Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Bonjour, je suis Jersey. Salut, je m'appelle Shabi et nous sommes tous deux chercheurs postdoctoraux au Collège impérial de Londres, travaillant avec le professeur Andrew Di Melo et le Dr Josh Del sur des plateformes microfluidiques à gouttes. Les plateformes microfluidiques basées sur des gouttes constituent des candidats prometteurs pour des expérimentations à débit plus élevé, car elles peuvent être générées à des volumes très précisément définis, et leur fréquence de génération peut atteindre plusieurs kilohertz par seconde.

En outre, puisque la région d'intérêt peut être encapsulée dans des compartiments allant jusqu'à quelques litres, les interférences croisées et la dispersion peuvent être éliminées, et les processus analytiques peuvent être chronométrés avec une plus grande précision. Dans notre équipe, nous avons déjà mis en œuvre avec succès des plateformes de microgouttelettes pour de nombreuses applications. Par exemple, la réaction en chaîne par polymérase, la synthèse de nanoparticules et le dosage cellulaire de molécules uniques.

Les grandes quantités d'informations générées au sein de ces systèmes doivent être efficacement extraites, exploitées et utilisées. À cet égard, la méthode de détection choisie doit être appropriée, offrir une haute sensibilité et des limites de détection faibles, être applicable à une gamme d'espèces moléculaires, être non destructive et pouvoir être intégrée facilement avec des dispositifs microfluidiques. Pour répondre à ce besoin, nous avons mis au point une série d'outils expérimentaux et de protocoles permettant l'extraction de grandes quantités d'informations physiques à partir d'environnements de faible volume, et qui s'appliquent à l'analyse d'un large éventail de paramètres physiques, chimiques et biologiques.

Dans ce protocole, nous présenterons deux méthodes appliquées à la détection de cellules uniques et à la cartographie des processus de mélange dans Dropbox. Les puces microfluidiques sont traditionnellement fabriquées en polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide de méthodes de photolithographie. Ce processus doit être réalisé dans un local propre afin d’obtenir des canaux microfluidiques Spinco, SU 8 50 sur une plaquette de silicium ; pré-cuire à 65 °C et 95 °C sur une plaque chauffante pour évaporer le solvant et densifier le film, puis, après refroidissement, exposer la résine SU 8 au rayonnement UV à l’aide du masque approprié, et cuire à nouveau la plaquette à 65 °C et 95 °C après refroidissement.

Développer les zones non exposées à l'aide de la solution de développement appropriée en agitant. Rincer la plaquette avec du solvant EC frais, puis la sécher sous flux de gaz afin d'obtenir une surface propre. Traiter la plaquette avec des lavages à l'hexane et au méthanol.

Également, pour terminer le processus de fabrication du moule maître, évaporer un agent d’adhérence sur la surface dans un dessiccateur pendant 40 minutes. Pour former des substrats microfluidiques structurés, mélanger S guard 1 8 4 selon un rapport de 10 à 1 entre la résine et l’agent de réticulation, puis appliquer ce mélange sur le moule maître. Dégazer ce mélange dans un dessiccateur et durcir le dispositif à 65 degrés.

Découpez le PDMS polymérisé et détachez-le du moule. Créez des orifices d'accès pour les tubulures fluidiques à l'aide d'un poinçon biopsique. Polymérisez une autre couche de PDMS pendant 20 minutes à 65 degrés.

Placer la couche supérieure préparée sur la couche inférieure et polymériser toute la nuit à 65 degrés. Détacher les puces de la boîte de Pétri et les couper en dés. Une fois les puces fabriquées, elles sont prêtes à être utilisées en y infusant les solutions d'intérêt.

Remplissez les seringues avec les solutions requises, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air ne subsiste dans les parties du tube. Pour la génération de gouttelettes, deux phases sont utilisées. La phase dispersée aqueuse contient les réactifs d'intérêt.

La phase huileuse agit comme la phase continue. Adaptez un tube ayant le même diamètre interne que les embouts des aiguilles de seringue à une extrémité, puis fixez les seringues sur une pompe à seringue et définissez le débit d'infusion souhaité. Pour chaque phase, un rapport minimal de débits huileux à aqueux égal à un est recommandé afin d'éviter le mouillage du PDMS par la phase aqueuse, ce qui entraînerait une formation instable de gouttelettes. Connectez les autres extrémités des tubes directement aux trous percés dans le substrat en PDMS.

