Spectrométrie de masse MALDI Imaging des neuropeptides dans la maladie de Parkinson

L'objectif principal de cette procédure est de clarifier la distribution spatiale des neuropeptides, en particulier des peptides opioïdes, directement dans des coupes cérébrales minces à l'aide de la spectrométrie de masse d'imagerie par moisissure. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant des sections tissulaires de 12 micromètres d'épaisseur à partir de cerveau de rat congelé rapidement, puis en les montant sur des lames de verre conductrices. La deuxième étape consiste à appliquer la matrice moisie Matrixx en réseaux sur les sections à l'aide d'une imprimante chimique jet d'encre, puis à acquérir un spectre de masse à partir de chaque point de matrice.

Ensuite, plusieurs pics peptidiques sont visualisés afin de s'assurer du bon déroulement global de l'expérience. Cela est suivi par l'inspection et le traitement de l'exportation des spectres de masse, le post-traitement des données peptidiques et une évaluation statistique. La dernière étape consiste à analyser et valider les données peptidiques obtenues par la spectrométrie de masse en imagerie sur des échantillons moisissus.

En fin de compte, les résultats montrent des différences significatives dans les niveaux relatifs des peptides opioïdes dans différentes régions du cerveau entre les divers groupes traités. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les approches basées sur des gels de radio-immunoadsorption, est que l'imagerie multiplexe permet de localiser les modifications induites par le traitement tout en conservant une haute spécificité moléculaire. Cela nous offre en retour la possibilité de détecter des troncatures auparavant non détectées des modifications post-traductionnelles.

Les personnes novices avec cette méthode éprouveront des difficultés au départ, car la technique exige une préparation approfondie des échantillons et un traitement rigoureux des données. L'accent sera mis ici sur la qualité du tissu, de la matrice, du protocole d'application, de l'évaluation des données et des expériences de validation suivantes. Il est essentiel de travailler rapidement et avec rigueur lors de la dissection du tissu afin d'éviter la dégradation protéolytique.

Après avoir sacrifié le rat selon les protocoles approuvés, retirez immédiatement le cerveau, transférez-le sur de la glace sèche en poudre et laissez-le geler relativement lentement, puis stockez le cerveau dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Les cerveaux entiers peuvent être conservés plusieurs années avant la sectionnement sans perte de qualité du signal de spectrométrie de masse. Lorsque vous êtes prêt à commencer la procédure, fixez le cerveau sur le porte-échantillon à l’aide du milieu d’inclusion Tissue Tech, en évitant toute contamination de la partie du cerveau à découper, car le milieu d’inclusion interfère avec l’ionisation et la désorption des peptides.

Découper le tissu congelé au microtome cryostat en tranches de 12 microns et monter les coupes tissulaires sur des lames en verre conductrices MALDI. La coloration des coupes tissulaires peut être effectuée à ce stade, et la qualité du tissu peut être inspectée. Cette figure montre une coloration au violet de crésyl de tissu cérébral rapidement congelé dans l'azote liquide, ce qui a provoqué des fissures et des déchirures du tissu.

Ce tissu ne conviendrait pas à une spectrométrie de masse d'imagerie à haute résolution car la matrice se diffusera et ne cristallisera pas uniformément. Séchez les coupes pendant 15 minutes sous vide et conservez les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Les sections de tissu doivent être analysées dans le plus bref délai possible après la découpe, même si elles sont conservées à moins 80 degrés Celsius. Tout d'abord, décongelez les sections dans un dessiccateur pendant une heure, puis rincez les lames avec les sections dans de l'éthanol à 70 % à température ambiante pendant 10 secondes, suivies de deux rinçages dans de l'éthanol à 95 % à température ambiante, chacun de 10 secondes. Après le rinçage, séchez les lames dans un dessiccateur pendant 10 minutes.

