Name: Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Découvrez deux méthodes complémentaires pour évaluer la chimio-attraction du sperme de grenouille : l'essai à deux chambres et la chambre de Zigmund. Ces techniques permettent de quantifier et d'analyser le mouvement des spermatozoïdes.

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Nous remercions le Laboratoire WM Keck Bioimaging pour l&#39;utilisation de leur poste de travail vidéo microscopie. Cette étude a été soutenue par NSF Grant IBN-0615435.

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Chimiotactisme des cellules en mouvement par le mouvement soit amiboïde ou de flagelles alimenté par la natation se trouve dans de nombreux contextes biologiques et l&#39;étude de ce phénomène requiert la disponibilité des tests pratiques et fiables. Quelques exemples de ce phénomène, comme l&#39;attraction des spermatozoïdes à un œuf de l&#39;oursin ou le ramassage des cellules moisissure visqueuse pour former un corps de fructification, ont un impact visuel immédiat. La quantification de ce phénomène a été entrepris d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;article </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 35/1147 </td><td></td></tr><tr><td> 12 mm de diamètre extérieur avec inserts membrane 12 um des pores </td><td> Millipore </td><td> PIXP01250 </td><td> Nous avons précédemment utilisé Costar-Corning plaque transwell # 3403-maintenant discontinué </td></tr><tr><td> Zigmond chambre </td><td> Neuroprobe </td><td> Z02 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;huile de silicone </td><td> General Electric </td><td> SF1154 </td><td> Equivalent à Dow Corning 550 Fluid </td></tr><tr><td> Image J logiciels </td><td> Wayne Rasband, Services Direction de la recherche, Institut national de la santé mentale </td><td> Téléchargement gratuit à http://rsbweb.nih.gov/ij </td><td> Programme Java qui s&#39;exécute sur Windows, Linux et Mac </td></tr><tr><td> MtrackJ logiciels </td><td> Erik Meijering / Imagescience / <a href="http://www.bigr.nl/">Groupe d&#39;imagerie biomédicale</a> , Erasmus MC - University Medical Center de Rotterdam </td><td> Téléchargement gratuit à <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</a> </td><td> Programme Java qui s&#39;exécute sur Windows, Linux et Mac </td></tr><tr><td> Virtual Dub logiciels </td><td> <a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html">GNU General Public Licence</a> logicielle </td><td> Téléchargement gratuit via <a href="http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html</a> </td><td> Instructions d&#39;installation sur le site Image J sous plugins; pour Windows uniquement </td></tr><tr><td> cellSens logiciels </td><td> Olympus </td><td> Voir le site: <a href="http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/p</a>roduct.asp? produit = 1070 </td><td> Contrôles et acquiert des images d&#39;une variété de caméras. A également une capacité de traitement de l&#39;image </td></tr></tbody></table>

