Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

Dans cette vidéo, les activités de la kinase et de la phosphatase sont surveillées tout au long du cycle cellulaire à l’aide du transfert d’énergie de résonance de Forrester ou fret. Ici, une sonde d’activité de type polo kinase one ou LK one a la protéine fluorescente cyan CFP placée à une extrémité et la protéine fluorescente jaune YFP placée à l’autre. Cette sonde est transfectée dans des cellules U2 OS.

Ensuite, pour examiner l’état de phosphorylation des cibles LK one pendant la transition G deux deux M, les cellules TRANSFECTED U2 OS sont soumises à une imagerie de fluorescence en accéléré. Lorsque CFP et YFP sont à proximité et que CFP est excité, l’énergie est transférée à YFP et l’admission YFP peut être détectée. Cependant, lorsque la sonde devient phosphorylée, un changement de confirmation dans la protéine sépare CFP et YFP.

Maintenant, lorsque CFP est excité, une forte émission de CFP et seulement une faible émission YFP sont détectées La quantification du rapport d’émission YFP après excitation CFP et YFP démontre que l’activité de PLK un augmente en G deux et atteint un pic pendant la mitose. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le tournage géométrique standard, est qu’une attention particulière est portée au fait que le cycle cellulaire n’est perturbé ni par les conditions de tournage ni par l’expression d’une sonde. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cycle cellulaire, telles que où et quand des kinases ou des phosphatases spécifiques sont activées.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les enzymes régulées par le cycle cellulaire, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où des conditions différentes sont requises, telles que les tests de prolifération cellulaire. Pour surveiller le cycle cellulaire humain, les cellules U2 OS sont transfectées à l’aide d’une sonde d’activité PK one basée sur Fret. À l’aide d’une méthode standard de transfection de phosphate de calcium, les cellules sont sélectionnées dans de la mycine pure pendant au moins sept jours.

Cela permet d’enrichir la population de cellules exprimant la sonde et de limiter le nombre de cellules ayant des niveaux d’expression toxiques ou des niveaux d’expression qui affectent gravement le cycle cellulaire. Les clones stables sont ensuite sélectionnés par dilution limitée de CFP et YFP est ensuite examiné pour vérifier qu’ils sont présents dans toutes les cellules à peu près dans le même rapport. Si certaines cellules ne contiennent que de la CFP ou du YFP, la recombinaison s’est probablement produite dans ce cas, répétez la préparation du plasmide en utilisant des bactéries moins sujettes à la recombinaison homologue, telles que deux cellules, puis linéarisez le plasmide et répétez la transfection.

Une fois que les cellules expriment la sonde de manière stable, ensemencez-les sur des boîtes à fond de verre numéro 1,5 après qu’elles se soient fixées et qu’elles soient confluentes à 30 à 50 %. Changez le milieu pour un milieu indépendant du CO2 et ne contenant pas de rouge de phénol, montez les cellules sur un microscope à épifluorescence motorisé Avec contrôle de la température réglé à 37 degrés centigrades. Le microscope doit être équipé de filtres d’excitation et d’émission CFP et YFP.

Un miroir ROIC adapté à la surveillance de CFP et YFP et un objectif adapté à la résolution requise. Ici, un objectif aérien 20 x NA 0,75 est utilisé. À l’aide de la lumière transmise, faites la mise au point sur les cellules.

N’utilisez pas de lumière fluorescente à ce stade, car elle induirait une réponse de stress qui pourrait perturber le cycle cellulaire. Pour éviter la phototoxicité, réglez la flexion au maximum disponible qui permet la résolution subcellulaire requise. Pour cette expérience, il devrait être possible de distinguer le noyau et le cytoplasme.

Réglez un temps d’exposition court et insérez un filtre à haute densité neutre. Ensuite, acquérez une image de test de 12 ou 16 bits À l’aide de l’excitation et de l’émission YFP, ajustez le temps d’exposition et les filtres de densité neutre de sorte que l’intensité moyenne d’une cellule soit approximativement égale à l’intensité du bruit de fond, plus cinq fois la différence entre les intensités de fond minimale et maximale. Pour vérifier que les images ne sont pas saturées, examinez l’intensité de fluorescence de l’image de l’échantillon.

L’intensité maximale de l’image doit être inférieure à la moitié de la plage dynamique pour tenir compte des différences d’intensité lorsque les cellules entrent en mitose. Ensuite, répétez ce processus à l’aide des filtres d’excitation CFP et d’émission YFP. Sélectionnez plusieurs régions avec des cellules transfectées, en excluant les régions utilisées pour la mise au point et l’optimisation des conditions d’exposition.

Étant donné que ces procédures peuvent avoir invoqué une réponse au stress, assurez-vous que l’intensité maximale est inférieure à la moitié de la plage dynamique dans toutes les cellules. Demandez au logiciel d’acquérir deux images toutes les 45 minutes en utilisant l’excitation YFP, l’émission YFP et l’excitation CFP. Filtres d’émission YFP.

Réglez également la durée totale de l’expérience pour qu’elle dépasse la durée du cycle cellulaire. Une fois que tout est réglé, commencez à acquérir des images une fois l’acquisition terminée, ouvrez les images acquises et surveillez le temps du cycle cellulaire de la mitose à la mitose. Pour les cellules qui expriment la sonde transfectée ici, le temps du cycle cellulaire était d’environ 20 à 25 heures.

Comparez-les aux données de contrôle pour le type de cellule utilisé. Si le temps du cycle cellulaire correspond aux temps de référence, la frette peut être analysée. Une fois le timing vérifié, les images peuvent être analysées.

