Name: Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative en fluorescence de cellules vivantes chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Cette méthode permet d'étudier l'organisation sous-nucléaire et son évolution selon les conditions de croissance et les mutations.

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Nous remercions le Professeur Hiraoka de nous envoyer les souches. Nous reconnaissons le soutien de la Fondation et de Goran Gustafssons la Société du cancer suédois (2008/939).

1. Culture de levure de fission <ol><li> Préparer Edinburgh Minimal Médias (EMM) et EMM, sans chlorure d'ammonium (EMM-N) 8. Afin de réduire l'autofluorescence de la solution de glucose ne doit pas être autoclavés, mais plutôt en utilisant un filtre stérilisé filtre de 0,2 um et ensuite ajouté à la presse en autoclave. </li><li> Inoculer les cellules de levure à fission fraîchement cultivés sur une plaque de gélose avec les médias riches, PJE 8, dans 3 ml de liquide avec les médias EMM de glucose stérilisé filtre. Utilisez des tubes 13ml avec une légère poussée sur le couvercle pour assurer une bonne ventilation des cellules. Laissez les cellules se développent en les secouant avec 225 rpm à 30 ° C. Gardez la croissance des cellules en phase log (1 x 10 6 - 2 x 10 7 cellules / ml) pendant 2 jours en les comptant à l'aide d'une chambre Burker suivie par dilution appropriée, chaque matin et chaque soir. </li><li> Le jour de l'expérience assurez vous d'avoir des cellules en phase logarithmique précoce, 5 x 10 6 - 1 X 10 7 cellules / ml. </li><li> Pour mourir de faim tIl cellules de l'azote pendant 20 minutes à partir de supports switch EMM EMM-N médias. Cela se fait par prélèvement de 3 ml de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans 9 levure à fission. Utilisez la technique du double de filature, de sens; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf 2 min 10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube. Laver une fois avec EMM-N et ensuite dissoudre le culot dans EMM-N et incuber les cellules pendant 15 minutes à 30 ° C en agitant à 225 rpm, puis continuer au point 2. La préparation des échantillons. </li></ol> 2. La préparation des échantillons <ol><li> Récolte de 1,5 mL de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans 9 levure à fission. Utilisez la technique du double filature, meaning; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf pendant 2 min 10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube. </li><li> Retirer le surnageant, mais laisser 10 à 15 uL et remettre en suspension les cellules dans les médias reste. Alternativement ajouter 10 ul de milieux frais pour remettre le culot cellulaire. </li><li> Assurez-vous d'avoir des lames de verre clair et couvercle en verre (pas 1.5). Normalement, vous n'avez pas à les nettoyer, mais assurez-vous qu'ils ne sont pas pleins de poussière. </li><li> Sortez du congélateur une aliquote d'une solution stock de lectine 1mg/mL qui a été stérilisée par filtration. La solution de lectine peuvent être recongelés plusieurs fois. La lectine est utilisé pour fixer les cellules de levure au couvercle en verre. </li><li> Placez 5 pi de EMM de glucose stérilisé filtre sur le verre objectif. </li><li> Placez 5 pi de solution de lectine dans le coin de la vitre de couverture. Par la suite placer 5 uL de culture de cellules dans le même coin, c'est à dire dans la chute de la lectine. Mélanger à la pipette quelques fois et puis étaler la culture cellulaire lectine mélange à travers le couvercle en verre en utilisant le côté long de la pointe de la pipette. Selon la densité de votre mélange de cellules ou de tout laisser aspirer l'excès de liquide dans le coin opposé du verre de couverture. </li><li> Placez le couvercle en verre, en haut, avec un côté sur le verre objectif et de l'autre côté sur le banc. Laissez le couvercle en verre sécher un peu pendant quelques minutes. Il doit absolument pas être complètement sec, mais il ne faut pas trop de liquide sur le verre. </li><li> Placez le couvercle en verre avec un ange d'environ 70 ° par rapport au verre objectif par la chute d'EMM. Lâchez le