Examinez les sections au microscope afin de vous assurer que les échantillons de tissu sont de bonne qualité, sans distorsion du tissu, déchirures microscopiques ou petites fissures pouvant nuire à la qualité de l'EMS du moule. Ensuite, préparez une solution matricielle fraîche composée de 50 milligrammes par millilitre de DHB et de 50 % méthanol, 10 % 150 millimolaire d'acétate d'ammonium, et 0,3 % d'acide trifluoroacétique dans l'eau. Numérisez le porte-lame contenant l'échantillon de tissu et alignez le support sur les points de référence respectifs à l'aide de la fonction d'analyse d'image du logiciel de puce.

Ensuite, sélectionnez les paramètres appropriés d'application de la matrice pour la région cérébrale et les analytes ciblés. Puis, précisez la résolution spatiale. Appliquez maintenant la matrice en utilisant le protocole optimisé sur l'imprimante chimique Jett.

Numériser les sections finalisées avec les dépôts de matrice et enregistrer l'image avant la demande de données multiples. Cette image sera utilisée ultérieurement pour croiser les dépôts de matrice avec les coordonnées moteur de la platine MALDI. Si elles ne sont pas utilisées immédiatement, les sections avec dépôts de matrice peuvent être conservées dans un dessiccateur sous vide jusqu'à leur utilisation.

Pour la plupart des expériences, plusieurs sections seront analysées simultanément, comme illustré ici. Chaque support de lame accueille deux lames en verre, et par conséquent, plusieurs paires doivent être analysées pour tous les supports. Les méthodes et paramètres d'acquisition en spectrométrie de masse par temps de vol (TOF) doivent être identiques ; toutefois, les étalonnages de masse des peptides doivent être vérifiés pour chaque lame.

Ensuite, optimisez les paramètres d'acquisition sur l'échantillon de tissu, notamment la mise au point du laser et l'intensité du laser. Puis, saisissez le nombre de tirs nécessaire pour obtenir un signal MS optimal sans élever la ligne de base, ce qui réduirait la résolution des pics. Évitez de saturer le détecteur ou d'ablationner la matrice à partir de dépôts de matrice voisins, et sélectionnez le déplacement du laser.

Estimez le nombre maximal de tirs pouvant être effectués par point de matrice jusqu'à ce que seul le bruit soit détecté ici. Accumulez 600 tirs à partir de chaque dépôt de matrice en pas de 25 tirs, soit un total de 24 pas, en utilisant un motif aléatoire de déplacements. Corrélez les balayages de toutes les sections imprimées avec les coordonnées moteur de la platine MALDI à l'aide du logiciel flex imaging.

Ensuite, à l'aide d'un logiciel de traitement par lots en exécution automatique, effectuez l'acquisition des données en mode par lots. Utilisez des outils de visualisation des données, tels que Flex Imaging, pour examiner visuellement les images IMS Maori afin d'évaluer les distributions de l'intensité des pics et déterminer si ces distributions sont liées à des caractéristiques tissulaires, à la qualité du dépôt ou à des effets de normalisation. Cet exemple montre la distribution de 10 pics peptidiques différents chez neuf animaux distincts.

Le courant total de fer, ou TIC, utilisé pour la normalisation, est affiché en blanc. Le TIC correspond à la somme de toutes les valeurs d'intensité dans un spectre de masse. La valeur de TIC est très faible chez l'animal trois, et les images des peptides montrent plus de bruit que d'informations spécifiques.

Le cerveau de l'animal numéro six présente une zone située au bas de la coupe, caractérisée par des valeurs TIC très élevées. Cela se traduit par des intensités anormalement fortes dans cette région des images de peptides, C et D. Il s'agit d'un effet potentiel de sur-normalisation pouvant influencer l'analyse des données. Les effets de sur-normalisation peuvent conduire à des résultats inexactos s'ils sont spécifiquement présents dans un seul groupe de traitement.

Dans cet exemple, la TIC est nettement plus élevée pour le groupe C, ce qui peut affecter anormalement les intensités des pics individuels. Par exemple, l'intensité moyenne du pic de la cytochrome C est plus élevée pour le groupe C que pour le groupe B dans les données brutes, mais après normalisation, l'intensité du pic est désormais inférieure. Pour le groupe C, cela peut conduire à des interprétations erronées sérieuses des résultats.