L’analyse peut être effectuée par la plupart des logiciels dédiés à la microscopie. Ici, le freeware image j est utilisé avec le plugin ratio plus. Commencez l’analyse en ouvrant les images dans l’image J.Si les images sont dans un format de pile multicolore, séparez les canaux individuels en les convertissant en une hyperpile en sélectionnant image.

Puis hyper stack, puis stack à hyper stack. La fenêtre de conversion en hyper pile s’ouvre avec les paramètres affichés, cliquez sur OK. L’image s’affichera désormais avec deux barres de défilement en dessous.

Ensuite, pour diviser les images en piles à un seul canal, cliquez sur l’image et sélectionnez hyper pile réduire la dimensionnalité. Cela ouvrira la fenêtre de réduction, assurez-vous que les images et conserver la source sont sélectionnées. Cliquez ensuite sur OK.

Une nouvelle image contenant un seul canal apparaîtra. Répétez ce processus pour faire apparaître une nouvelle image avec le deuxième canal. Ensuite, pour augmenter la clarté visuelle des images finales, sélectionnez la pile d’émission YFP excitation YFP.

Cliquez sur processus, puis sur mathématiques. Lorsque la fenêtre de multiplication s’ouvre, entrez trois pour multiplier par trois la pile d’émission YFP d’excitation YFP. Cette étape est facultative et permet de s’assurer que les rapports ne sont pas compris entre zéro et un.

Ensuite, dans la barre d’outils de l’image J, sélectionnez l’outil à main levée. Ensuite, dans la pile d’excitation YFP, d’émission YFP, dessinez une région d’intérêt ou ROI dans une zone qui est dépourvue de cellules, mais qui est proche d’une cellule qui sera mesurée pour ajouter le ROI au gestionnaire de ROI, cliquez sur outils d’analyse. Puis responsable ROI.

La fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement apparaîtra. Cliquez sur ajouter pour enregistrer les coordonnées de retour sur investissement afin de mesurer l’intensité moyenne du retour sur investissement dans la pile d’émission YFP d’excitation YFP. Cliquez sur analyser, puis sélectionnez mesurer.

La fenêtre des résultats s’ouvre. Sélectionnez la pile d’émission YFP d’excitation CFP. Ensuite, double-cliquez sur le ROI dans le gestionnaire de ROI et répétez la mesure.

La mesure est ajoutée à la fenêtre des résultats. Faites défiler jusqu’à d’autres emplacements de la pile pour répéter ce processus à plusieurs points de temps. Vérifiez que les intensités de fond proches de la cellule d’intérêt sont similaires dans l’ensemble du film en comparant les mesures dans la fenêtre des résultats.

Pour définir les mesures afin d’inclure l’intensité minimale, cliquez sur analyser, puis cliquez sur définir les mesures et indiquez la valeur de gris minimale et maximale. Une fenêtre affichant les alternatives de mesure s’affiche ensuite. Après avoir ajusté la luminosité et le contraste si nécessaire, dessinez un retour d’intérêt couvrant la majeure partie d’une cellule et mesurez l’intensité minimale dans les deux piles.

Ensuite, prenez les mesures comme auparavant, cette fois en utilisant une cellule au lieu de l’arrière-plan. À l’aide des valeurs des sections de résultats, calculez la différence entre l’intensité minimale mesurée et l’intensité de fond et divisez-la par deux. Il s’agit d’une estimation de départ pour un rapport entre la valeur de découpage et l’ouverture et certains plugins.

Puis rapport plus. Ensuite, pour le rapport de frette, sélectionnez l’excitation CFP YFP émission S pile un ou pour le rapport de frette inversé visualisant les sondes où l’efficacité de frette diminue lors de la phosphorylation. Sélectionnez l’excitation YFP YFP emission S stack one pour insérer les intensités de fond mesurées et les valeurs d’écrêtage.

Utilisez les valeurs de la fenêtre de résultats et collez-les dans la fenêtre ratio plus. Définissez la mise à l’échelle de la pile de ratios résultante et appliquez une table de correspondance appropriée pour visualiser les modifications de ratio. Des cellules U2 OS exprimant une sonde basée sur des frettes surveillant l’activité PLK one ont été filmées pendant 60 heures comme décrit dans cette vidéo.

Cette image montre l’entrée mitotique cumulative de cellules exprimant une sonde à 50 frettes, y compris les divisions de cellules filles. La majorité des cellules exprimant la sonde prolifèrent avec une durée de cycle cellulaire comprise entre 20 et 25 heures, ce qui indique que les conditions d’imagerie et les niveaux d’expression de la sonde n’affectent pas la synchronisation du cycle cellulaire. Une représentation en fausses couleurs du rapport de frette inversé suivant une cellule à travers quatre divisions démontre que, bien qu’il y ait un bruit considérable, on observe une tendance dans laquelle l’activité de PK un augmente en G deux et atteint un pic pendant la mitose.

Lorsque les données brutes sont filtrées par la moyenne et présentées sous forme de graphique, le temps entre les pics d’activité est facile à estimer. Cette figure montre la quantification du rapport de frette inversé de la cellule montrée dans les images précédentes du graphique. Le moment de l’activation peut être estimé et, comme on peut le voir ici, la phosphorylation de la sonde devient visible environ quatre heures avant que la phosphorylation ne culmine en mitose.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de maintenir les cellules dans un état de non-stress, afin de minimiser l’exposition à la lumière ainsi que de minimiser les changements de température ou de pH. Il est également important de se rappeler que cette méthode surveille l’équilibre entre l’activité de la kinase et de la phosphatase dans une cellule. Cette procédure peut être combinée à des criblages d’interférences ou d’inhibiteurs d’ARN pour identifier les régulateurs en amont de ces kinases et phosphotases.