couvercle en verre afin qu'il va tomber de haut en bas dans la goutte d'EMM. </li><li> Pour sceller les bords avec de la graisse silicone préparer une seringue de 2 ml. Couper l'extrémité large de la pointe 200 pi et le joindre à la seringue. Remplir la seringue avec environ 1 ml de graisse au silicone. Une ligne fine de silicium est appliqué sur les bords du verre couvercle en douceur du pushing le piston de la seringue. Maintenant vous avez une petite chambre de croissance de S. cellules pombe. </li></ol> 3. Microscopie <ol><li> Initialiser le microscope à fluorescence en allumant la lampe au mercure / xénon, le microscope et l'ordinateur. Placer la chambre de croissance de la levure dans le microscope à fluorescence. Utilisez un objectif 63 X ou un objectif 100 X avec NA = 1.3 ou supérieur. Si un objectif de pétrole est utilisé, ajouter l'huile. </li><li> Utilisez le champ clair de trouver les cellules et obtenir une image nette. </li><li> Les réglages pour la microscopie par fluorescence varient selon les fluorochromes utilisés pour marquer les cellules de levure et le microscope. Nous utilisons un microscope confocal Zeiss LSM 700 microscope laser à balayage avec le Plan-Apochromat lentilles huile d'objectif 63x (NA = 1,4) avec la ligne de réglage 16 plan de balayage moyenne. Le sténopé doit être réglé de 1 à 1,1 unités d'Airy, qui donne une tranche optique de 0,8 mm. Nous détectons la GFP dans la piste 1 en utilisant le jeu de filtres pour Alexa 488 avec un séparateur de faisceau à 582 nm, donc detecting longueurs d'onde entre 488 et 582 nm. En piste 2, nous utilisons un ensemble de filtres optimaux pour mCherry utilisant un séparateur de faisceau à 578 nm, donc la détection des longueurs d'onde entre 578 et 600 nm. Cela signifie que la piste 2 fois le rapport de la direction (SPB) et NM (mCherry) sera détectée. </li><li> Prenez autant de photos nécessaires pour être capable de mesurer dans 60 cellules différentes pour chaque souche. Habituellement 15 photos de champs de microscopie indépendants sont assez. Il est recommandé une chambre de croissance de nouvelles cellules fraîches avec est faite, si votre temps de microscopie dépasse 60 minutes. </li></ol> 4. La mesure quantitative des distances subcellulaire <ol><li> Ouvrez les photos dans le programme d'édition Zeiss Lumière zen. En utilisant la mesure de l'outil de mesures de la distance en um entre les différents fluorochromes dans toutes les cellules où tous les signaux sont dans le même plan focal. Ajuster l'intensité lumineuse et le contraste pour identifier le centre du signal fluorescent. Ce protocole simplifié n'utilise que deux c différentesouleurs et donc le SPB et NM sont dans le même canal. Le SPB est distingué par sa structure dans le grand rond NM. Transfert des distances à une feuille de bloc-notes. Mesurer au moins 60 cellules. D'autres programmes tels que ImageJ pourrait également être utilisé pour mesurer la distance, mais Zeiss zen Lumière est préférée en raison de sa plus haute résolution de l'image et la facilité d'zoomer et dézoomer à l'aide de ce programme. Photos en format LSM a ouvert en ImageJ aura les deux canaux sur le dessus de l'autre. Pour faire une photo avec les deux canaux, d'abord séparer les deux canaux et par la suite les fusionner. Par la suite, l'outil en ligne peut être utilisé pour mesurer les distances tel que décrit ci-dessus. </li><li> Comparez les distances moyennes ou médianes subcellulaire entre différentes souches et les traitements en utilisant un programme statistique, par exemple t-test ou test de Mann-Whitney somme des rangs, par exemple en utilisant le logiciel SigmaStat-3.5. Fréquemment, les données ne sont pas normalement distribuées, depuis il y aura une sélection des cellules avec des courtsdistances entre les signaux fluorescents puisque tous les signaux doivent être dans le même plan focal à mesurer. Un t-test ne peut être utilisé lorsque les données ont une distribution normale alors qu'un test de Mann-Whitney permet la comparaison des ensembles de données qui n'ont pas une distribution normale. Dans un test t de la moyenne des deux ensembles de données différents sont comparés alors que dans un test de Mann-Whitney, la médiane est comparée. