Basées sur la fluorescence de mesure de l'entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Cette méthode expérimentale permet de révéler les propriétés de l'entrée calcique contrôlée par le stockage, ou SOCE, dans les cellules cancéreuses et musculaires squelettiques, en utilisant des méthodes basées sur la fluorescence. Cela est réalisé en enregistrant la fluorescence de l'URA deux dans des cellules vivantes, laquelle est sensible à la concentration intracellulaire en calcium. En outre, la vitesse d'extinction de la fluorescence par ajout de manganèse à une longueur d'onde insensible à la concentration en calcium est mesurée, ce qui reflète directement l'activation de la SOCE afin d'étudier cette dernière.

Dans des cellules musculaires squelettiques structuralement spécialisées, les muscles sont disséqués et écorchés. Des fibres musculaires sont préparées. Les fibres sont ensuite traitées avec des indicateurs calciques de faible affinité et leur fluorescence interne est surveillée.

Ces méthodes démontrent que l'entrée de calcium dépendante du stockage (SOCE) existe à la fois dans les cellules non excitables et dans les muscles squelettiques, avec une activation graduée et un couplage étroit au contenu des réserves intracellulaires en calcium. Le principal avantage de cette technique basée sur la fluorescéine par rapport à d'autres méthodes telles que l'électrophysiologie ou le patch-clamp réside dans sa facilité d'utilisation et sa possibilité d'application à l'étude de populations cellulaires ou à des criblages à haut débit. Il est important d'utiliser le bon esthéticien S pour l'environnement métrique rituel et le dosage mag coning.

Ainsi, l'étalonnage de chaque instrument est crucial car chaque appareil est différent. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la technique mécanique de dissociation de fibres musculaires uniques est difficile à maîtriser : elle exige une formation pratique approfondie, une compréhension fine des techniques de microdissection, une observation attentive et beaucoup de patience. Avant de commencer, étalonnez le dispositif microscopique pour la mesure de la fluorescence de l'URA deux. Bien que les longueurs d'onde d'excitation pour la fixation du calcium et l'URA deux calcium soient respectivement 340 et 380 nanomètres, la plage dynamique optimale du rapport de l'URA deux pour la mesure du calcium peut se produire à d'autres longueurs d'onde selon le système microscopique utilisé.

Ces décalages de longueurs d'onde sont dus à des modifications du trajet optique provoquées par l'ajout de divers composants optiques. De même, le point spastique ISO varie également pour chaque système. Il est donc important de déterminer ces longueurs d'onde par balayage spectral.

Alternativement, le criblage Ming peut être enregistré par une simple fluorescence à deux longueurs d'onde quelconques de manière à ce que la valeur finale soit indépendante de la concentration en calcium. Commencez par transfecter des cellules K Ys SE cultivées, une fois 50 cellules, avec des plasmides exprimant la RFP et contenant soit un ARNh spécifique contre ou I un ou une séquence aléatoire pendant 48 heures. Faites croître les cellules transfectées dans des boîtes à fond en verre.

Ensuite, retirez le milieu et rincez les cellules avec une solution saline équilibrée ou du BSS. Après le rinçage, ajoutez un millilitre de BSS contenant deux micromoles de RA 2:00 AM et maintenez la boîte à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Placez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes pour permettre la conversion de la forme intracellulaire d'URA 2:00 AM en URA deux.

Ensuite, laver la plaque deux fois avec du BSS sous microscope. En mode visualisation, sélectionner les cellules exprimant la RFP. Choisir le mode rapport d'excitation avec une longueur d'onde d'émission réglée à 510 nanomètres et des longueurs d'onde d'excitation à 350 et 390 nanomètres.

Le rapport est affiché dans la troisième fenêtre. Ensuite, enregistrez la fluorescence des cellules sélectionnées aux longueurs d'onde prédéterminées pendant que les cellules sont perfusées avec quatre solutions différentes.

