Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Bonjour, je suis Jersey. Bonjour, je m’appelle Shabi et nous sommes tous les deux chercheurs postdoctoraux à l’Imperial College de Londres, travaillant avec le professeur Andrew Di Melo et le Dr Josh Del sur les plateformes de gouttelettes microfluidiques. Les plates-formes microfluidiques à base de gouttelettes promettent des candidats prometteurs pour l’expérimentation à haut débit car elles peuvent être générées à des volumes très élevés définis avec précision et leurs concurrents, la fréquence de génération peut être aussi élevée que plusieurs kilos pers.

De plus, comme la région d’intérêt peut être encapsulée dans des compartiments aussi tard que quelques litres, la diaphonie et la dispersion peuvent être éliminées, et les processus analytiques peuvent être chronométrés avec une plus grande précision. Dans notre groupe, nous avons déjà mis en œuvre avec succès des plates-formes de micro-gouttelettes dans de nombreuses applications. Par exemple, la réaction en chaîne par polymérase, la synthèse de nanoparticules et le test de cellule moléculaire unique.

Les grandes quantités d’informations générées au sein de ces systèmes doivent être extraites, exploitées et utilisées efficacement. À cet égard, la méthode de détection choisie doit être la bonne, offrir une sensibilité élevée et des limites de détection basses, être applicable à une gamme d’espèces moléculaires, être non destructive et pouvoir être intégrée facilement à des dispositifs microfluidiques. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une série d’outils et de protocoles expérimentaux qui permettent d’extraire de grandes quantités d’informations physiques à partir d’environnements de petit volume, et qui sont applicables à l’analyse d’un large éventail de contextes physiques, chimiques et biologiques.

Dans ce protocole, nous présenterons des méthodes appliquées à la détection de cellules uniques et à la cartographie des processus de mélange dans Dropbox. Les puces microfluidiques sont traditionnellement fabriquées en poly diméthyl Sloane PGMS à l’aide de méthodes de photolithographie. Ce processus doit être effectué dans une installation en salle blanche pour obtenir des canaux microfluidiques Spinco, SU huit 50 sur une plaquette de silicium cuite doucement sur une plaque chauffante à 65 degrés et 95 degrés pour évaporer le solvant et densifier le film après refroidissement, exposer le SU huit, résister aux rayons UV sous le masque approprié, puis cuire la gaufrette à 65 degrés et 95 degrés après refroidissement.

Développez les zones non exposées en utilisant la solution de développement appropriée tout en remuant. Utilisez un solvant EC frais pour rincer la plaquette, puis séchez-la sous gaz pour générer une surface propre. Traitez la plaquette avec des lavages à l’hexane et au méthanol.

De plus, pour terminer le processus de fabrication de l’étalon, évaporez un agent de grippage sur la surface dans un desséchable pendant 40 minutes. Pour former des substrats microfluidiques structurés, nous mélangeons S guard 1 8 4 dans un rapport de 10 pour un de réticulant à base de résine et le tirons sur le maître. Dégazez-le dans un desséchage et durcissez l’appareil à 65 degrés.

Coupez le PDMS durci et décollez-le du master. Créez des trous d’accès pour la tubulure fluidique à l’aide d’un poinçon de biopsie. Durcissez une autre couche de PDMS pendant 20 minutes à 65 degrés.

Placez la couche supérieure préparée sur la couche inférieure et durcissez pendant la nuit à 65 degrés. Épluchez les chips de la boîte de Pétri et coupez-les en dés. Une fois que les puces ont été fabriquées, elles sont prêtes à être utilisées en infusant les solutions d’intérêt.

Remplissez les seringues avec les solutions requises, en veillant à ce qu’il ne reste aucune bulle d’air dans aucune partie du tube. Pour la génération de gouttelettes, deux phases sont utilisées. La phase aqueuse dispersée contient les réactifs d’intérêt.

La phase huileuse agit comme la phase continue : ajuster la tubulure du même diamètre intérieur que les pointes de l’aiguille de la seringue à une extrémité des aiguilles, monter les seringues sur un pousse-seringue et définir le débit d’injection souhaité. Pour chaque phase, un rapport minimum de débits aqueux d’huile de un est recommandé afin d’éviter de mouiller le PDMS par la phase aqueuse, ce qui entraînerait la formation de gouttelettes instables. Connectez les autres extrémités du tube directement aux trous percés dans le substrat PDMS.

