Name: En utilisant la génétique inverse pour manipuler les gènes NSS du virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche pour améliorer la sécurité vaccinale et lefficacité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Apprenez la génétique inverse pour créer des mutants du virus de la fièvre de la vallée du Rift souche MP-12. Cette méthode permet de développer des vaccins vivants atténués plus sûrs et efficaces.

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Ce travail a été financé par la concession numéro 5 U54 AI057156-07 par le centre régional de l&#39;Ouest d&#39;excellence (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 de l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses, et d&#39;un financement interne du Centre de développement des vaccins Sealy à l&#39;Université de Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Systèmes de génétique inverse pour les RVFV ont été développés par plusieurs groupes en utilisant le promoteur T7 2,4,5 ou une souris 3 ou 4 humains Pol-i promoteur. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole visant à générer des recombinants RVFV MP-12 souches en utilisant BHK/T7-9 cellules 15 qui expriment de façon stable la T7 RNA polymérase. L&#39;efficacité de la récupération virale varie en fonction de l&#39;état de BHK/T7-9 cellules, le montant des plasmides, le nom...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM)-alpha </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Modifié par Dulbecco milieu essentiel minimum </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modified Eagle Medium (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Cellgro </td><td> 30 à 240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Bouillon tryptose phosphate </td><td> MP Biomédical </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Gélose Noble </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Aérosol couvercle étanche </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0,33% de solution de rouge neutre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT cellules MEF </td><td> InvivoGen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> InvivoGen </td><td> Ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zéocine </td><td> InvivoGen </td><td> ANT-zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Quanti-Bleu </td><td> InvivoGen </td><td> rep-QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 cellules 15 </td><td> Université de Gifu, au Japon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellules Vero E6 </td><td> ATCC </td><td> LCR-1586 </td><td></td></tr></table>

en utilisant la génétique inverse pour manipuler les gènes nss du virus de la fièvre vallée du rift mp-12 souche pour améliorer la sécurité vaccinale et l&#39;efficacité

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Virus de la fièvre vallée du Rift (FVR), qui provoque une fièvre hémorragique, des troubles neurologiques ou de cécité chez les humains, et un taux élevé d&#39;avortement et de malformations fœtales chez les ruminants 1, a été classé comme un HHS / USDA chevauchent agent de sélection et un groupe de risque 3 pathogène. Il appartient au genre Phlebovirus de la famille des Bunyaviridae et est l&#39;un des membres les plus virulents de cette famille. Plusieurs systèmes de génétique inverse pour la souche RVFV MP-12 2,3 vaccins ainsi que des souches de type sauvage RVFV 4-6, y compris les ZH548 ZH501 et ont été développés depuis 2006. Le MP-12 souche (qui est un groupe de risque 2 et un agent pathogène non-sélection) est fortement atténué par plusieurs mutations dans son M-et L-segments, mais porte toujours virulentes S-segment d&#39;ARN 3, qui code une virulence fonctionnelle facteur, NSS. Le rMP12-C13type (C13type) transportant 69% dans le châssis-suppression de NSS ORF manque toutes les fonctions connues NSs, tandis qu&#39;il réplique que efficient tout comme MP-12 dans des cellules dépourvues VeroE6 type I IFN. NSs induit un arrêt de la transcription de l&#39;hôte dont l&#39;interféron (IFN)-bêta ARNm 7,8 et favorise la dégradation de la double-brin protéine kinase dépendante de l&#39;ARN (PKR) au niveau post-traductionnelles. 9,10 IFN-bêta est transcriptionnellement régulés par interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB et la protéine activatrice-1 (AP-1), et la liaison de l&#39;IFN-bêta à IFN-alpha/beta récepteur (IFNAR) stimule la transcription de l&#39;IFN-alpha gènes ou d&#39;autres gènes d&#39;interféron stimulée (ISGS) 11, ce qui induit des activités d&#39;accueil antiviraux, alors que la suppression de la transcription d&#39;hôte incluant l&#39;IFN-bêta du gène par le NSS empêche le gène de ceux upregulations ISGS en réponse à la réplication virale, bien que l&#39;IRF-3, NF-kB et l&#39;activateur protein-1 (AP-1) peut être activé par RVFV7. . Ainsi, NSS est une excellente cible pour atténuer encore MP-12, et d&#39;améliorer la réponse immunitaire innée de l&#39;hôte en abolissant la fonction de suppression de l&#39;IFN-bêta. Voici, Nous décrivons un protocole pour générer un SSN-12 recombinante MP encodage muté, et fournir un exemple d&#39;une méthode de dépistage pour identifier les mutants NSs manque la fonction pour supprimer synthèse de l&#39;ARNm de l&#39;IFN-bêta. En plus de son rôle essentiel dans l&#39;immunité innée, l&#39;IFN de type I est important pour la maturation des cellules dendritiques et l&#39;induction d&#39;une réponse immunitaire adaptative 12-14. Ainsi, les mutants NSs induisant l&#39;IFN de type I sont plus atténuées, mais en même temps, sont plus efficaces pour stimuler des réponses immunitaires que l&#39;hôte de type sauvage MP-12, qui fait des candidats idéaux pour des approches de vaccination.