De même, les cellules KYSE 150 sont chargées avec du ferra 2 et soumises à un enregistrement. En mode de rapport d'excitation, contrairement à la procédure précédente, le point isobestique à 360 nanomètres est choisi comme longueur d'onde d'excitation. Ensuite, enregistrez simultanément la fluorescence à 360 et 390 nanomètres pendant que les cellules sont perfusées avec cinq solutions BSS différentes.

Pour ce protocole, les cellules C2C12, une lignée cellulaire myogénique murine, doivent être cultivées sur des boîtes à fond en verre jusqu'à confluence, puis différenciées en myotubes dans un milieu de différenciation contenant 2,5 % de sérum de cheval. Charger les myotubes C2C12 avec une concentration finale de cinq micromoles de RA 2:00 AM en solution BSS et les incuber pendant 40 minutes. Ajouter ensuite une concentration finale de 20 micromoles de benzo p-toluène smide ou BTS afin d'inhiber les contractions musculaires et les artefacts de mouvement qu'elles provoquent.

Incuber les cellules pendant 15 minutes à température ambiante et maintenir le BTS dans toutes les solutions. Ensuite, charger quatre. Équilibrer les solutions salines dans le système de perfusion.

Comme décrit précédemment. Pendant chaque perfusion, enregistrez la fluorescence de cellules sélectionnées à 360 et 390 nanomètres. Dans cette série, le magnésium et la thapsigargine sont appliqués ensemble afin de surveiller l'atténuation des ions magnésium.

Tandis que les réserves de calcium du réticulum endoplasmique s'épuisent. Pour disséquer le muscle extenseur long des orteils ou muscle EDL, placer la patte d'une souris euthanasiée en position latérale et retirer la peau de la région de la cheville jusqu'au genou. Couper les couches musculaires superficielles du tissu afin d'exposer le muscle EDL, puis sectionner les tendons supérieur et inférieur pour libérer le muscle EDL intact.

Il est important de conserver les tendons aussi longs que possible. Pour empêcher toute contraction, transférez le muscle EDL dans une solution T road contenant 0,1 millimolaire d'EGTA et aucun calcium, sous un microscope stéréo. Forcez les tendons d'insertion au niveau du genou en deux moitiés et divisez le muscle EDL en deux faisceaux.

Répétez le processus jusqu'à l'obtention de huit faisceaux. Si des tendons sont perdus dans un faisceau, jetez ce faisceau. Ensuite, saisissez les deux tendons d'une bande de faisceau EDL et étirez soigneusement la bande jusqu'à ce que trois ou quatre fibres musculaires individuelles restent intactes, avec du tissu tendineux des deux côtés.

Déposez une goutte de tampon de Tyro sans calcium dans une boîte en verre à fond plat. Disposez les bandes de muscle DEL à plat dans la boîte et retirez rapidement autant de solution que possible. Ensuite, fixez solidement les deux tendons à l’aide de ruban adhésif imperméable.

Lavez d'abord la fibre avec la solution sans calcium, puis deux fois avec une solution de calcium à 2,5 millimolaire. Si un hyper-contraction de la fibre ou des dommages sont observés, jetez la fibre ; lavez les fibres musculaires saines sélectionnées trois fois avec la solution de lavage numéro un, puis immergez-les dans une solution de décapage similaire à l'intracellulaire modifiée pendant cinq minutes. À l’aide d’une aiguille en tungstène fixée à un porte-épingle, décapez mécaniquement la fibre sous un microscope stéréo ; les fibres se refermeront et piégeront la road five n conjuguée au calcium dans les tubules transverses.

Obtenir des fibres musculaires saines, intactes, ou au moins des faisceaux de ce type de fibres encore munis d'une partie de tendon, est, à mon avis, l'une des étapes les plus difficiles, suivie par le transfert toujours très délicat de ces fibres vers la chambre expérimentale finale. Au cours de ce processus, les fibres peuvent subir une hyper-contraction ou même se rompre. Ainsi, si vous disposez de fibres saines, la mise en place mécanique du derme sera nettement plus facile. Incubez les fibres dans une solution désagrégeante contenant 20 micromolaire de flow five N am.