Pour des solutions plus complexes, de la silice, des ports capillaires ou des connecteurs peuvent également être mis en œuvre. Connectez l’orifice de sortie de la puce au tube et dirigez-le vers un collecteur pour la collecte des déchets ou le traitement d’analyse supplémentaire. Une fois cela mis en place, il existe deux configurations principales de microcanaux pour générer une focalisation d’écoulement de gouttelettes ou un format de jonction en T en raison des forces pures qui résultent de l’utilisation de ces géométries pour rapprocher les deux fluides admissibles et des entrées capillaires ultérieures qui se développent dans l’interface.

Des gouttelettes aussi petites que quelques femtolitres sont générées spontanément. Une fois que les gouttelettes sont générées, elles peuvent être sondées à l’aide d’une configuration optique. Le système optique est mis en place selon le protocole suivant.

Utilisez un microscope confocal avec une capacité de positionnement submicronique automatisé et un laser fonctionnant à une longueur d’onde qui correspond à l’absorption des chutes de fluor impliquées. Pour les exciter, utilisez un laser à impulsions fonctionnant à des taux de répétition de plusieurs mégahertz pour l’imagerie fluorescente à vie. Les expériences sur les mucosités utilisent des miroirs d’orientation du faisceau et des optiques pour contrôler la hauteur et la direction du faisceau.

Utilisez un miroir dichroïque pour réfléchir le faisceau laser dans la lentille de l’objectif. Si deux lasers sont utilisés simultanément, un miroir diique à double bande peut être installé. Pour permettre la réflexion des deux faisceaux laser, utilisez un objectif de microscope NA à haute ouverture numérique corrigé à l’infini pour amener la lumière laser à une focalisation étroite dans un canal microfluidique.

Collectez la fluorescence émise par l’échantillon dans le canal microfluidique, en utilisant le même objectif à grande ouverture numérique et transmise à travers le même miroir dichroïque. Retirez toute lumière d’excitation résiduelle à l’aide d’un filtre d’émission mono ou double bande. Focalisez l’émission de fluorescence sur un sténopé de 75 micromètres.

À l’aide d’une lentille plano convexe. Positionnez le sténopé dans le plan confocal de l’objectif du microscope. Utilisez un autre miroir dichroïque pour répartir le signal fluorescent sur deux détecteurs.

Filtrez la fluorescence réfléchie par le miroir dichroïque avec un filtre d’émission et focalisez-la avec une lentille convexe plaino sur le premier détecteur. Pour les expériences impliquant un fluor rouge secondaire, filtrez la fluorescence transmise par le miroir diique avec un autre filtre d’émission, puis focalisez-la avec une autre lentille convexe plano sur le deuxième détecteur. Utilisez des photodiodes à avalanche pour la détection des photons de fluorescence.

Pour l’acquisition de données de fluorescence, couplez le signal électronique du détecteur à photodiode d’avalanche à un dispositif DAQ multifonction pour l’enregistrement des données fonctionnant sur un ordinateur personnel. Pour les expériences sur les mucosités, utilisez un laser à impulsions et connectez les détecteurs à une carte PC TCS à comptage de photons uniques corrélée dans le temps fonctionnant sur un PC séparé. Cette carte permet d’obtenir les données de durée de vie des fluorescents.

Utilisation d’une méthodologie TCS PC. Chaque photon fluorescent détecté est corrélé à une impulsion laser incidente et, par conséquent, chaque photon fluorescent émis se voit attribuer un temps de retard. Ces données peuvent être ajustées à une ou plusieurs courbes de décroissance exponentielle pour obtenir une estimation du taux radiatif des fluorophores.

Nous savons maintenant que les cellules sont très hétérogènes d’un point de vue biologique, physique et chimique. Par conséquent, idéalement, nous devrions analyser chaque cellule à la fois. Cependant, les analyses doivent être effectuées avec un débit plus élevé afin que nous puissions recueillir suffisamment d’informations quantitatives pour arriver à une conclusion fiable et significative.

Nous avons ici un exemple d’encapsulation de cellules E coli dans une seule gouttelette, afin que le tel quel puisse être effectué. Utilisez la souche e coli top 10 qui a été cultivée pendant la nuit. Afin de détecter la viabilité des cellules, utilisez du cyto nine et de l’iodure de propidium.

