Name: Spectrométrie de masse MALDI Imaging des neuropeptides dans la maladie de Parkinson (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Découvrez la spectrométrie de masse MALDI imaging pour cartographier les neuropeptides dans le cerveau de rat et étudier les changements induits par le traitement L-DOPA dans la maladie de Parkinson.

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Nous remercions Hanna Warner pour contribuer les données de la figure 3 et le professeur Jonas Bergquist pour une contribution précieuse. Le Conseil de recherche suédois (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA); Fondation Le Wiberg Åke (MA, JH), L&#39;Académie royale suédoise des sciences (MA, JH), et des produits chimiques suédoise Société (JH) sont remerciées pour le soutien financier.

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<li>Mass Spectrometry Binning Software GAB. , Vanderbilt Center for Quantitative Sciences. Nashville, TN. Available from:
		
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Il ya plusieurs avantages à l&#39;emploi de la spectrométrie de masse MALDI imagerie dans l&#39;étude des neuropeptides. Une analyse impartiale des données MS peut révéler que les noyaux du cerveau seulement spécifique, ou, comme dans les résultats présentés ici où seule la partie dorsolatérale du striatum est associée à une certaine condition physiopathologique. En conservant l&#39;information spatiale, il est alors possible de redéfinir les régions présentant un intérêt pour effectuer des analyses statistiques avec une plus grande sensibilité et une plus faible variabilité par rapport à l&#39;analyse de coupes de cerveau entier ou en utilisant les études traditionnelles sur Peptidomics extraits peptidiques. En outre, il est important de réaliser MALDI IMS permet de détecter facilement jusque-là inconnues modifications post-traductionnelles, mais les analyses structurelles doivent suivre pour déterminer les positions exactes des acides aminés qui sont modifiés. Pièges les plus courants dans la visualisation des données MALDI IMS comprennent la cartographie, l&#39;intensité du pic maximum à une échelle linéaire optique de black (0%) à la couleur (100%) pour chacune des sections de la série expérimentale (Figure 3), au lieu de mapper toutes les sections à une échelle commune absolue, où 100% est le pic d&#39;intensité maximale de toutes les sections (Figure 5) . Cette dernière méthode permet une comparaison des données du groupe et la visualisation des différences entre les groupes de traitement. Un obstacle majeur à l&#39;analyse MALDI IMS est la cession de peptides à des pics de masse spécifiques. Sur des tissus en tandem de spectrométrie de masse est parfois possible, mais se révèle souvent très difficile 13,14. Nous constatons que l&#39;approche plus traditionnelle comprenant un fractionnement préparatif sur une forte chromatographie par échange cationique, suivi par LC-MS/MS en phase inverse peut être utilisé pour de nombreux neuropeptides séquence avec succès et en particulier des peptides opioïdes. Il est encore pas rare d&#39;obtenir une bonne qualité de spectres MS / MS qui ne correspond pas à toutes les entrées de bases de données en utilisant les moteurs de recherche communs, tels que MASCOT. Dans ces cas de novo-séquençage à la main est l&#39;ONLl&#39;option y. La preuve ultime de l&#39;identité de pointe peuvent être obtenus par MALDI IMS des coupes de tissus de la souris knock-out appropriée, mais ce n&#39;est pas toujours disponible ou possible. Une alternative consiste à valider les résultats par une méthode diamétralement différente, par exemple par immunoblot de l&#39;Ouest ou immunohistochimie. Cela peut souvent inclure des anticorps et une quantité importante de travail de la validation des nouveaux anticorps. La stratégie générale présentée dans le présent protocole est optimisé pour les grandes expériences à l&#39;échelle du neuropeptide IMS MALDI, y compris plusieurs sections et des conditions expérimentales. Le protocole a été spécialement optimisé pour les peptides opioïdes et auront un impact important dans les études futures, tel qu&#39;il est employé dans divers domaines de recherche, y compris la douleur mécanismes sous-jacents et la réponse endogène à la drogue de dépendance.