Il est important de toujours calculer la moyenne de l'ICM pour chaque groupe de traitement avant de procéder à une validation approfondie des données. Ensuite, pour définir la région d'intérêt, il est essentiel de comprendre que l'ARN messager de la pro-dorphine est traduit en un propeptide de pro-dorphine de 14 kilodaltons. Dans les neurones striés, la pro-dorphine est empaquetée dans des vésicules qui sont transportées à travers les dendrites vers d'autres neurones striés, ainsi que par les axones vers la substance noire, située à plusieurs millimètres du corps cellulaire.

Les vésicules contiennent des enzymes qui transforment davantage le propeptide en peptides di-norphine, tels que l'alpha néo-endorphine di-norphine A ou la di-norphine B. Chacun peut activer différents récepteurs opioïdes après libération vers la structure cible, la substance noire. Les di-norphines sont ensuite dégradées et éliminées par des endo- et exo-peptidases. Certains de ces peptides ne peuvent être détectés que par spectrométrie de masse, car les anticorps existants ciblent uniquement l'extrémité C-terminale des peptides et non l'extrémité N-terminale. La séquence Y-G-G-F-L, responsable de l'activation des récepteurs opioïdes, est produite par des cellules di-norphines situées dans la région AUM et projetant vers la substance noire.

Par conséquent, dans l'expérience suivante, l'AUM parasite et la substance noire ont tous deux été analysés par IMS moisie, les spectres provenant de chaque région d'intérêt. La strie dorsomédiale et dorsolatérale de l'AUM ainsi que la substance noire médiale et latérale ont été définies dans le logiciel d'analyse Flex et exportées pour l'analyse des données. Pour la réduction des données, effectuez la détection des pics à l'aide des outils de recherche de pics inclus dans différents logiciels.

Par exemple, utilisez l'analyse de pics dans Origin ou MS Peaks dans Matlab. Exportez la liste des pics à partir de tous les spectres sous la forme d'un seul fichier texte délimité par des tabulations, déterminez les limites initiale et finale des pics. À l'aide d'un logiciel tel que le programme gratuit P bin, calculez la surface sous la courbe comprise entre les limites des pics et utilisez ces valeurs pour l'analyse statistique. La reproductibilité MS entre les groupes de traitement peut être évaluée en calculant la trace MS moyenne et l'erreur type pour chaque valeur de masse.

Dans cet exemple, les spectres moyens du groupe témoin intact seront utilisés pour évaluer la variabilité sur toute la plage de masses analysée. Une bonne reproductibilité peut être observée puisque les intensités des pics sont égales dans les deux groupes témoins et que l'écart type est faible. Cela garantit une analyse statistique valide.

Si les jeux de données présentent un degré élevé de variation, il est presque toujours nécessaire de répéter l'expérience Maori IMS, en réduisant autant que possible les sources de variation expérimentales. Typiquement, nous traitons autant de sections et d'animaux que possible lors d'une seule session, incluant parfois plusieurs personnes travaillant par équipes successives. Toutefois, dans certains cas, cela ne suffit toujours pas et d'autres stratégies peuvent être mises en œuvre.

Par exemple, si certains spectres sont constitués de bruit, ceux-ci peuvent l'être en traçant la distribution de fréquence du TIC, et une valeur seuil de coupure peut être utilisée pour éliminer les données suboptimales. Une autre manière d'évaluer les données consiste à tracer tous les pics de deux animaux appartenant au même groupe l'un par rapport à l'autre. Si les intensités des pics sont égales chez les deux animaux, le tracé d'intensité affiche une ligne droite étroite.

Si un animal présente des données spectrales de faible qualité, le graphique affiche généralement des décalages asymétriques par rapport à la droite, comme observé à droite. Pour l'identification des séquences peptidiques, réalisez une analyse peptid Dominic sur des extraits de tissu cérébral de rat en utilisant une chromatographie liquide multidimensionnelle couplée à une spectrométrie de masse à haute résolution. Brièvement, les neuropeptides sont extraits de sections cérébrales de rat et préfractionnés par chromatographie échangeuse de cations forte.