Le système de génétique inverse pour le virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche vaccinale est un outil utile pour créer des supplémentaires MP-12 mutants avec une atténuation accrue et l&#39;immunogénicité. Nous décrivons le protocole de générer et caractériser NSs souches mutantes.

En utilisant la génétique inverse pour manipuler les gènes NSS du virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche pour améliorer la sécurité vaccinale et l&#39;efficacité

Le virus de la fièvre riftia (RVFV), qui provoque la fièvre hémorragique, des troubles neurologiques ou la cécité chez l'homme, ainsi qu'un taux élevé d'avortements et de pertes fœtales...

Cette procédure permet de générer un virus recombinant de la fièvre de la vallée du Rift, souche MP-12, exprimant une NSS mutée par génétique inverse, dans le but de caractériser les phénotypes pour le développement de vaccins. Premièrement, à l’aide d’un système de transfection dans des cellules BHK-T7-9, qui expriment de façon stable la polymérase ARN T7, récupérez des mutants recombinants de la souche MP-12, puis amplifiez le mutant recombinant de la souche MP-12 récupéré dans des cellules Vero E6 et dosez les mutants MP-12 amplifiés par dosage des plaques. La dernière étape de la procédure consiste à rechercher l’absence de suppression de l’interféron alpha ou bêta par les protéines NS mutées.En fin de compte, les résultats peuvent faciliter la préparation d'un vaccin vivant atténué candidat contre la fièvre de la vallée du Rift au moyen d'un système de génétique inverse. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'introduction aléatoire de mutations dans le génome viral à l'aide d'azote chimique ou de passages en série, réside dans la capacité d'insérer des mutations ciblées dans le génome viral à l'aide d'un système génique. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions essentielles dans le domaine des vaccins contre la fièvre de la vallée du Rift, comme l'importance du facteur majeur de virulence NSS dans l'immunogénicité des candidats-vaccins.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le virus de la fièvre à virus du Nil occidental, comme dans la forme ciblée, nécessite des blocs et une visualisation des blocs selon une technique optimisée. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de récupération virale et d'hydratation sont difficiles à apprendre, étant donné qu'un protocole étape par étape pour cette méthode n'a pas encore été publié. À l'aide de boîtes de six centimètres, déposez les cellules rénales de hamster bébé T79, qui expriment de façon stable la polymérase ARN T7, puis placez-les dans un incubateur à une confluence cellulaire de 70 à 80 %. Changez le milieu par du MEM alpha complet sans hygromycine B. Commencez le processus de transfection dans l'heure suivant pour la récupération du virus de la fièvre de la vallée du Rift.Créez un jeu de plasmides codant pour les ARN génomiques viraux afin de l'expression d'ARN viraux complets et un deuxième jeu codant pour les cadres de lecture ouverts des gènes viraux afin de l'expression des protéines virales. Ajoutez maintenant 30 microlitres de Transit-LT1 à 385 microlitres d'Opti-MEM dans un tube de 1,5 millilitre. Vortexez brièvement et incubez pendant cinq minutes.À température ambiante, ajouter lentement les liposomes obtenus aux jeux de plasmides de 10 microgrammes en mélangeant doucement par pipetage, puis incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter le mélange de transfection aux cellules bhk T seven nine goutte à goutte et incuber pendant 24 heures. Remplacer le surnageant de culture par du milieu MEM alpha complet et poursuivre la culture pendant quatre jours supplémentaires. Récupérer les surnageants de culture dans un tube de 50 millilitres et éliminer les débris cellulaires par centrifugation.Maintenant, transférez par aspiration les surnageants dans des tubes cryogéniques de cinq millilitres à bouchon vissable et conservez ce lot viral P0 à moins 80 degrés Celsius afin de faciliter les expériences ultérieures. Amplifiez le virus P0 dans des cellules dépourvues des gènes d'interféron alpha et bêta : faites croître des cultures de Vero E6 à 80 % de confluence dans du DMEM complet, remplacez le milieu par le virus P0 dilué et incubez pendant une heure.Retirez l'inoculum et mettez en culture dans 10 millilitres de DMEM complet pendant trois à quatre jours, jusqu'à ce que l'effet cytopathique sur les cellules Vero E6 devienne apparent. Récupérez le