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Strain PJ1185: (H + + his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 lacO] SID4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) a été cultivé dans EMM . Un échantillon a été retiré et monté dans une chambre de croissance des petites et photos ont été prises (fig. 1A + N). Par la suite le milieu de croissance a été remplacé par EMM w / o chlorure d'ammonium (EMM-N), et les cellules sont grown pendant 15 minutes en secouant. Les cellules ont ensuite été affamés d'azote monté dans une chambre de croissance avec EMM-N et photos ont été prises (fig. 1A-N). L'outil de mesure a été utilisée pour mesurer la distance entre le lieu (GFP) et le SPB (Fig. 1B et tableau 1). En outre, la distance entre le locus (GFP) et le NM a été mesurée (Fig. 1B et tableau 2). Les distances médianes subcellulaire avant et après épuisement de l'azote ont été comparées en utilisant le logiciel de SigmaStat-3.5 (tableau 3). Il y avait un décalage statistiquement significatif dans la localisation de l'amas de gènes s'éloignant de la NM vers la SBP. Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP a une distribution normale, et donc les distances moyennes (1,777 um + N et 1587 um-N) peut être comparé en utilisant un test t (Tableau 1 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs moyennes (p = 0,008, test t). Les données mesurant la distance entre la GFP et NM n'ont pas eu une normale distribution et donc les distances médianes (0 um + N et 0,390 um-N) ont été comparés en utilisant un test de Mann-Whitney (tableau 2 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs médianes (P &lt;0,001, test de Mann-Whitney somme des rangs). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. La localisation d'un cluster de gènes nommés Chr1, marquée par la GFP, a changé après la famine azote. (A) Colonne de gauche, + N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans la colonne de droite EMM-N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans EMM-N. Le vert est le signal GFP étiquetage du cluster Chr1, le rouge est la RDRF et de l'étiquetage mCherry le SPB et NM, respectivement. (B) le noyau même cellule que (A) mais maintenant, avec les distances mesurées subnucléaires; jaune: le diamètre du noyau cellulaire, bleu: la distance entre les SPB et GFP signal et rose: la distance entre le signal GFP et la membrane nucléaire. <pclass alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg"></pclass> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 1"> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 1"> Tableau 1. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 2"> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 2"> <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 2"> Tableau 2. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM-N. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM. <imgalt src='"/' files></imgalt> Tableau 3. Statistiques descriptives des distances observées dans la souche subnucléaires PJ1185 avant (+ N) et après (-N) de famine azote. Première rangée: le nombre de cellules mesurées, deuxième rangée: diamètre moyen (d), troisième ligne: diamètre médian (d), ci-ligne: la distance moyenne entre la GFP et SPB, cinquième ligne: les distances médianes entre la GFP et NM.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Durant la dernière décennie l&#39;utilisation de l&#39;imagerie de cellules vivantes pour surveiller les événements cellulaires est devenu plus populaire. Cela a commencé avec l&#39;utilisation de la protéine à fluorescence verte de la méduse Aequorea victoria et maintenant de nombreux fluorochromes différents sont disponibles à travers une émission de fluorescence large spectre de cyan (475 nm) à rouge lointain (648 nm) 11. Un des principaux avantages de l&#39;imagerie des cellules vivantes au cours d&#39;immunofluorescence est que les cellules ne sont pas fixés par le formaldéhyde ou de l&#39;éthanol / acétone traitement avant la microscopie, évitant ainsi les artefacts possibles du processus de fixation. En