Les deux colorants sont des colorants qui s’entremêlent dans l’ADN et leur intensité de fluorescence augmente de plus de 20 fois. Lors de la liaison à l’ADN, le cyto nine est un colorant fluorescent vert perméable à la membrane et à l’iodure de propidium. Il s’agit d’un colorant fluorescent rouge, qui est imperméable aux membranes.

Ainsi, les cellules vivantes émettent une fluorescence verte tandis que les cellules mortes présentent des émissions vertes et rouges. Ici, nous pouvons voir la génération de gouttelettes et l’encapsulation d’une seule cellule avec une jonction T. Cette vidéo a été enregistrée avec une caméra à grande vitesse, mais des gouttelettes peuvent être générées à une vitesse de milliers par seconde.

Lors de l’encapsulation de cellules, il faut s’assurer que la culture des cellules est diluée afin qu’il y ait moins de cellules que de gouttelettes générées, que les cellules ne se sédimentent pas, ce qui peut se produire dans la seringue ou le tube. Utilisez une barre d’agitation magnétique à l’intérieur de la seringue pour maintenir les cellules uniformément réparties dans la solution. Utilisez un tube très fin, 50 micromètres pour connecter la seringue à la micropuce.

Cela garantit un débit rapide à l’intérieur du tube et empêche ainsi les cellules de se sédimenter. Voici les exemples typiques de comptage de photos en fonction du temps pour les expériences basées sur des cellules. Pour cartographier les processus de mélange dans les gouttelettes.

Les gouttelettes peuvent être générées à l’aide de deux fluoro-quatre différents avec des durées de vie différentes. À l’intérieur d’une gouttelette qui s’écoule, un champ d’écoulement est généré, qui finit par mélanger les deux solutions initialement séparées pour améliorer le processus de mélange. La symétrie du champ d’écoulement peut être modifiée à l’aide de canaux d’enroulement.

Afin de sonder les gouttelettes, focalisez le volume de la sonde optique à la moitié de la hauteur d’un microcanal le long duquel s’écoulent les gouttelettes, en commençant d’un côté du canal, effectuez chaque expérience sur toute la largeur du canal. À des intervalles d’un micromètre. Mettre en œuvre un algorithme permettant de différencier les rafales uniques associées aux gouttelettes du bruit de fond de la phase huileuse, et d’établir la durée de chaque salve.

Mettre en œuvre un deuxième algorithme pour extraire les valeurs de temps de retard et d’intensité sur toute la longueur de chaque gouttelette à la largeur particulière où l’expérience a été réalisée. Utilisez ensuite un algorithme MLE d’estimation du maximum de vraisemblance pour évaluer la durée de vie de fluorescence de chaque gouttelette de l’expérience. La moyenne des valeurs de durée de vie de toutes les gouttelettes de l’expérience réduit l’erreur finale du calcul MLE.

Plus il y a de gouttelettes sondées, plus l’erreur est faible une fois qu’une trajectoire de vie a été obtenue. Pour chaque largeur, combinez toutes les trajectoires sur une carte 2D. Étant donné que chaque valeur à vie est associée à un mélange particulier des deux quatre flores, une carte de concentration ou de mélange peut ainsi être obtenue.

Nous avons décrit la fabrication d’un micro dispositif et d’un dispositif expérimental et les protocoles associés pour la formation de micro-gouttelettes et l’encapsulation de la région et la détection optique du processus, les gouttelettes. Les deux exemples retenus sont la détection de cellules uniques dans les gouttelettes et la cartographie des processus de mélange. À l’intérieur des gouttelettes qui s’écoulent représentent des applications courantes qui sont actuellement étudiées avec la microfluidique des gouttelettes.

Comme l’illustrent les expériences présentées, l’utilisation de gouttelettes, les plateformes microfluidiques présentent certaines caractéristiques attrayantes telles qu’un débit élevé, une cause de confinement parfaite et une reproductibilité plus élevée. La grande quantité d’information produite et la vitesse la plus élevée à laquelle cette information est générée. L’uranium appauvri nécessitait l’utilisation de méthodes de détection rapides avec la résolution spatio-temporelle la plus élevée si l’on voulait tirer pleinement parti de ces plates-formes miniaturisées.

Dans ce cas, nous démontrons que cela est possible en utilisant des techniques de spectroscopie fluorée de haute précision.