1.1 Le prélèvement d&#39;échantillons et de préparation <ol><li> L&#39;isoflurane (Apoteksbolaget AB, Suède) </li><li> Des outils chirurgicaux, deux paires de ciseaux, une pince-gouge, spatule </li><li> Finement broyées de la glace sèche </li><li> Le papier d&#39;aluminium et des sacs en plastique pour le stockage </li><li> Cryostat (Microm, Heidelberg, Allemagne) </li><li> D&#39;indium-étain (ITO)-lames recouvertes de MALDI (Bruker Daltonics, Allemagne) </li><li> optimale à température moyenne de coupe (PTOM) (Sakura Finetek l&#39;Europe, Pays-Bas) </li><li> dessiccateur à vide </li></ol> 1.2 Domaine d&#39;application Matrice <ol><li> Acétonitrile (ACN), du méthanol (MeOH), l&#39;éthanol (EtOH) de pro-analyse de qualité (Merck, Allemagne). </li><li> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> L&#39;eau a été purifiée par un système de purification Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japon) ou Portrait 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 La spectrométrie de masse <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> Logiciel FlexImaging (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Calibration peptide ou une protéine standard (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Le traitement des données <ol><li> Origine v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab Version 7.9.0.529 (The MathWorks, Cambridge, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 Identification des neuropeptides <ol><li> Sonicateur ultrasons </li><li> 10 kDa de poids moléculaire de coupure du filtre (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Allemagne) </li><li> Colonne Hypersil (ThermoFisher) </li><li> Pyridine, l&#39;acide formique (FA), l&#39;acétonitrile (ACN), du méthanol (MeOH), l&#39;éthanol (EtOH) de pro-analyse de qualité (Merck, Allemagne). </li><li> L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Etats-Unis). </li><li> Agilent 1100 nanodébit LC, microWPS, colonne C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Micro-fractioncollector, plaque Prespotted cible anchorchip (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools logiciel (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio Travaux logiciel (V.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Logiciel Mascot (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep base de données ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

spectrométrie de masse maldi imaging des neuropeptides dans la maladie de parkinson

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

Imagerie MALDI spectrométrie de masse (IMS) est une approche puissante qui facilite l&#39;analyse spatiale des espèces moléculaires dans des échantillons de tissus biologiques 2 (Fig.1). Une coupe de 12 um de tissu mince est recouverte d&#39;une matrice MALDI, ce qui facilite la désorption et l&#39;ionisation des peptides et des protéines intactes qui peuvent être détectés avec un analyseur de masse, typiquement en utilisant une TOF MALDI / spectromètre de masse TOF. Généralement des centaines de pics peuvent être évalués dans une coupe de tissu de cerveau de rat unique. Contrairement aux techniques d&#39;imagerie utilisées couramment, cette approche ne nécessite pas de connaissance préalable des molécules d&#39;intérêt et permet d&#39;analyser non supervisée et complète de plusieurs espèces moléculaires tout en conservant sa spécificité moléculaire et de la sensibilité 2. Nous décrivons ici une approche basée sur IMS MALDI pour élucider les profils de distribution spécifiques à la région de neuropeptides dans le cerveau de rat de la maladie d&#39;un animal modèle de la maladie de Parkinson (PD). PD est une maladie neurodégénérative fréquente avec une prévalence de 1% pour les personnes de plus de 65 ans de 3,4. Le traitement le plus commun des symptômes est basée sur remplacement de la dopamine en utilisant la L-DOPA 5. Cependant ceci est accompagné par des effets secondaires graves, y compris des mouvements anormaux involontaires, appelés L-DOPA dyskinésies induites (LID) 1,3,6. Un des changements les plus important moléculaire dans LID est une régulation positive de l&#39;ARNm prodynorphine précurseur opioïde 7. Les peptides dynorphine moduler la neurotransmission dans les zones du cerveau qui sont essentiellement impliqués dans le contrôle des mouvements 7,8. Toutefois, à ce jour les peptides opioïdes exactes qui proviennent de la transformation du précurseur neuropeptide n&#39;ont pas été caractérisé. Par conséquent, nous avons utilisé MALDI IMS dans un modèle animal de la maladie de Parkinson expérimentale et la L-DOPA dyskinésie induite. Imagerie MALDI spectrométrie de masse s&#39;est avérée particulièrement avantageuse par rapport à la caractérisation neuropeptidetion, car les approches d&#39;anticorps couramment utilisés cibles basées sur des séquences peptidiques connues et observées auparavant modifications post-traductionnelles. En revanche MALDI IMS peut démêler nouveaux produits de traitement de peptides et de révéler ainsi de nouveaux mécanismes moléculaires de la modulation de la transmission neuronale neuropeptide. Bien que le montant absolu des neuropeptides ne peut pas être déterminée par MALDI IMS, l&#39;abondance relative des ions peptidiques peuvent être délimitées à partir des spectres de masse, donnant un aperçu sur l&#39;évolution des niveaux de santé et la maladie. Dans les exemples présentés ici, les intensités des pics de la dynorphine B, alpha-neoendorphin et la substance P ont été trouvés à être significativement augmentée dans le dorsolatéral, mais pas le dorsomédial, le striatum des animaux avec des dyskinésies sévères impliquant visage, le tronc et les muscles orolingual (Fig. 5). En outre, MALDI IMS a révélé une corrélation entre la sévérité de la dyskinésie et les niveaux de des-tyrosine alpha-neoendorphin, ce qui représente un mécanisme jusqu&#39;alors inconnu de la fonctionnelle inactivationvation de dynorphines dans le striatum que la suppression de la N-terminal tyrosine réduit des récepteurs opioïdes du dynorphine de la capacité de liaison 9. Il s&#39;agit de la première étude sur la caractérisation neuropeptide dans couvercle à l&#39;aide MALDI IMS et les résultats mettent en évidence le potentiel de la technique pour l&#39;application dans tous les domaines de la recherche biomédicale.