outre, imagerie des cellules vivantes offre la possibilité de suivre des cellules individuelles et de prendre des photos à intervalles fréquents pendant les heures ou les jours d&#39;incubation, ce qui permet d&#39;obtenir des films d&#39;événements cellulaires 12. Les cellules de mammifères ont l&#39;avantage d&#39;avoir une plus grande taille, avec des diamètres de l&#39;ordre de 100 pm, par rapport à la cellule plus petite levure avec un diamètre d&#39;environ 3-4 &amp;mu; m. D&#39;autre part, l&#39;avantage avec de la levure est le génome facilement manipulable. La recombinaison homologue se produit très efficace dans la levure et est utilisée pour fusionner des protéines d&#39;intérêt à des fluorochromes différents 3. Par ailleurs, en utilisant l&#39;intégration ciblée de séquences et d&#39;expression lacO ultérieure de LACR-protéine GFP permet la détection d&#39;une partie spécifique du génome dans le noyau cellulaire 2. Utiliser S. pombe cellules en microscopie a des avantages supplémentaires car ils sont naturels des organismes unicellulaires qui se développent avec un temps de génération rapide à faible coût conditions de culture cellulaire. En outre, S. pombe est un organisme eucaryote excellent modèle car il a des gènes homologues métazoaires. Une des principales limites de cette technique est autofluorescence dans la cellule de levure perturber la détection du signal vrai. Ce problème peut être surmonté en utilisant des milieux de croissance minimale de glucose stérilisé filtre au lieu de l&#39;autoclave. DansOutre les cellules de levure doivent être cultivées pendant 2 jours en phase journal avant leur montage. Le protocole présenté ici propose une méthode relativement simple, mais pourtant quantitatives pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines dans la cellule de levure. D&#39;ailleurs en prenant des photos à différents moments, nous pouvons suivre les événements cellulaires.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / équipements </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Lectine </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Graisse silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à balayage laser LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Autres microscope confocal pourraient être utilisés. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> N&#39;importe quel logiciel d&#39;analyse statistique pourrait être utilisé. </td></tr></tbody></table>

quantitatives de fluorescence live cell-microscopie analyse de la levure à fission

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Plusieurs techniques de microscopie sont aujourd&#39;hui disponibles qui permettent de détecter une protéine spécifique dans la cellule. Durant la dernière décennie imagerie des cellules vivantes en utilisant des fluorochromes comme la Green Fluorescent Protein (GFP) directement attaché à la protéine d&#39;intérêt est devenu plus populaire 1. En utilisant la GFP et fluorochromes similaires les localisations subcellulaires et les mouvements des protéines peuvent être détectées dans un microscope à fluorescence. Par ailleurs, outre la localisation subnucléaires d&#39;une certaine région d&#39;un chromosome peut être étudiée en utilisant cette technique. GFP est fusionnée à la protéine répresseur lac (LACR) et ectopique exprimé dans la cellule où les répétitions en tandem de la séquence lacO a été inséré dans la région d&#39;intérêt sur ​​le chromosome 2. Le LACR-GFP va se lier à des répétitions lacO et cette région du génome sera visible comme un point vert dans le microscope à fluorescence. La levure est particulièrement adapté pour ce type de manipulation depuis homologuesrecombinaison est très efficace et permet ainsi une intégration ciblée des répétitions lacO et protéines de fusion avec la GFP conçu 3. Nous décrivons ici une méthode quantitative pour l&#39;analyse de cellules vivantes de levure à fission. Des protocoles additionnels pour l&#39;analyse de cellules vivantes de levure à fission peut être trouvé, par exemple sur la façon de faire un film sur les 4 comportements chromosomique méiotique. Dans cette expérience particulière, nous