Pour des solutions plus complexes, il est également possible d'utiliser de la silice, des orifices capillaires ou des connecteurs. Reliez le port de sortie de la puce au tube et dirigez-le vers un collecteur afin de recueillir les déchets ou de procéder à des analyses supplémentaires. Une fois ce dispositif mis en place, deux configurations principales de microcanaux permettent de générer des gouttelettes : le système de focalisation d'écoulement ou la géométrie en T, résultant des forces de cisaillement induites par l'association de ces géométries pour rapprocher les deux fluides admis, ainsi que des instabilités capillaires subséquentes qui se développent à l'interface.

Des gouttelettes d'un volume d'un seul oh, pouvant atteindre quelques femtolitres, sont générées spontanément. Une fois les gouttelettes produites, elles peuvent être analysées à l’aide d’un dispositif optique. Le système optique est configuré selon le protocole suivant.

Utilisez un microscope confocal doté d'une capacité de positionnement automatisé au sous-micron et d'un laser fonctionnant à une longueur d'onde correspondant à l'absorption des fluorochromes utilisés. Pour les exciter, employez un laser pulsé fonctionnant à des fréquences de répétition de plusieurs mégahertz pour l'imagerie de durée de vie de fluorescence. Les expériences de type « phlegm » utilisent des miroirs de guidage et des optiques pour contrôler la hauteur ainsi que la direction du faisceau.

Utilisez un miroir dichroïque pour réfléchir le faisceau laser vers l'objectif. Si deux lasers sont utilisés simultanément, un miroir dichroïque à double bande peut être installé. Pour permettre la réflexion des deux faisceaux laser, utilisez un objectif de microscope à correction d'infini et à ouverture numérique élevée (NA) afin de focaliser précisément la lumière laser dans un canal microfluidique.

Recueillir la fluorescence émise par l'échantillon à l'intérieur du canal microfluidique, en utilisant le même objectif à haute ouverture numérique et transmise à travers le même miroir dichroïque. Éliminer toute lumière d'excitation résiduelle à l'aide d'un filtre d'émission simple ou double bande. Focaliser l'émission de fluorescence sur un diaphragme de 75 micromètres.

À l'aide d'une lentille plan-convexe. Placer le diaphragme d'ouverture dans le plan confocal de l'objectif du microscope. Utiliser un autre miroir dichroïque pour séparer le signal fluorescent vers deux détecteurs.

Filtrez la fluorescence réfléchie par le miroir dichroïque à l’aide d’un filtre d’émission et focalisez-la avec une lentille plan-convexe sur le premier détecteur. Pour les expériences impliquant un fluorophore rouge secondaire, filtrez la fluorescence transmise par le miroir dichroïque à l’aide d’un autre filtre d’émission, puis focalisez-la avec une autre lentille plan-convexe sur le second détecteur. Utilisez des photodiodes à avalanche pour la détection des photons de fluorescence.

Pour l'acquisition des données de fluorescence, couplez le signal électronique provenant du détecteur à avalanche à une carte d'acquisition multifonction (DAQ) pour l'enregistrement des données, fonctionnant sur un ordinateur personnel. Pour les expériences sur les crachats, utilisez un laser à impulsions et connectez les détecteurs à une carte PC de comptage de photons uniques corrélés en temps (TCS), fonctionnant sur un ordinateur distinct. Cette carte permet d'obtenir les données de durée de vie fluorescente.

En utilisant une méthodologie TCS PC. Chaque photon fluorescent détecté est corrélé à une impulsion laser incidente et, par conséquent, chaque photon fluorescent émis se voit attribuer un temps de retard. Ces données peuvent être ajustées à une courbe de décroissance exponentielle simple ou multiple afin d'obtenir une estimation du taux radiatif des fluorophores.

Nous savons désormais que les cellules sont fortement hétérogènes d’un point de vue biologique, physique et chimique. Par conséquent, idéalement, nous devrions analyser chaque cellule individuellement. Toutefois, les tests doivent être réalisés avec un débit plus élevé afin de pouvoir recueillir suffisamment d'informations quantitatives pour parvenir à une conclusion fiable et significative.

Voici un exemple d'encapsulation de cellules d'E. coli dans une goutte unique, tel qu'il peut être réalisé. Utilisez la souche E. coli Top 10 cultivée pendant la nuit. Afin de détecter la viabilité des cellules, utilisez le cyto neuf et l'iodure de propidium.