Pharmacothérapie remplacement de la dopamine en utilisant la L-DOPA est le traitement le plus couramment utilisé symptomatique de la maladie de Parkinson, mais il est accompagné par des effets secondaires, y compris des mouvements anormaux involontaires, dyskinésie appelé<sup&gt; 1</sup&gt;. Ici, un protocole pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse MALDI est présenté qui détecte les changements dans les niveaux de cerveau de rat neuropeptide liés à une dyskinésie.

Spectrométrie de masse MALDI Imaging des neuropeptides dans la maladie de Parkinson

La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) MALDI est une approche puissante qui facilite l'analyse spatiale d'espèces moléculaires dans des échantillons de tissus biologiques2 ...

L'objectif principal de cette procédure est de préciser la distribution spatiale des neuropeptides, en particulier des peptides opioïdes, directement dans des coupes cérébrales minces à l'aide de la spectrométrie de masse par imagerie moldy. Cette approche est réalisée en premier lieu en prélevant des sections tissulaires de 12 micromètres d'épaisseur à partir d'un cerveau de rat congelé instantanément, puis en les montant sur des lames de verre conductrices. La deuxième étape consiste à appliquer le Matrixx moldy en réseaux sur les sections à l'aide d'une imprimante chimique jet d'encre, puis à acquérir un spectre de masse à partir de chaque point de matrice.Ensuite, plusieurs pics peptidiques sont visualisés afin de s'assurer du bon déroulement global de l'expérience. Cette étape est suivie par l'inspection et le traitement de l'exportation des spectres de masse, le post-traitement des données peptidiques et l'évaluation statistique. La dernière étape consiste à analyser et valider les données peptidiques obtenues par la spectrométrie de masse en imagerie sur des échantillons moisissus.En définitive, les résultats montrent des différences significatives dans les niveaux relatifs des peptides opioïdes dans différentes régions du cerveau entre les divers groupes traités. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les approches basées sur des gels SAO par radio-immunodosage, est que l'imagerie multiplexe permet de localiser les modifications induites par le traitement tout en conservant une haute spécificité moléculaire. Cela nous offre ainsi la possibilité de détecter des troncatures auparavant non détectées des modifications post-traductionnelles.Les personnes novices avec cette méthode éprouveront des difficultés au départ, car la technique exige une préparation approfondie des échantillons et un traitement rigoureux des données. L'accent sera mis ici sur la qualité du tissu, la matrice, le protocole d'application, l'évaluation des données et les expériences de validation suivantes. Il est essentiel de travailler rapidement et avec rigueur lors de la dissection du tissu afin d'éviter la dégradation protéolytique.Après avoir sacrifié le rat selon les protocoles approuvés, retirez immédiatement le cerveau, transférez-le sur de la glace sèche en poudre et laissez-le geler lentement, puis stockez le cerveau dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Les cerveaux entiers peuvent être conservés plusieurs années avant la sectionnement sans perte de qualité du signal de spectrométrie de masse. Lorsque vous êtes prêt à commencer la procédure, fixez le cerveau sur le porte-échantillon à l’aide de milieu d’encastrement (tissue tech), en évitant toute contamination de la partie du cerveau à découper, car le milieu d’encastrement interfère avec l’ionisation et la désorption des peptides.Découper le tissu congelé au microtome cryostat en tranches de 12 microns et monter les coupes tissulaires sur des lames en verre conductrices MALDI. La coloration des coupes tissulaires peut être effectuée à ce stade et la qualité du tissu peut être inspectée. Cette figure montre une coloration au violet de crésyl de tissu cérébral congelé instantanément dans l'azote liquide, ce qui a provoqué des fissures et des déchirures du tissu.Ce tissu ne conviendrait pas à une spectrométrie de masse par imagerie à haute résolution car la matrice va se diffuser et ne va pas cristalliser uniformément. Séchez les coupes pendant 15 minutes sous vide et conservez les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Les sections de tissu doivent être analysées dans le plus bref délai possible après la découpe, même