deux types de tests pour la chimio-attraction frog sperme détection

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Chimio-attraction du sperme chez les invertébrés peuvent être suffisamment robuste que l&#39;on peut placer une pipette contenant le peptide attractifs en une suspension de spermatozoïdes et de l&#39;accumulation de sperme au microscope de visualiser autour de la pipette de 1. Chimio-attraction du sperme chez les vertébrés comme les grenouilles, les rongeurs et les humains est plus difficile à détecter et nécessite des dosages quantitatifs. Ces essais sont de deux types principaux - des dosages qui quantifier le mouvement des spermatozoïdes à une source de chimiotactique, dits tests de l&#39;accumulation de sperme, et des essais qui fait suivre les trajectoires individuelles de natation de sperme. Dosages d&#39;accumulation de sperme sont relativement rapides permettant des dizaines ou des centaines de tests à faire en une seule journée, permettant ainsi aux courbes dose-réponse et des cours de temps pour être réalisée relativement rapidement. Ces types de tests ont été largement utilisées pour caractériser les nombreux systèmes chimio-attraction bien établi - par exemple, chimiotaxie des neutrophiles au bacpeptides pièces et de sperme à la chimiotaxie liquide folliculaire. Dosages de suivi du sperme peut être plus de travail mais offrent des données supplémentaires sur la façon chemoattractancts vraiment altérer les chemins de natation que le sperme prendre. Ce type de test est nécessaire pour démontrer l&#39;orientation du mouvement des spermatozoïdes par rapport à l&#39;axe du gradient chemoattrractant et de visualiser tourne caractéristique ou les changements d&#39;orientation qui mettent le sperme plus proche de l&#39;œuf. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour chacune de ces deux types de tests. Le dosage de l&#39;accumulation du sperme utilisé est appelé un &quot;deux chambres&quot; dosage. Le sperme d&#39;amphibiens sont placés dans un insert plaque de culture de tissu avec un plancher de filtre en polycarbonate ayant des pores de diamètre 12 um. Inserts avec les spermatozoïdes sont placés dans des puits de culture de tissu plaque contenant du tampon et une chemoatttractant attentivement la pipette dans le fond du puits où le plancher et le mur (voir Fig. 1). Après incubation, l&#39;insert supérieure contenant le réservoir de spermatozoïdes est soigneusement removed, et du sperme dans la chambre de fond qui ont traversé la membrane sont enlevées, granulés et ensuite comptés par hémocytomètre ou cytomètre en flux. Le test de suivi du sperme utilise une chambre Zigmond initialement développé pour l&#39;observation de la chimiotaxie des neutrophiles et modifiés pour l&#39;observation de spermatozoïdes par Giojalas et collègues 2,3. La chambre se compose d&#39;une lame de verre épais dans lequel deux auges verticaux ont été usinées. Ce sont séparées par une plate-forme d&#39;observation de 1 mm de large. Après application d&#39;un couvercle en verre, les spermatozoïdes sont chargés dans une auge, l&#39;agent chimiotactique dans l&#39;autre et le mouvement des spermatozoïdes individuels visualisées par microscopie vidéo. Des images vidéo sont ensuite analysées en utilisant le logiciel pour identifier les mouvements cellulaires à deux dimensions dans le plan xy en fonction du temps (XYT ensembles de données) qui forment la trajectoire de chaque spermatozoïde.

Les œufs et les revêtements extracellulaire autour des œufs fréquemment communiqué peptides, protéines et petites molécules qui communiquent avec le sperme pour les guider vers l&#39;ovule favorisant ainsi la fécondation. En utilisant le sperme de grenouille nous décrire et comparer deux classes de tests utilisés pour détecter la chimio-attraction des spermatozoïdes - essais d&#39;accumulation de sperme et des tests de suivi du sperme.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

La chimioattraction des spermatozoïdes chez les invertébrés peut être suffisamment robuste pour qu'il soit possible de placer une pipette contenant le peptide attractif dans une suspension de spermatozoïdes...

