Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Cette vidéo présente une méthode permettant de mettre en place des essais de cristallisation à haut débit de protéines membranaires purifiées à l’aide de cellules B Lipic. Tout d’abord, les lymphocytes B sont préparés en mélangeant un lipide et une protéine membranaire purifiée au détergent est incorporée dans le mélange de lymphocytes B et des essais de cristallisation sont effectués à l’aide d’une inspection visuelle robotisée de nanolitres. L’utilisation d’un microscope optique standard révèle la présence de cristaux.

Une fois formés, les cristaux de protéines peuvent être extraits et congelés pour la collecte de données et la détermination structurée. Le principal avantage de cette technique est qu’en raison du comportement de phase unique des cellules B, l’équipement standard et la robotique disponibles en laboratoire peuvent être utilisés pour la cristallisation. La configuration des cellules B est une technique si simple et vous permet de retirer votre protéine membranaire cible du détergent ma cellule et de la placer dans un milieu liquide.

Cela vous donne un tout nouvel ensemble de conditions à dépister. C’est une méthode si simple qui a été utilisée avec succès sur de nombreuses protéines membranaires qu’il n’y a aucune raison de ne pas l’essayer. La première étape de la cristallisation à base de lymphocytes B est la préparation d’un amphimélange de lipides formant des lymphocytes B.

Ce processus nécessite des efforts considérables et est le plus long. Notez que cela peut prendre plusieurs heures. Les lymphocytes B peuvent se former dans une variété de combinaisons d’amphi lipidiques et sur une large gamme de concentrations.

Pour les points de départ suggérés, voir le tableau un dans le protocole écrit ci-joint, commencer par préparer un millilitre de mélange de capso DMPC à 35 % à un rapport molaire de 2,8 pour une molaire. Pour ce faire, pesez 0,26 gramme de DMPC et 0,09 gramme de Chapo dans un tube. Portez le volume à 1,0 millilitres en utilisant du vortex d’eau désionisée le mélange.

Ensuite, réchauffez le mélange à environ 40 degrés Celsius dans un bain-marie jusqu’à ce qu’il devienne gélifié. Placez le tube sur de la glace. L’échantillon devrait redevenir fluide.

Ensuite, faites à nouveau un vortex pendant quelques minutes, continuez à passer par les étapes de réchauffement, de refroidissement et de vortex jusqu’à ce que le lipide soit complètement dissous. Notez qu’au fur et à mesure que d’autres cycles sont effectués, le mélange peut devenir trouble lors du refroidissement à la fin. Le mélange sera un gel transparent à température ambiante ou au-dessus, et un liquide visqueux sur de la glace par cellules peut être placé à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Ensuite, les protéines purifiées sont incorporées dans le milieu des cellules B. Il s’agit d’un processus simple qui doit être effectué le même jour que la cristallisation, comme le montre la section suivante de la vidéo. Décongelez le mélange de cellules DMPC capso B à température ambiante jusqu’à ce que la phase se transforme en un gel clair.

Placez le mélange sur de la glace pour le liquéfier, puis tourbillonnez-le brièvement pour rétablir une phase homogène des lymphocytes B. À partir de ce moment, conservez le mélange de cellules B et les protéines purifiées sur de la glace. Cela maintiendra le lymphocyte B en phase liquide, ce qui le rendra propice au pipetage.

Ensuite, ajoutez le mélange de cellules B à la protéine solubilisée au détergent purifié dans un rapport de un à quatre, volume à volume. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas jusqu’à ce que la solution devienne claire et homogène. Si des bulles apparaissent, faites-les tourner brièvement dans une centrifugeuse de table.

Incuber le mélange sur de la glace pendant au moins 30 minutes pour favoriser l’incorporation complète de la protéine dans les cellules. Le mélange protéine-cellule est maintenant prêt pour les essais de cristallisation. Des essais de cristallisation seront démontrés à l’aide d’un robot de cristallisation de moustiques.

Cool, une plaque inférieure en V de 96 puits en la plaçant sur de la glace. Pipeter la protéine par mélange cellulaire dans la plaque pour s’assurer que la viscosité de la solution est minimale. Conservez le mélange de protéines par cellules sur de la glace jusqu’à l’étape finale.

Le robot utilisé ici dispose de cinq plates-formes. Placez la microplaque contenant le réservoir sur la plate-forme trois et le couvercle de cristallisation sur lequel les gouttes seront distribuées sur la plate-forme cinq. Placez ensuite la protéine par plaque cellulaire sur la plate-forme quatre la plus proche de la position de distribution.

Cela garantit que le mélange protéine-cellule est le dernier à être récupéré par le robot et qu’il est immédiatement libéré. À l’aide du logiciel qui lance le cycle, le robot prélèvera la solution de réservoir suivie du mélange de protéines et de cellules et les distribuera sur le couvercle sous forme de gouttes pour éviter l’échauffement et l’augmentation de la viscosité pendant la distribution. Ne programmez pas le moustique pour qu’il mélange le réservoir avec le mélange protéine-cellule dès la fin de la course.

Retirez la plaque de protéine de cellule de l’instrument et placez-la sur de la glace. Retirez le couvercle de l’instrument et placez-le sur la plaque contenant la solution du réservoir de manière à ce que les gouttes soient inversées. Incuber l’assiette à 20 degrés Celsius.

Notez que d’autres températures peuvent également être testées pour la formation et l’optimisation des cristaux. Des températures plus élevées induisent la phase lamellaire, qui a l’avantage de pré-organiser la protéine en couches. Les températures comprises entre quatre degrés Celsius et 20 degrés Celsius peuvent être contrôlées.

Des températures inférieures à quatre degrés Celsius peuvent provoquer une précipitation des lipides sur de longues périodes le premier, le troisième jour et chaque semaine par la suite, évaluez l’apparence et la croissance des cristaux à l’aide d’un microscope optique standard. On voit ici une image en fond clair et une image UV de cristaux en forme d’aiguille observés dans des conditions d’assaut seulement. La fluorescence n’a pas été détectée sur les cristaux, indiquant un faux positif dans cette image.

Un cristal en forme de bâtonnet s’est formé lorsque le méthylpropane diol a été utilisé comme précipitant. Le cristal devient fluorescent chaque semaine, ce qui indique qu’il pourrait s’agir d’un cristal de protéine, mais il s’est avéré non protenace en utilisant la diffraction des rayons X. On voit ici un cristal observé environ quatre semaines après la mise en place des essais.

La forte fluorescence sous lumière UV confirme qu’il s’agit d’un cristal de protéine. Comme vous l’avez regardé sur cette vidéo. Une fois que les lymphocytes B sont disponibles, ils peuvent être mélangés directement avec des protéines purifiées et, à partir de ce moment, la cristallisation se déroule presque exactement comme les protocoles standard basés sur les détergents.

Un autre avantage distinct est la capacité de doper les lymphocytes B avec des lipides spécifiques à des fins d’optimisation. Il y a vraiment beaucoup de polyvalence avec la technique et elle est si simple à utiliser qu’elle devrait être essayée pour tous les projets de cristallisation de protéines membranaires.