si elles sont conservées à moins 80 degrés Celsius. Tout d'abord, décongelez les sections dans un dessiccateur pendant une heure, puis rincez les lames avec les sections dans de l'éthanol à 70 % à température ambiante pendant 10 secondes, suivies de deux rinçages dans de l'éthanol à 95 % à température ambiante, chacun de 10 secondes. Après le rinçage, séchez les lames dans un dessiccateur pendant 10 minutes.Examinez les sections au microscope afin de vous assurer que les coupes de tissu sont de bonne qualité, sans distorsion du tissu, ni micro-déchirures ou petites fissures pouvant nuire à la qualité du MEB matriciel. Ensuite, préparez une solution matricielle fraîche composée de 50 milligrammes par millilitre de DHB et de 50 % de méthanol, 10 % d'acétate d'ammonium 150 millimolaire, et de 0,3 % d'acide trifluoroacétique dans l'eau. Numérisez le porte-lame en verre contenant la coupe de tissu et alignez le support sur les points de référence respectifs à l'aide de la fonction d'analyse d'image dans le logiciel de la puce.Ensuite, sélectionnez les paramètres appropriés d'application de la matrice pour la région cérébrale et les analytes ciblés. Puis, précisez la résolution spatiale. Appliquez maintenant la matrice en utilisant le protocole optimisé sur l'imprimante chimique Jett.Scannez les sections finalisées avec les dépôts de matrice et enregistrez l'image avant la demande de données multiples. Cette image sera utilisée ultérieurement pour croiser les dépôts de matrice avec les coordonnées motorisées de la platine MALDI. Si elles ne sont pas utilisées immédiatement, les sections avec dépôts de matrice peuvent être conservées dans un dessiccateur sous vide jusqu'à leur utilisation.Pour la plupart des expériences, plusieurs sections seront analysées simultanément, comme illustré ici. Chaque support de lame accueille deux lames en verre, et par conséquent, plusieurs paires doivent être analysées pour tous les supports. Les méthodes et paramètres d'acquisition en spectrométrie de masse par temps de vol (TOF) doivent être identiques ; toutefois, les calibrations de masse des peptides doivent être vérifiées pour chaque lame.Ensuite, optimisez les paramètres d'acquisition sur l'échantillon de tissu, notamment la mise au point du laser et l'intensité du laser. Puis, saisissez le nombre de tirs nécessaire pour obtenir un signal MS optimal sans élever la ligne de base, ce qui réduirait la résolution des pics. Évitez la saturation du détecteur ou l'ablation de la matrice provenant de dépôts de matrice voisins, et sélectionnez le déplacement du laser.Estimez le nombre maximal de tirs pouvant être effectués par point de matrice jusqu'à ce que seul le bruit soit détecté ici. Accumulez 600 tirs à partir de chaque dépôt de matrice par incréments de 25 tirs, soit un total de 24 étapes, en utilisant un motif aléatoire de déplacements. Croisez les analyses de toutes les sections imprimées avec les coordonnées moteur de la platine MALDI à l'aide du logiciel flex imaging.Ensuite, à l'aide d'un logiciel de traitement par lots en exécution automatique, effectuez l'acquisition des données en mode par lots. Utilisez des outils de visualisation des données, tels que Flex Imaging, pour examiner visuellement les images IMS Maori afin d'évaluer les distributions de l'intensité des pics et déterminer si ces distributions sont liées à des caractéristiques tissulaires, à la qualité du dépôt ou à des effets de normalisation. Cet exemple montre la distribution de 10 pics peptidiques différents chez neuf animaux distincts.Le courant total de fer ou TIC utilisé pour la normalisation est affiché en blanc. Le TIC correspond à la somme de toutes les valeurs d'intensité dans un spectre de masse. La valeur de TIC est très faible chez l'animal trois, et les images des peptides montrent davantage de bruit que d'informations spécifiques.Le cerveau de l'animal numéro six présente une zone au bas de la section avec des valeurs TIC très élevées. Cet effet se traduit par des intensités anormalement élevées dans cette zone des images de peptides, C et D. Il s'agit d'un effet de sur-normalisation potentiel qui peut influencer l'analyse des données. Les effets de sur-normalisation peuvent conduire à des résultats inexactes s'ils sont spécifiquement présents dans un seul groupe de traitement.Dans cet exemple, la TIC est nettement plus élevée pour le groupe C, ce qui peut affecter anormalement