nous concentrons sur l&#39;organisation subnucléaire et comment elle est affectée lors de l&#39;induction de gènes. Nous avons marqué un cluster de gènes, nommés Chr1, par l&#39;introduction de sites lacO obligatoire dans le voisinage des gènes. Le groupe de gènes est enrichie par des gènes qui sont induits par la famine au début lors de l&#39;azote de 5 levure à fission. Dans la souche de la membrane nucléaire (NM) est étiqueté par l&#39;attachement de la mCherry Cut11 protéines NM donnant lieu à un signal rouge fluorescent. Le pôle du corps de la broche (SPB) composé SID4 est fusionnée à la protéine fluorescente rouge (SID4-MRFP) 6 </sjusqu&#39;à&gt;. Dans les cellules de levure végétative croissante des centromères sont toujours attachés à la SPB qui est incorporé dans le NM 7. Le SPB est identifié comme une grande structure ronde au NM. En imagerie avant et 20 minutes après l&#39;épuisement de la source d&#39;azote, nous pouvons déterminer la distance entre le groupe de gènes (GFP) et le NM / SPB. Les distances moyennes ou médianes avant et après épuisement de l&#39;azote sont comparés et nous pouvons ainsi mesurer si oui ou non il ya un décalage dans la localisation subcellulaire de la grappe gène après épuisement de l&#39;azote.

La levure de fission,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, Est un bon modèle pour étudier les processus cellulaires de base. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l&#39;analyse quantitative des cellules vivantes de levure à fission. Dans cette expérience particulière nous nous concentrons sur l&#39;organisation du génome dans le noyau cellulaire, mais la méthode peut également être utilisé pour étudier les facteurs cytosoliques.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Plusieurs techniques de microscopie sont aujourd'hui disponibles pour détecter une protéine spécifique au sein de la cellule. Au cours de la dernière décennie, l'imagerie sur cellules vivantes utilisant...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer quantitativement l'organisation subnucleaire dans les cellules de levure et d'étudier comment elle est affectée par des changements dans les conditions de croissance ou par des mutations. Cela est réalisé en cultivant les cellules de levure en phase logarithmique dans des conditions minimisant la fluorescence autofluorescente. Ensuite, les cellules sont placées dans une chambre de croissance pour être observées au microscope.Ensuite, des images sont prises afin de mesurer la distance entre différentes structures marquées par fluorescence dans la cellule. Des résultats sont obtenus, montrant des différences dans l'organisation non nucléaire, dépendant des conditions nutritionnelles modifiées durant la croissance de la culture de levure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'épigénétique concernant les interactions entre l'organisation des sous-compartiments ou de la chromatine et la régulation des gènes.Les poissons et les levures commencent par préparer le milieu minimal d'Édimbourg, ou EMM, ainsi que de l'EMM contenant également du chlorure d'ammonium afin de réduire l'autofluorescence, au lieu de stériliser par autoclavage. Stérilisez la solution de glucose à l’aide d’un filtre de 0,2 micron et ajoutez-la aux milieux stérilisés à l’autoclave. Inoculez trois millilitres d’EMM dans des tubes de 30 millilitres avec des cellules de poissons et de levures.Fraîchement cultivées sur une boîte de Petri en milieu riche, YEA, boucher légèrement les tubes et incuber les cellules dans un agitateur à 225 tr/min et à 30 degrés Celsius. Maintenir les cellules en phase logarithmique pendant deux jours en les comptant deux fois par jour, matin et soir, à l’aide d’une chambre de Birkhauser, et en les diluant à la densité appropriée. Le jour de l’expérience.Les cellules doivent être en phase logarithmique précoce par rapport au milieu azoté. Les cellules sont soumises à la procédure décrite dans le protocole écrit afin de les recueillir en un seul culot au fond d'un tube de centrifugeuse : 1,5 millilitre de cellules dans un tube Eppendorf est centrifugé à un maximum de 1,5 RCF, en effectuant