Ici, deux méthodes différentes pour évaluer l'attraction chimiotactique des spermatozoïdes sont décrites pour le test à deux chambres. Des spermatozoïdes de grenouille activés sont d'abord distribués dans des inserts munis de membranes poreuses au fond, placés dans les puits d'une plaque de 24 puits. Une fois les spermatozoïdes en place, un chémo-attractant est ensuite ajouté soigneusement au fond du puits afin de créer un gradient chémo-attractif.Ensuite, les spermatozoïdes sont incubés afin de laisser aux cellules le temps de traverser la membrane poreuse en réponse au gradient chimiotactique. Enfin, l'insert est retiré et les spermatozoïdes ayant migré au fond du puits dans le test à deux chambres sont dénombrés à l'aide d'un hémocytomètre. En définitive, l'activité des chimioprotéines attractives pour les spermatozoïdes peut être comparée et quantifiée, par exemple par une analyse de courbe dose-réponse pour le test de suivi au compartiment Zigman.Un couvre-objet est d'abord appliqué sur la chambre zigman à l'aide d'huile de silicone, puis placé à l'envers au-dessus de l'ouverture circulaire d'un microscope. Un côté de la chambre trth est ensuite rempli avec du sperme de grenouille activé. Ensuite, l'autre côté trth est rempli avec la solution de chémoattractant.Après cinq minutes, le gradient chimiotactique se forme, et à ce moment-là, on peut filmer les spermatozoïdes qui nagent le long du gradient. En fin de compte, les images obtenues à partir du test de suivi dans la chambre de Zigmund peuvent être analysées afin de déterminer la vitesse des spermatozoïdes ainsi que les profils et trajectoires cinétiques chimiotactiques de leur déplacement en réponse à un gradient d'attractant chimique. Ces deux méthodes de détection de la chimiotaxie des spermatozoïdes sont complémentaires et produisent des types de données différents.Le test à deux compartiments permet aux spermatozoïdes de traverser une membrane poreuse, ce qui permet de quantifier la réponse des spermatozoïdes à un chimioattractant. La démonstration visuelle du test à deux compartiments est essentielle, car les étapes initiales d'ajout des spermatozoïdes et du chimioattractant, ainsi que les étapes finales de retrait des spermatozoïdes et des inserts, exigent une précision rigoureuse dans la manipulation de la micropipette. Le test de la chambre de Zigmund utilise une vidéo pour enregistrer la nage des spermatozoïdes dans un gradient chimiotactique.Cela permet de déterminer des paramètres dynamiques tels que la vitesse et la direction. Le principal avantage du test de suivi dans la chambre de Zigmund par rapport au test à deux chambres est que la nage des spermatozoïdes peut être visualisée et analysée à l’aide de plusieurs paramètres dynamiques. Éliminer les spermatozoïdes d’un testicule de grenouille en perçant des trous à une extrémité et en injectant un tampon à l’aide d’une seringue et d’une aiguille à l’extrémité opposée.Après avoir extrait les spermatozoïdes des testicules de la grenouille, estimer le nombre de cellules recueillies à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, diluer la suspension stock de spermatozoïdes avec du tampon de Ringer pour ovocytes afin d’obtenir une densité de deux fois 10⁷ cellules par millilitre. Évaluer la mobilité des spermatozoïdes en diluant cinq microlitres de spermatozoïdes au 1/10 avec du tampon F1 et en visualisant le mouvement à l’aide d’optiques en contraste de phase.Ensuite, prélevez à l’aide d’une micropipette 700 microlitres de tampon F1 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire en plastique à 24 puits. Puis diluez 100 microlitres de la suspension de spermatozoïdes avec 900 microlitres de tampon F1 à température ambiante dans un tube de microcentrifugeuse afin d’activer la mobilité des spermatozoïdes par choc osmotique pour chaque essai à réaliser. Placez un insert de 12 millimètres de diamètre extérieur et de 12 micromètres de porosité dans un puits rempli de tampon, en veillant à ce que l’insert soit placé de manière excentrée, laissant un espace sur un côté.Ensuite, à l’aide d’une micropipette à extrémité coupée, transférer immédiatement 400 microlitres de spermatozoïdes activés pour la mobilité dans le puits ; appliquer la suspension de spermatozoïdes sur la paroi de l’insert, en laissant le liquide descendre le long de la paroi jusqu’au filtre situé au fond de l’insert. Ensuite, pipeter soigneusement 50 microlitres de l’agent chimiotactique dans chaque puits de la plaque, dans l’espace situé entre le puits et l’insert décentré.Faire attention à déposer la goutte à l'endroit où le côté et le fond du puits se rejoignent. Retirer la pipette sans perturber le système. Une fois tous les tests mis en place.Laisser la plaque à température ambiante jusqu'à ce que le premier essai démarré ait incubé pendant 50 minutes. Ensuite, après le premier, stabiliser soigneusement l'insert avec une main. Arrêter l'essai en éliminant la majeure partie, voire la totalité, de la suspension de spermatozoïdes de la chambre supérieure à l'aide d'une micropipette.Une fois que les spermatozoïdes ont été transférés depuis la chambre supérieure, retirez immédiatement l'insert et jetez-le. Mélangez ensuite les