les intensités des pics individuels. Par exemple, l'intensité moyenne du pic de la cytochrome C est plus élevée pour le groupe C que pour le groupe B dans les données brutes, mais après normalisation, l'intensité du pic est désormais inférieure. Pour le groupe C, cela peut conduire à des interprétations erronées sérieuses des résultats.Il est important de toujours calculer la moyenne de l'ICM pour chaque groupe de traitement avant de procéder à une validation approfondie des données. Ensuite, pour définir la région d'intérêt, il est essentiel de comprendre que l'ARN messager de la pro-dorphine est traduit en un précurseur peptidique de pro-dorphine de 14 kilodaltons. Dans les neurones striés, la pro-dorphine est empaquetée dans des vésicules qui sont transportées à travers les dendrites vers d'autres neurones striés, ainsi que par les axones vers la substance noire, située à plusieurs millimètres du corps cellulaire.Les vésicules contiennent des enzymes qui transforment davantage le propeptide en peptides di-norphine, tels que l'alpha néo-endorphine di-norphine A ou la di-norphine B. Chacun peut activer différents récepteurs opioïdes après libération vers la structure cible, la substance noire. Les di-norphines sont ensuite dégradées et éliminées par des endo- et exo-peptidases. Certains de ces peptides ne peuvent être détectés que par spectrométrie de masse, car les anticorps existants ciblent uniquement l'extrémité C-terminale des peptides et non l'extrémité N-terminale. La séquence Y-G-G-F-L, responsable de l'activation des récepteurs opioïdes, est produite par des cellules di-norphines situées dans la région AUM et projetant vers la substance noire.Par conséquent, dans l'expérience suivante, l'AUM errant et la substance noire ont été analysés par IMS moisie, les spectres provenant de chaque région d'intérêt. La strie dorsomédiale et dorsolatérale de l'AUM ainsi que la substance noire médiale et latérale ont été définies dans le logiciel d'analyse Flex et exportées pour l'analyse des données. Pour la réduction des données, effectuez la détection des pics à l'aide des outils de recherche de pics inclus dans différents logiciels.Par exemple, utilisez l'analyse de pics dans Origin ou MS Peaks dans Matlab. Exportez la liste des pics à partir de tous les spectres sous la forme d'un seul fichier texte séparé par des tabulations, déterminez les limites initiale et finale des pics. À l'aide d'un logiciel tel que le logiciel gratuit P bin, calculez la surface sous la courbe entre les limites des pics et utilisez ces valeurs pour l'analyse statistique. La reproductibilité MS entre les groupes de traitement peut être évaluée en calculant la trace MS moyenne et l'erreur type pour chaque valeur de masse.Dans cet exemple, les spectres moyens du groupe témoin intact seront utilisés pour évaluer la variabilité sur toute la plage de masses analysée. Une bonne reproductibilité peut être observée puisque les intensités des pics sont identiques dans les deux groupes témoins et que l'écart type est faible. Cela garantit une analyse statistique valide.Si les jeux de données présentent un degré élevé de variation, il est presque toujours nécessaire de répéter l'expérience Maori IMS, en réduisant autant que possible les sources de variation expérimentale. Typiquement, nous traitons autant de sections et d'animaux que possible lors d'une seule session, incluant parfois plusieurs personnes travaillant par postes. Toutefois, dans certains cas, cela ne suffit toujours pas et d'autres stratégies peuvent être mises en œuvre.Par exemple, si certains spectres sont constitués de bruit, ceux-ci peuvent l'être en traçant la distribution de fréquence du TIC, et une valeur seuil de coupure peut être utilisée pour éliminer les données suboptimales. Une autre manière d'évaluer les données consiste à tracer tous les pics de deux animaux appartenant au même groupe l'un par rapport à l'autre. Si les intensités des pics sont égales chez les deux animaux, le tracé d'intensité affiche une ligne droite étroite.Si un animal présente des données spectrales de faible qualité, le graphique affiche généralement des décalages asymétriques par rapport à la droite, comme observé à droite. Pour l'identification des séquences peptidiques, effectuez une analyse peptid Dominic sur des extraits de tissu cérébral de rat en utilisant une chromatographie liquide multidimensionnelle couplée à une