Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

L’objectif global de l’expérience suivante est de mesurer quantitativement l’organisation subnucléaire dans les cellules de levure et comment elle est affectée par des changements dans les conditions de croissance ou des mutations. Ceci est réalisé en cultivant des cellules de levure pour loger la phase dans des conditions qui minimiseront l’autofluorescence. Ensuite, les cellules sont placées dans une chambre de croissance pour être observées au microscope.

Ensuite, des images sont prises pour mesurer la distance entre les différentes structures marquées par fluorescence dans la cellule. On obtient des résultats qui montrent des différences dans l’organisation non nucléaire, qui dépend de la modification des conditions nutritionnelles pendant la croissance de la culture de levure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épie sur l’interaction entre l’organisation subar ou la chromatine et la régulation des gènes.

Le poisson et la levure commencent par préparer le milieu minimal d’Édimbourg ou EMM et EMM avec également du chlorure d’ammonium pour réduire l’autofluorescence plutôt que l’autoclave. Utilisez un filtre de 0,2 micron pour stériliser la solution de glucose et ajoutez-la au média de l’autoclave. Inoculez trois millilitres d’EMM dans des tubes de 30 millilitres avec des cellules de poisson et de levure.

Fraîchement cultivé sur une plaque de gélose dans un milieu riche, YEA recouvre légèrement les tubes et incube les cellules dans un agitateur à 225 tr/min et 30 degrés Celsius. Maintenez les cellules en phase logarithmique pendant deux jours en les comptant avec une chambre birka tous les matins et tous les soirs et en les diluant à la densité appropriée. Le jour de l’expérience.

Les cellules doivent être une phase logarithmique précoce du personnel d’azote. Les cellules se réfèrent à la procédure décrite dans le protocole écrit pour collecter les cellules dans une pastille au fond d’une centrifugeuse à tube, 1,5 millilitre de cellules dans un tube à un maximum de 1,5 RCF en faisant d’abord tourner le tube pendant deux minutes, puis en le tournant à 180 degrés pour une rotation supplémentaire de deux minutes. Retirez tous les échantillons de surnageant, sauf 10 à 15 microlitres, et remettez les cellules en suspension dans le milieu restant, avec une aliquote d’un milligramme par millilitre pour filtrer la lectine stérilisée.

Ajoutez cinq microlitres de solution de lectine dans le coin du verre de couverture et ajoutez cinq microlitres de culture à la goutte de lectine. Pour créer une chambre de croissance de cellules de base S pom, pipetez cinq microlitres d’EMM sur une lame propre et retournez le verre de couverture avec la culture à un angle de 70 degrés sur le milieu et déposez-le de haut en bas sur l’EMM pour sceller les bords avec de la graisse au silicone. Coupez l’extrémité large d’un embout de 200 microlitres et fixez l’extrémité étroite à une seringue de deux millilitres.

Remplissez la seringue avec environ un millilitre de graisse au silicone. Appliquez une fine ligne de silicium sur les bords du verre de protection en poussant doucement le piston de la seringue pour imager la chambre de croissance. Commencez par utiliser l’imagerie en fond clair pour localiser les cellules et creuser.

Obtenez une image nette pour la microscopie confocale. Nous utilisons un microscope à balayage laser Zeiss LSM 700 avec une lentille d’objectif à huile plan apoch chromat 63 fois et un réglage de balayage plan moyen de 16 lignes. Réglez les unités de surface sur un à 1,1 pour obtenir une tranche optique de 0,8 micron.

Scannez les cellules avec des lasers qui détectent Alexa 4, 88 et mCherry ou GFP. Enregistrez suffisamment d’images pour prendre des mesures dans 60 cellules pour chaque drain. Passez à une nouvelle chambre de croissance avec des cellules fraîches.

Après 60 minutes d’imagerie, ouvrez une image dans le programme Zeen Light Edition pour mesurer la distance entre les signaux de différents fluorophores dans le même plan focal. Ouvrez l’outil de mesure et ajustez l’intensité lumineuse et le contraste pour identifier le centre de chaque signal fluorescent, par exemple, le corps du pôle de broche et la membrane nucléaire, et mesurez la distance entre eux. Transférez les données dans une feuille de bloc-notes.

Comparez les distances subcellulaires moyennes ou médianes entre différentes souches et traitements à l’aide de logiciels statistiques ou de tests tels que le test T ou le test de somme du rang de Man Whitney. Dans cet exemple de souche, PJ 1 18 5 a été cultivé en EMM et un échantillon a été placé dans une chambre de croissance pour l’imagerie. Puis une aliquote de PJ 1 18 5.

La culture a été transférée dans l’EMMN et incubée pendant 15 minutes avant qu’un échantillon ne soit placé dans une chambre de croissance pour l’imagerie. L’outil de mesure a été utilisé pour mesurer la distance entre le locus et le corps du pôle de fuseau, ainsi qu’entre le locus et la membrane nucléaire. Comme le montre ici, il y avait une différence statistiquement significative dans la distance à laquelle le groupe de gènes s’éloignait de la membrane nucléaire vers le corps du pôle fusiforme dans les cellules privées d’azote par rapport aux cellules cultivées dans l’azote.

Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP avaient une distribution normale, et donc les distances moyennes ont pu être comparées à l’aide d’un test T. Il y avait une différence significative entre les deux valeurs moyennes. Les données mesurant la distance entre la GFP et la NM n’avaient pas une distribution normale, et les distances médianes ont donc été comparées à l’aide d’un test de somme classée par Whitney.

Il y avait une différence significative entre les deux valeurs médianes à la suite de cette procédure. D’autres méthodes, comme la PCR en temps réel, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la corrélation entre le niveau d’expression génique et les changements dans l’organisation subnucléaire.