surnageant comme décrit précédemment et désignez les échantillons comme E6P1. À l'aide de plaques à six puits, faites croître les cellules Vero E6 jusqu'à une confluence de 80 % dans du DMEM complet. Aspirez le milieu des cellules Vero E6 et ajoutez 400 microlitres de dilutions sérielles dix fois plus faibles de la préparation virale E6P1. Incubez pendant une heure.Entre-temps, préparez deux tubes de 15 millilitres pour le tube de recouvrement agar. Un tube A contenant sept millilitres d'agar noble à 1,2 % dans l'eau et deux tubes B contenant chacun sept millilitres de MEM complet 2 x et de bouillon phosphate à triple dose à 10 %. Après 15 minutes dans les bains-marie, versez le tube B dans le tube A et utilisez une pipette pour les mélanger. Remplacez l'inoculum viral par deux millilitres par puits d'une mixture un-à-un des tubes A et B. Poursuivez la culture des cellules pendant trois à quatre jours.Préparez le recouvrement à la tarière en ajoutant 1,2 % d'agar noble à deux fois le milieu MEM complet, puis ajoutez du rouge neutre dans le tube A et le tube B, et un troisième tube étiqueté rouge neutre. Placez le tube A dans un bain-marie à 42 degrés Celsius et les deux autres tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Mélangez ensuite ensemble sept millilitres du tube A, sept millilitres du tube B et 0,5 millilitre de rouge neutre. Répartissez deux millilitres du mélange dans chaque puits d'une plaque de six puits et incubez la plaque toute la nuit. Déterminez maintenant le nombre d'unités formant des colonies par millilitre. Les fibroblastes embryonnaires de souris sauvages C57 codent pour un gène de phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, inducible par NF-kappa B et IRF3 ou IRF7.Ici, nous évaluons l'activité de sécrétion induite par les réponses immunitaires innées. Infecter des cellules semi-confluentes dans des plaques de 12 puits avec soit le MP 12 recombinant codant pour des mutations NS, soit le contrôle MP 12, puis incuber pendant une heure. Retirer l'inoculum, ajouter un millilitre par puits de DMEM complet et cultiver pendant 14 heures. Récupérer les surnageants de culture pour un dosage de sécrétion ; à chaque puits d'une plaque de 96 puits, ajouter 200 microlitres de quantum blue et 50 microlitres de chaque échantillon, sceller la plaque et l'incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Mesurez la DO à 650 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Le virus de la fièvre de la vallée du Rift possède un génome ARN à sens négatif tripartite nommé segments S, M et L, comparé au NSS de la souche MP-12. Le cadre de lecture ouvert du type C 13 est tronqué de 69 %. Typiquement, le système de génétique inverse génère des virus recombinants MP-12 viables avec des titres supérieurs à 1 × 10⁶ PFU par millilitre pour le virus de type C 13.Les formes de N dépourvues de fonctions produisent de grandes plaques turbides, tandis que MP 12 forme des plaques claires de tailles variées par rapport aux cellules infectées de manière factice après 14 heures d'infection. Les cellules méthylées de type sauvage C57 infectées par MP 12 n'augmentent pas le niveau de séep en culture.Le surnageant, en revanche, une infection de type C 13 induit une augmentation du taux d'exsudat à 14 heures post-infection. Des transferts Northern réalisés à l'aide d'une sonde ARN spécifique à l'ARNm de la souris ISG 56 confirment la surexpression de l'ARNm ISG 56 en l'absence d'expression de N'S. En suivant cette procédure comme méthode, des expériences telles que l'immunisation de souris et le test d'anticorps neutralisants peuvent permettre d'aborder des questions telles que l'immunogénicité du mutant NSS. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la fièvre de la vallée pour explorer les fonctions des gènes non structuraux dans les cellules et les animaux infectés.N'oubliez pas que manipuler un virus infectieux peut être extrêmement dangereux ; prenez donc toujours des précautions pour éviter d'inhaler les AOG. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment récupérer et titrer des souches recombinantes de MP 12, ainsi que comment sélectionner des mutants NSS dépourvus de fonction de suppression de l'interféron alpha bêta.

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En utilisant la génétique inverse pour manipuler les gènes NSS du virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche pour améliorer la sécurité vaccinale et l'efficacité

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