spectrométrie de masse à haute résolution. Brièvement, les neuropeptides sont extraits de sections cérébrales de rat et préfractionnés par chromatographie échangeuse de cations forte.Les différentes fractions sont ensuite séparées davantage à l’aide d’une HPLC en phase inverse à flux nanométrique. Ensuite, caractérisez les neuropeptides par spectrométrie de masse tandem à ionisation par électrospray, en utilisant un instrument hybride combinant un piège à ions linéaire et un analyseur à résonance cyclotronique dans un anneau de stockage. Enfin, effectuez l’identification des séquences peptidiques par comparaison avec une base de données. Des anticorps spécifiques sont disponibles pour certains neuropeptides, et des expériences d’immunohistochimie peuvent valider à la fois l’identification des peptides et les résultats expérimentaux. La résolution est supérieure à celle de la spectrométrie de masse d’imagerie Maori, et des informations supplémentaires peuvent être obtenues.Dans cet exemple, des fibres nerveuses immunoréactives à la Dior bee peuvent être observées dans l'hippocampe, panneau supérieur gauche, et dans la substance noire, panneau inférieur gauche, tandis que l'image IMS Maori en bas à droite révèle la localisation au niveau de différentes régions cérébrales. La preuve ultime qu'un pic de masse peut être attribué sans ambiguïté à un peptide spécifique consiste à réaliser une IMS moldy sur des animaux invalidés pour le peptide, comme la souris knockout pour le pronin. Plusieurs pics, indiqués par les flèches, sont absents chez les animaux invalidés, mais présents chez les témoins de type sauvage.Animaux Des pics de peptides non apparentés, tels que la substance P et P ink, ne montrent aucune différence entre les animaux knock-out et les animaux contrôles. Les intensités des pics de la dinorphine B et de l'alpha néo-endorphine sont significativement augmentées dans la lésion par la six-hydroxydopamine. Le striatum parkinsonien de ces animaux hautement dyskinésiques, indiqué par les flèches, par rapport au groupe contrôle lésé et faiblement dyskinétique.L'analyse statistique a également révélé une augmentation significative pour une masse peptidique correspondant à l'alpha néo-endorphine tronquée, chez laquelle la tyrosine en extrémité C-terminale a été supprimée. En effet, l'inspection visuelle des résultats d'imagerie montre une forte colocalisation des peptides parentaux di-norphine, représentés en vert, et de leurs métabolites tyrosine DES apparentés, représentés en rouge ; le jaune indique un chevauchement régional dans le panneau de superposition situé à droite. Le grand potentiel de cette technique est mis en évidence par les découvertes concernant le traitement sélectif des peptides dans différentes structures cérébrales, qui ne peuvent être détectées par d'autres méthodes.Ici, des métabolites spécifiques de la tyrosine DES, indiqués en rouge, co-localisés avec le peptide parent indiqué en vert, ont uniquement été observés dans le striatum, mais pas dans la substance noire de rats dyskinétiques. L’analyse d’image dans la substance noire a révélé que le produit de dégradation, Lu et Kelin arch, indiqué en rouge, était inversement localisé par rapport à la Di-norphine B indiquée en vert, indiquant que durant la dyskinésie, la Di-norphine B était libérée localement dans les parties latérales de la substance noire, puis métabolisée en Lu et Careful dans un système AR Un. Une expérience unique utilisant l’imagerie par moule peut être réalisée en un ou deux jours, incluant la préparation des échantillons et l’acquisition des données.Cela est ensuite suivi par un ou deux jours supplémentaires d'évaluation des données. Selon la taille de l'échantillon, les expériences de validation nécessiteraient un ou deux jours supplémentaires d'expérimentations pratiques en laboratoire si elles sont effectuées correctement. Il est important d'apporter un soin particulier aux étapes suivantes.La dissection des tissus et la congélation doivent être effectuées rapidement afin d'éviter la dégradation des peptides ; les protocoles de lavage et d'application de la matrice doivent être optimisés pour chaque expérience. L'évaluation des données et l'analyse statistique doivent être réalisées avec soin afin d'éviter les faux positifs dus à des effets de sur-normalisation ou à une mauvaise détection des pics.

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