacial C.

Ceci est rapidement suivi par l’application d’un courant électrique, introduisant ainsi les nucléotides de charge dans les autres cellules. La dernière étape de la procédure consiste à visualiser le tissu électroporé par microscopie à fluorescence. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant des changements dans les tissus crâniens du visage.

Ces résultats peuvent être analysés in vivo ou dans des tissus fixés à l’aide de la fluorescence, de la microscopie ou de l’immunohistochimie. Le principal avantage de l’électroporation par rapport aux méthodes existantes comme la micro-injection et la mutation sont le contrôle tissulaire et temporel de nos outils moléculaires, démonstration de notre procédure aujourd’hui sera Jackie Tabler, postdoctorante dans mon laboratoire. La paire d’électrodes en forme de L requise pour cette procédure est fabriquée à partir d’un fil de tungston de haute pureté, de 0,4 millimètre, pour chaque électrode coupée d’abord huit centimètres du fil.

Ensuite, l’utilisation d’un mastic tel que le blue tack affecte une seringue d’un millilitre au milieu du fil de tungstène, laissant quatre centimètres de fil exposés à partir de l’extrémité de la seringue. Pliez la pointe en forme de L à un centimètre de l’extrémité. Coupez la pointe de manière à ce que l’extrémité mesure 0,5 centimètre de longueur.

Cette pointe est que l’extrémité de l’électrode fait passer l’excès de fil de tungstène parallèlement à la seringue. Il sera utilisé pour connecter le générateur d’impulsions d’électrode après la fabrication de la deuxième électrode. Fixez la paire d’électrodes l’une à l’autre à l’aide de ruban adhésif de sorte que la borne de l’électrode soit parallèle, à un centimètre de distance.

Enfin, fixez les électrodes à un générateur d’impulsions à ondes carrées via des câbles CC. Pour préparer la chambre d’électroporation sur mesure, tapissez le fond d’un plat de 90 millimètres avec environ cinq millimètres de pâte à modeler en plâtre non toxique. Remplissez le plat d’un média d’électroporation en immergeant la scène de plâtre.

Ensuite, utilisez la pince d’horloger numéro cinq pour sculpter un puits en forme de T dans la scène de plâtre pour former l’électroporation. Eh bien, le côté long du puits doit mesurer environ deux millimètres sur deux millimètres sur 10 millimètres, et le côté court doit mesurer deux millimètres sur deux millimètres sur cinq millimètres. Les micro-pipettes pour cette procédure sont fabriquées à partir de capillaires en verre de silicate.

Utilisez un extracteur d’aiguille pour préparer des micropipettes avec un cône de huit à 12 millimètres de long et une pointe fine, écrasez la pointe à environ deux millimètres de la pointe à l’aide d’une pince, créant une rupture dentelée pour installer la micropipette. Tout d’abord, remplissez-le avec environ un microlitre de solution d’injection, qui dans cette démonstration contient des oligonucléotides marqués par fluorescence. Ensuite, fixez la micropipette dans un micromanipulateur et inclinez la micropipette à 50 degrés du plateau.

Réglez la pression d’injection à 20 PSI et calibrez la micropipette pour injecter 30 litres par impulsion. En préparation de l’électroporation, anesthésez une larve de xéno de stade 28 en l’incubant pendant cinq minutes. Dans les milieux d’électroporation, qui sont des milieux amphibiens normaux contenant 0,1 % de benzocaïne, transférez le têtard anesthésié dans la chambre d’électroporation.

Celui-ci est rempli de média d’électroporation. La partie la plus délicate de la procédure est d’insérer le micro-animal dans le têtard. Donc, pour assurer le succès, vous devez fixer l’embryon très fermement, puis appliquer rapidement le courant après la micro-injection.

Positionnez l’embryon dans le puits long de manière à ce que la tête repose dans la jonction T. Avec sa face dorsale vers le bas et sa face ventrale exposée, la tête doit être légèrement surélevée par rapport à la queue à l’aide de pinces, fixez doucement le têtard dans le puits avec la scène de plâtre environnante. Il est important de fixer le têtard pour éviter qu’il ne se contracte lors de l’électroporation, ce qui pourrait entraîner de graves dommages aux tissus du visage.

Pour commencer cette procédure, insérez la pointe de la micro-pipette immédiatement en arrière de la glande de ciment et dans la machine faciale. Injecter 30 nanolitres de solution dans le mésenchyme, rétracter la micro pipette. Alignez rapidement les pointes des électrodes parallèlement à la tête de l’embryon et appliquez huit impulsions carrées de 50 millisecondes et 20 millivolts.

Rétractez ensuite les électrodes à l’aide d’une pince. Relâchez délicatement le têtard du puits. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez le têtard aux trois quarts avec 0,025 milligramme par millilitre.

Les têtards de gentamycine peuvent être incubés dans ce milieu pendant la nuit ou plus longtemps après 24 heures. Écran des têtards par microscopie fluorescente pour une électroporation efficace. L’utilisation de molécules fluorescentes permet un criblage facile des embryons électroporés.

Cette figure montre un lot typique de têtards électroporés d’oligonucléotides morphes environ 1248 et 96 heures après l’électroporation. Aux stades 30, 34 et 44 respectivement. Des oligonucléotides fluorescents peuvent être visualisés dans le visage crânien aux stades 30 et 34.

Au stade 44, la fluorescence peut être détectée dans les cartilages indiqués par les pointes de flèches blanches. La zone hautement autofluorescente est l’intestin. Suite à cette procédure, nous pouvons suivre la lignée des électrocellules ainsi que les exigences moléculaires pour les protéines d’intérêt.

Cette approche peut être combinée à des techniques d’imagerie en direct pour étudier la fonction des gènes au fil du temps au cours du développement craniofacial.