d'abord une rotation du tube pendant deux minutes, puis en le retournant de 180 degrés pour une rotation supplémentaire de deux minutes. Éliminer tout le surnageant sauf 10 à 15 microlitres et remettre les cellules en suspension dans le milieu restant, avec un aliquot de lectine filtrée stérile à une concentration de un milligramme par millilitre.Ajoutez cinq microlitres de solution de lectine dans un coin du coverslip et ajoutez cinq microlitres de culture à la goutte de lectine. Pour créer une chambre de croissance de cellules S pom base, pipetez cinq microlitres de EMM sur une lame propre et retournez le coverslip avec la culture à un angle de 70 degrés au-dessus du milieu, puis laissez-le tomber face vers le bas sur le EMM afin de sceller les bords avec de la graisse de silicone. Coupez l'extrémité large d'une pointe de 200 microlitres et fixez l'extrémité étroite à une seringue de deux millilitres.Remplissez la seringue avec environ un millilitre de graisse de silicone. Appliquez une fine ligne de silicone sur les bords du couvre-objet en poussant doucement le piston de la seringue pour imaginer la chambre de croissance. Commencez par utiliser l'imagerie en champ clair pour localiser les cellules et creuser.Obtenez une image nette pour la microscopie confocale. Nous utilisons un microscope à balayage laser Zeiss LSM 700 équipé d'un objectif à immersion huile plan apochromatique 63 fois, et d'un réglage de balayage moyen sur 16 lignes. Réglez les unités de surface à un rapport de 1 à 1,1 afin d'obtenir une coupe optique de 0,8 micromètre.Balayez les cellules avec des lasers qui détectent l’Alexa 488 et le mCherry ou la GFP. Enregistrez suffisamment d’images pour effectuer des mesures sur 60 cellules pour chaque condition. Passez à une nouvelle chambre de croissance contenant des cellules fraîches.Après 60 minutes d'acquisition d'images, ouvrez une image dans le programme Zeen Light Edition pour mesurer la distance entre les signaux de différents fluorophores dans le même plan focal. Ouvrez l'outil de mesures et ajustez l'intensité lumineuse et le contraste afin d'identifier le centre de chaque signal fluorescent, par exemple le corps polaire du fuseau et la membrane nucléaire, puis mesurez la distance qui les sépare. Transférez les données vers une feuille de bloc-notes.Comparez les distances sous-cellulaires moyennes ou médianes entre différentes souches et traitements à l'aide de logiciels ou de tests statistiques tels que le test T ou le test de somme des rangs de Mann-Whitney. Dans cet exemple, la souche PJ 1 18 5 a été cultivée dans du milieu EMM et un échantillon a été placé dans une chambre de croissance pour l'imagerie. Ensuite, un aliquot de PJ 1 18 5.La culture a été transférée dans du milieu EMMN et incubée pendant 15 minutes avant qu'un échantillon ne soit placé dans une chambre de croissance pour l'imagerie. L'outil de mesure a été utilisé pour mesurer la distance entre le locus et le corps du pôle du fuseau, ainsi que la distance entre le locus et la membrane nucléaire. Comme illustré ici, une différence statistiquement significative a été observée concernant la distance parcourue par l'amas de gènes s'éloignant de la membrane nucléaire en direction du corps du pôle du fuseau dans les cellules privées d'azote, par rapport aux cellules cultivées en présence d'azote.Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP présentaient une distribution normale, et par conséquent, les distances moyennes ont pu être comparées à l'aide d'un test T. Il existait une différence significative entre les deux valeurs moyennes. Les données mesurant la distance entre la GFP et le NM ne présentaient pas une distribution normale, et par conséquent, les distances médianes ont été comparées à l'aide d'un test de rangs de Mann-Whitney.Il existait une différence significative entre les deux valeurs médianes suite à cette procédure. D'autres méthodes, comme la PCR en temps réel, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la manière dont le niveau d'expression génique corrèle avec les changements dans l'organisation subnucleaire.

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