Suivez l'incubation par des lavages abondants avec la solution de lavage numéro deux et une incubation supplémentaire de 30 minutes afin de permettre une désesterification complète du colorant. Les fibres peuvent ensuite être visualisées à l'aide d'un microscope confocal équipé d'un objectif 60 x, à partir de régions d'intérêt. Enregistrez simultanément la fluorescence de chaque colorant pendant que la fibre est perfusée avec des solutions de chargement et de déplétion du réticulum sarcoplasmique.

L'activité de la SOCE dans les cellules KYS, SE un 50 a été examinée à l'aide d'une mesure du calcium intracellulaire. Les cellules ont été cotransfectées avec la RFP et un court ARN en épingle à cheveux ciblant le gène OR I un, qui code pour le canal A-S-O-C-E, par rapport aux témoins représentés par la trace noire. L'extinction de l'expression d'OR I un a entraîné une diminution de l'activité de la SOCE. La présence de la SOCE dans les cellules KYC un 50 a également été confirmée par le test d'extinction au manganèse. Après que la thapsigargine (TG) a complètement épuisé les réserves de calcium du réticulum endoplasmique, la perfusion de manganèse a provoqué une diminution significative de la fluorescence.

La pente plus prononcée de la perte du signal URA indique une SOCe plus active. Ainsi, la diminution lente de la fluorescence dans les cellules traitées par le composé A PB indique que l'activité de la SOCe a été bloquée par ce composé. Les taux de disparition par manganèse ont été déterminés à partir des 10 premières secondes, durant lesquelles la disparition était encore dans la gamme linéaire sans saturation ; un dosage similaire de disparition par manganèse a été réalisé sur des cellules musculaires en culture.

Dans ce cas, le manganèse a été appliqué conjointement avec le TG. Alors que le TG épuisait les réserves de calcium du réticulum sarcoplasmique, la pente de l'extinction fluorescente a progressivement changé jusqu'à atteindre sa vitesse maximale. La courbe sigmoïde indiquait l'activation progressive du SOCE dans ces conditions expérimentales.

Lors de l'imagerie confocale, le piégeage par la fibre désintégrée du road five et du die dans le compartiment TT a révélé le motif double caractéristique des mammifères, tel qu'observé dans le canal rouge. Après le chargement du réticulum sarcoplasmique avec du flow five NM, le motif typiquement ponctué du réticulum sarcoplasmique était visible dans le canal vert suite à la perfusion de la fibre désintégrée avec la solution de chargement TTSR ; l'intensité de fluorescence des composés road five N et flow five n a augmenté après perfusion avec la solution de vidange du réticulum sarcoplasmique. Les niveaux de fluorescence dans le compartiment du réticulum sarcoplasmique et dans le compartiment TT ont commencé à diminuer. Ceci indiquait qu'il existait un couplage entre la déplétion des réserves calciques du réticulum sarcoplasmique et l'activation respectivement de la SOCE.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière d'obtenir des fibres musculaires viables, saines et intactes. Elles doivent posséder suffisamment de tendon à leurs extrémités pour permettre un processus de peau efficace, ce qui permettra finalement à l'expérimentateur d'obtenir une préparation physiologiquement pertinente offrant un avantage considérable. N'oubliez pas que tous les colorants fluorescents utilisés dans cette étude sont généralement sensibles à la lumière, et que des précautions, telles que le chargement dans une boîte sombre et les lavages en chambre noire, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures. Nous recommandons d'obtenir d'abord plusieurs fibres intactes afin d'obtenir un pourcentage de réussite plus élevé lors des étapes mécaniques délicates, et également si vous souhaitez cultiver ces fibres pendant la nuit après leur préparation. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs spécialisés dans le domaine de la signalisation calcique pour explorer le rôle de l'entrée calcique activée par la déplétion des stocks dans la croissance et la mort des cellules cancéreuses.

La fonction physiologique et pathologique dans le muscle.