Les différentes fractions sont ensuite séparées davantage à l’aide d’une HPLC en phase inverse à débit nanométrique. Ensuite, caractérisez les neuropeptides par spectrométrie de masse tandem à ionisation par électrospray en utilisant un instrument hybride combinant un piège à ions linéaire et un analyseur à résonance cyclotronique dans un anneau de stockage. Enfin, effectuez l’identification des séquences peptidiques par comparaison avec une base de données. Des anticorps spécifiques sont disponibles pour certains neuropeptides, et des expériences d’immunohistochimie peuvent valider à la fois l’identification des peptides et les résultats expérimentaux. La résolution est supérieure à celle de la spectrométrie de masse d’imagerie Maori, et des informations supplémentaires peuvent être obtenues.

Dans cet exemple, des fibres nerveuses immunoréactives à l'anticorps anti-Dior bee peuvent être observées dans l'hippocampe, panneau supérieur gauche, et dans la substance noire, panneau inférieur gauche, tandis que l'image IMS Maori en bas à droite révèle la localisation au niveau de différentes régions cérébrales. La preuve ultime qu'un pic de masse peut être attribué sans ambiguïté à un peptide spécifique consiste à réaliser une IMS moldy sur des animaux invalidés pour le peptide, comme la souris knockout pour le pronin. Plusieurs pics, indiqués par les flèches, sont absents chez les animaux knockout, mais présents chez les témoins de type sauvage.

Animaux Des pics de peptides non apparentés, tels que la substance P et le P ink, ne montrent aucune différence entre les animaux knock-out et les animaux contrôles. Les intensités des pics de la di-norphine B et de l'alpha néo-endorphine sont significativement augmentées dans la lésion par la six-hydroxydopamine. Le striatum de Parkinson chez les animaux hautement dyskinésiques, indiqué par les flèches, par rapport au groupe contrôle lésé et faiblement dyskinésique.

L'analyse statistique a également révélé une augmentation significative pour une masse peptidique correspondant à l'alpha néo-endorphine tronquée, chez laquelle la tyrosine en extrémité C-terminale a été éliminée. En effet, l'inspection visuelle des résultats d'imagerie montre une forte colocalisation des peptides parentaux di-norphine, représentés en vert, et de leurs métabolites tyrosine DES associés, représentés en rouge ; le jaune indique un chevauchement régional dans le panneau de superposition situé à droite. Le grand potentiel de cette technique est mis en évidence par les découvertes relatives au traitement sélectif des peptides dans différentes structures cérébrales, qui ne peuvent être détectées par d'autres méthodes.

Ici, des métabolites spécifiques de la tyrosine DES, indiqués en rouge, co-localisés avec le peptide parent indiqué en vert, ont été observés uniquement dans le striatum, mais pas dans la substance noire de rats dyskinétiques. L’analyse d’image dans la sous-nigra a révélé que le produit de dégradation, Lu et Kelin arch, indiqué en rouge, était inversement localisé par rapport à la Di norphine B indiquée en vert, indiquant que, durant la dyskinésie, la Di norphine B était libérée localement dans la sous-nigra latérale, puis métabolisée en Lu et en Careful dans un système AR Un. Une expérience unique utilisant l’imagerie en mode peut être réalisée en un ou deux jours, incluant la préparation des échantillons et l’acquisition des données.

Cela est ensuite suivi par un ou deux jours supplémentaires d'évaluation des données. Selon la taille de l'échantillon, les expériences de validation nécessiteraient un ou deux jours supplémentaires d'expérimentations pratiques en laboratoire si elles sont effectuées correctement. Il est important de faire particulièrement attention aux étapes suivantes.

La dissection des tissus et la congélation doivent être effectuées rapidement afin d'éviter la dégradation des peptides ; le protocole de lavage et d'application de la matrice doit être optimisé pour chaque expérience. L'évaluation des données et l'analyse statistique doivent être réalisées avec soin afin d'éviter les faux positifs dus à des effets de sur-normalisation ou à une mauvaise détection des pics.