Les deux colorants sont des colorants intercalants de l'ADN dont l'intensité de fluorescence augmente de plus de 20 fois. Une fois liés à l'ADN, la cytoïne est un colorant fluorescent vert perméable à la membrane, et l'iodure de propidium est un colorant fluorescent rouge imperméable à la membrane.

Ainsi, les cellules vivantes présentent une fluorescence verte, tandis que les cellules mortes émettent à la fois une lumière verte et rouge. Ici, nous pouvons observer la génération de gouttelettes et l'encapsulation d'une cellule unique au niveau d'une jonction en T. Cette vidéo a été enregistrée à l'aide d'une caméra haute vitesse, mais les gouttelettes peuvent être produites à un débit de plusieurs milliers par seconde.

Lors de l'encapsulation des cellules, il est essentiel de s'assurer que la culture cellulaire est diluée de sorte qu'il y ait moins de cellules que de gouttelettes générées, et que les cellules soient empêchées de sédimenter, ce qui peut se produire dans la seringue ou les tubulures. Utilisez un barreau aimanté à l'intérieur de la seringue afin de maintenir une distribution homogène des cellules dans la solution. Employez des tubulures très fines, de 50 micromètres, pour relier la seringue à la micropuce.

Cela garantit un débit élevé à l'intérieur du tube et empêche ainsi les cellules de sédimenter. Voici des exemples typiques de comptages de photons en fonction du temps pour les expériences basées sur les cellules. Pour cartographier les processus de mélange au sein des gouttelettes.

Des gouttelettes peuvent être générées à l'aide de deux fluides fluorés différents ayant des durées de vie distinctes. À l'intérieur d'une gouttelette en écoulement, un champ d'écoulement est créé, ce qui finit par mélanger les deux solutions initialement séparées afin d'améliorer le processus de mélange. La symétrie du champ d'écoulement peut être modifiée en utilisant des canaux sinueux.

Afin d'analyser les gouttelettes, focalisez le volume de détection optique à mi-hauteur d'un microcanal le long duquel circulent des gouttelettes, en partant d'un côté du canal, puis réalisez chaque expérience sur toute la largeur du canal, à des intervalles d'un micromètre. Mettez en œuvre un algorithme permettant de distinguer les impulsions uniques associées aux gouttelettes du bruit de fond de la phase huileuse, et d'établir la durée de chaque impulsion.

Mettre en œuvre un deuxième algorithme afin d'extraire les valeurs de temps de retard et d'intensité le long de la longueur de chaque gouttelette à la largeur spécifique à laquelle l'expérience a été réalisée. Ensuite, utiliser un algorithme d'estimateur du maximum de vraisemblance (MLE) pour évaluer la durée de vie de fluorescence de chaque gouttelette dans l'expérience. La moyenne des valeurs de durée de vie pour l'ensemble des gouttelettes de l'expérience réduit l'erreur finale du calcul MLE.

Plus on analyse de gouttelettes, plus l'erreur est faible une fois la trajectoire de durée de vie obtenue. Pour chaque largeur, combiner toutes les trajectoires en une carte 2D. Puisque chaque valeur de durée de vie est associée à un mélange particulier des deux espèces de flore, une carte de concentration ou de mélange peut ainsi être obtenue.

Nous avons décrit la fabrication d'un dispositif microscopique, le montage expérimental et les protocoles associés pour la formation de microgouttelettes, l'encapsulation de régions et la détection optique du processus et des gouttelettes. Les deux exemples choisis — la détection de cellules uniques dans des gouttelettes et la cartographie des processus de mélange à l'intérieur des gouttelettes en écoulement — représentent des applications courantes actuellement étudiées en microfluidique à gouttelettes.

Comme le montrent les expériences présentées, l'utilisation de plates-formes de microfluidique à gouttes présente certaines caractéristiques intéressantes telles qu'un débit élevé dû au confinement parfait et une reproductibilité accrue. La grande quantité d'informations produite et la vitesse maximale à laquelle ces données sont générées exigent l'utilisation de méthodes de détection rapides offrant une résolution spatiale et temporelle optimale afin de tirer pleinement parti de ces plates-formes miniaturisées.

Dans ce cas, nous démontrons que cela est possible en utilisant des techniques spectroscopiques fluorées hautement précises.