suspensions de spermatozoïdes dans chaque puits afin de remettre en suspension tout spermatozoïde qui se serait déposé au fond. Transférez alors l'intégralité de la suspension de spermatozoïdes depuis chaque puits dans des tubes individuels de microcentrifugation.Ajouter du formaldéhyde à une concentration finale de 0,5 % volume/volume. Récupérer les spermatozoïdes fixés en culot dans chaque tube. Utiliser le bouton-poussoir pendant dix secondes pour centrifuger sur une microcentrifugeuse personnelle.Ensuite, retirez tout le liquide surnageant sauf 100 microlitres de chaque tube et resuspendez le culot dans ce volume. Ensuite, diluez 20 microlitres de la suspension de spermatozoïdes au 1/10 avec de l'eau distillée et comptez les spermatozoïdes sur un hémocytomètre. À l’aide de l’objectif 40 x d’un microscope droit, le test à deux chambres fournit des résultats quantitatifs adaptés aux études de réponse dose-dépendante ou aux comparaisons entre attractants.Par exemple, l'eau d'œufs de grenouille contient l'attractant chimiotactique pour les spermatozoïdes, l'alluring, comme indiqué par les symboles rouges. L'eau d'œufs provoque une augmentation suivie d'une diminution du nombre de spermatozoïdes traversant la membrane poreuse lorsque la dose d'attractant chimiotactique pour les spermatozoïdes augmente. En revanche, l'albumine de sérum bovin, représentée par les symboles blancs, a peu d'effet dans la même gamme de doses.Avant de commencer le test de la chambre de Zigman, vérifiez d'abord que la station de travail équipée du microscope inversé est prête pour la vidéographie. Configurez le microscope. Lancez le logiciel de contrôle de la caméra afin d'acquérir sept images par seconde.Vérifiez que la caméra est focalisée sur la plateforme d'observation et que la sortie est envoyée vers l'écran de l'ordinateur. Ensuite, vérifiez que le champ microscopique inclut la majeure partie ou la totalité de la largeur de la plateforme d'observation. Préparez ensuite une suspension de spermatozoïdes de grenouille dans du tampon oocyte ringer, ainsi qu'un chémotactique dilué à la concentration appropriée avec du tampon F1, et conservez les deux sur glace jusqu'à utilisation.Ensuite, en partant d'une chambre de Zigmund propre et sèche, utilisez une micropipette pour déposer une ligne d'environ quatre microlitres d'huile de silicone, à environ cinq millimètres du bord extérieur de chaque trth et parallèlement à celui-ci. Placez ensuite une lame de couverture de 22 par 40 millimètres sur la chambre, en laissant l'huile de silicone s'étaler uniformément jusqu'au bord extérieur de chaque trth.Retournez maintenant la chambre et placez-la au-dessus de l’ouverture circulaire large dans le plateau du microscope. En prenant soin que le verre de couverture n’entre pas en contact avec le plateau, activez 20 microlitres du sperme xap dans la solution saline pour ovocyte en mélangeant un volume de solution saline avec dix volumes de tampon F1 à température ambiante. À l’aide d’une micropipette à embout coupé, aspirez immédiatement 70 microlitres du sperme dont la mobilité a été activée.Ensuite, maintenez la micropipette selon un faible angle et placez la pointe à l'ouverture latérale. Remplissez le trth et le pont par action capillaire. Remplissez ensuite le trth opposé de la même manière en utilisant une solution chimiotactique, car les spermatozoïdes xap ont une durée de mobilité limitée.Commencez l’enregistrement vidéo dans les trois minutes et poursuivez pendant cinq minutes. Le test de suivi dans la chambre de Zigman permet la microscopie vidéo de la nage des spermatozoïdes dans un gradient de chimiopéactif. Ce film montre un enregistrement de spermatozoïdes nageant sur la plateforme d’observation, leurs trajectoires étant tracées en rouge comme indiqué sur ce schéma.Les trajectoires des spermatozoïdes sont constituées de segments, chaque segment étant indiqué par une flèche et représentant le déplacement du spermatozoïde entre deux images successives du film. Les segments de trajectoire illustrent le comportement natatoire de chaque spermatozoïde et mettent en évidence des motifs tels que des cercles ou des changements de direction. À partir de ces données, on peut déterminer la vitesse et la direction de chaque segment, ou bien les propriétés de l'ensemble des segments appartenant à une trajectoire ou à un groupe de trajectoires.Par exemple, la distance linéaire nette. Le vecteur reliant le début d'une trajectoire à sa fin possède une composante selon l'axe des x et forme un angle thêta avec l'axe des x, comme illustré ici en rouge. Cet angle thêta devrait diminuer et la progression selon l'axe des x devrait augmenter en présence d'un gradient de chémotactisme. Ces modifications indiquent que les spermatozoïdes montrent une préférence pour la nage vers le haut du gradient, en direction du chémoattractant trth. Lors de la réalisation de ces deux tests, il est essentiel de veiller au chargement correct des spermatozoïdes et du chémoattractant dans chaque dispositif, car cela est crucial pour obtenir des gradients chimiotactiques reproductibles et évaluer correctement la performance des spermatozoïdes.

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