Name: Les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez trois protocoles complémentaires d'analyses de croissance pour évaluer la toxicité des protéines polyglutamine dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces méthodes quantitatives permettent d'étudier les mécanismes de toxicité des protéines mal repliées.

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Le travail dans le laboratoire Duennwald est pris en charge par des subventions de la Fédération américaine pour recherche sur le vieillissement (AFAR), la Fondation des maladies héréditaires (HDF) et la Fondation William Wood.

1. Expression des toxiques polyQ-expansion protéines chez la levure Une analyse systématique a mis en place la séquence d'acides précise aminés d'une protéine polyQ-expansion qui est nécessaire pour produire une toxicité chez la levure 7. Ce toxique polyQ-dilatation protéine contient un groupe amino-terminal de FLAG-tag suivie par 17 acides aminés de la séquence originale de la protéine huntingtine, une région polyQ, et une fusion carboxy-terminale à une protéine fluorescente (GFP ou l'autre ou PCP, voir figure 1a). L'expression de protéines avec des expansions polyQ de 46 glutamines ou plus (par exemple 72 et 103 glutamines) produit une toxicité chez la levure lorsqu'il est exprimé sous le contrôle de l'inductible et solide par rapport promoteur GAL1 7, 9. Comme décrit précédemment, la toxicité polyQ dans la levure n'est qu'apparente dans les cellules qui transportent l'Rnq1p protéine dans sa conformation prion, [RNQ +], par exemple, la souche de levure W303 9. Le r protéine toxique polyQ-expansionecapitulates aspects centraux de la polyQ-biologie dans la levure, telles que polyQ dépendant de la longueur de toxicité (voir ci-dessous) et d'agrégation (Figure 1 b). Notamment, toxiques polyQ-expansion protéines ne tuent pas les cellules de levure immédiatement; ils sont plutôt nuire ou d'arrêter le cycle cellulaire et devision cellule, ce qui ralentit ou inhiber la croissance de colonies de levures sur des plaques ou des cultures liquides (nos données non publiées). 2. Problèmes potentiels avec cellules de levure exprimant toxiques polyQ-expansion protéines Les cellules de levure exprimant les protéines toxiques d'expansion polyQ contraire ne peut pas montrer tout défaut une croissance de 9. La nature génétique de ces suppresseurs de polyQ-toxicité ne semble pas être fondée sur de simples mutations mendéliennes et ne peut donc se produire avec une fréquence relativement élevée (nos résultats non publiés). Nous pensons que ces suppresseurs spontanés sont causées par le durcissement des prions non identifiés qui fonctionnent de façon similaire à [RNQ +] pour déterminer toxicity.Thes polyQe suppresseurs spontanés de toxicité polyQ peut mettre en péril la réussite de toute expérience qui vise à caractériser la toxicité polyQ ou pour identifier et caractériser des modificateurs de la toxicité polyQ. Afin d'éviter l'apparition fréquente de ces suppresseurs spontanés, suivez les mesures de précaution décrites ci-dessous, qui se sont avérées très efficaces: <ol><li> Utiliser des cellules de levure fraîche pour des expériences de toxicité. Ne pas stocker la levure pendant de longues périodes de temps. Foire de récupérer des colonies de levures fraîches en provenance de stocks congelés. </li><li> Surveiller fréquemment l'expression et l'agrégation des toxiques polyQ-expansion protéines par microscopie à fluorescence. </li><li> Gardez les cellules de levure dans les médias qui répriment l'expression de la toxicité toxique polyQ en tout temps (c.-à-dans des milieux sélectifs contenant du glucose comme seule source de carbone) avant de commencer toute mesures de toxicité. </li><li> Utilisez au moins trois transformants indépendants pour chaque expérience polyQ-toxicité. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Les analyses de croissance <ol><li> Pour chaque condition expérimentale, ensemencer une colonie de chaque de trois transformants indépendants de cellules de levure hébergeant le toxique polyQ-expansion protéines dans 3 ml de levure médias sélectifs avec du glucose comme seule source de carbone. </li><li> Incuber ces cultures la nuit à 30 ° C. Dans ces conditions, les cellules ne sont pas l'expression de la protéine de polyQ-expansion parce que le glucose dans le milieu réprime leur expression. Ne laissez pas envahir ces cultures; garder la DO 600 (absorbance de la lumière de longueur d'onde de 600 nm) des cultures de la nuit en dessous de 1. </li><li> Nous utilisons régulièrement trois dosages différents pour surveiller les défauts de croissance de cellules de levure exprimant la toxicité polyQ-expansion protéines: </li></ol> 3.1 Croissance sur des plaques <ol><li> Diluer les cultures de levure nuit (cultivé avec 220 secousses tpm) pour une DO 600 de 0,0005 (soit une dilution 1:1000 d'une DO600 = 0,5) la culture dans sélective moidia 7 contenant du glucose. </li><li> Répartir uniformément 50 pi (résultant dans le CA. 700 colonies par plaque) de chaque culture diluée sur une plaque (10 cm de diamètre) avec un milieu sélectif contenant du glucose comme seule source de carbone et une plaque avec un milieu sélectif contenant du galactose comme seule source de carbone. </li><li> Incuber les boîtes pendant trois à quatre jours à 30 ° C. Après l'incubation, de prendre des photos de chaque plaque et compter le nombre de colonies sur le glucose et le nombre de colonies sur les plaques de galactose. Dans des conditions idéales, il devrait y avoir aucun ou seulement très peu de colonies sur la plaque de galactose lors de l'utilisation des cellules de levure exprimant une très toxique polyQ-expansion protéines (103 octodecies, figure 2a). </li></ol> 3.2 dosages Spotting Ce test est plus quantitative que le dosage de placage décrite ci-dessus et peut donc révéler même des différences subtiles dans la toxicité polyQ avec la même expérience sur la même plaque. <ol><li> Diluer le overnuit cultures cultivées dans un milieu avec du glucose pour une DO 600 de 0,1. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul de ces cultures stériles dilués dans des plaques 96 puits et de préparer cinq dilutions quintuplé en série dans l'eau stérile à l'aide d'une pipette multi-canaux. </li><li> L'utilisation d'un Frogger, (aussi appelé un observateur, avec 8 x 6 broches pour le transfert de cellules en suspension) transférer les suspensions cellulaires sur des plaques contenant des milieux sélectifs avec du glucose comme seule source de carbone et des plaques contenant des milieux sélectifs avec du galactose comme seule source de carbone. </li><li> Laisser les plaques sécher avant de les incuber à 30 ° C pendant trois à quatre jours. </li><li> Après l'incubation, de prendre des photos de chaque plaque (Figure 2b). </li></ol> 3,3. Surveillance de la toxicité polyQ dans la levure par la croissance des cultures en milieu liquide Ce protocole est le plus quantitative (DO600 numéros) des trois essais décrits ici et peut même détecter des différences très subtiles de la toxicité des polyQ. Le précitée ocCurrence de suppresseurs spontanés, cependant, peut potentiellement produire des résultats trompeurs. Je recommande donc cet essai combinant avec au moins un des deux essais de placage décrits ci-dessus. Nous proposons d'utiliser l'instrument BioscreenC pour ces expériences. Le BioscreenC est un instrument qui mesure automatiquement la densité optique des cultures de levures dans 100 des plaques tout en incubés à des températures définies avec l'agitation défini. D'autres méthodes pour cultiver des cellules de levure et de mesurer leur densité optique peuvent également s'appliquer. <ol><li> Laver les cellules de levure à partir de supports minimaux contenant du glucose comme seule source de carbone trois fois dans 3 ml d'eau stérile. </li><li> Diluer les cultures de la nuit cultivées dans un milieu avec du galactose à une DO 600 de 0,1. </li><li> Remplir chaque puits de la plaque 100-bien BioscreenC avec 300 pl des cultures de levures. </li><li> Ouvrez le programme Expérience facile Bioscreen. Déterminer le nombre d'échantillons que vous souhaitez surveiller (y compris les ébauches et les moyennes seulementcontrôles), régler la température à 30 ° C, régler la longueur des expériences pour 3 jours, de définir les intervalles de mesure à 15 minutes, régler le filtre à 600 nm / Brown, et définir le mode d'agitation pour 15 secondes avant chaque mesure à force moyenne. </li><li> L'instrument BioscreenC et le logiciel ci-joint sera de produire des feuilles de calcul Excel chaque point de données prises pendant l'expérience. </li><li> Préparer les courbes de croissance avec Excel pour chaque échantillon et comparer la croissance des différents échantillons (figure 2c). Une description détaillée de l'analyse des données produites par les expériences BioscreenC a été fourni avant le 10. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Le modèle de la levure polyQ. a) Représentation schématique de la toxicité polyQ-expansion protéines. b) La microscopie à fluorescence montrant des cellules de levure exprimant un court, non-toxique polyQcellules de protéines d'expansion (25Q, panneau de gauche) et de levure exprimant un long, toxique polyQ-expansion protéines (103 octodecies, panneau de droite). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les résultats représentatifs de tests de croissance de cellules de levure exprimant polyQ-expansion protéines. a) test de placage. Environ 700 cellules de levure ont été étalés sur des plaques et incubées pendant trois jours à 30 ° C. Le panneau supérieur présente une plaque contenant milieu glucose, soit l'expression de la toxicité polyQ-dilatation protéine (103 octodecies) n'est pas induite. Le panneau inférieur présente une plaque de support de levure contenant du galactose, à savoir l'expression de la toxicité polyQ-dilatation protéine est induite. Notez que dans l'expérience décrite ici, pas de suppresseur spontanée a eu lieu. B) Repérer dosage. Cinq série de cinq dilutions de cellules de levure héberger soit un non-protéine toxique polyQ (25Q) ou une substance toxique polyQ-expansion protein (103 octodecies) ont été repérés sur des plaques de glucose qui répriment l'expression des protéines (panneau de gauche) ou sur des plaques de galactose qui induisent leur expression. Les plaques ont ensuite été incubées pendant trois jours à 30 ° C. c) expérience BioscreenC. La croissance des cultures de cellules de levure exprimant soit un non-protéine toxique polyQ (25Q) ou une substance toxique polyQ-expansion protéines (103 octodecies) ont été suivis par le instrument BioscreenC. Les conditions expérimentales et l'analyse des expériences BioscreenC sont décrits dans le texte principal.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce manuscrit présente trois approches expérimentales complémentaires pour mesurer la toxicité polyQ-dans la levure organisme modèle fondé sur une croissance réduite des cellules de levure exprimant toxiques polyQ-expansion protéines. Travail dans la levure a offert un aperçu de profondes dans les mécanismes de base cellulaires et moléculaires de repliement des protéines et de sa toxicité qui a suivi, y compris le mauvais repliement et la toxicité des polyQ-expansion protéines 9,11,12. Des expériences basées s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;instrument </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 broches) </td><td> V &amp; P scientifique, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves États-Unis </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100 puits ont en nid d&#39;abeille </td><td> Growthcurves États-Unis </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Mauvais repliement des protéines est associée à de nombreuses maladies humaines, en particulier les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington 1. La maladie de Huntington (HD) est provoquée par l&#39;expansion de polyglutamine anormale d&#39;un (polyQ) dans la région la protéine huntingtine. La protéine huntingtine polyQ-expansé atteint une conformation aberrante (c&#39;est à dire qu&#39;il misfolds) et entraîne une toxicité cellulaire 2. Au moins huit autres maladies neurodégénératives sont causées par des polyQ-extensions, y compris le spinocérébelleuse Ataxies et la maladie de Kennedy 3. La levure organisme modèle a facilité des informations importantes sur la base cellulaire et moléculaire de la polyQ-toxicité, y compris l&#39;impact des facteurs intra-et inter-moléculaire de polyQ-toxicité, et l&#39;identification des mécanismes cellulaires qui sont déficients dans les cellules exprimant l&#39;expansion polyQ- protéines 3-8. Importantment, de nombreux aspects de polyQ-toxicité qui ont été trouvés dans la levure ont été reproduites dans d&#39;autres systèmes expérimentaux et dans une certaine mesure dans des échantillons provenant de patients HD, démontrant ainsi l&#39;importance du modèle de la levure pour la découverte des mécanismes de base qui sous-tendent polyQ-toxicité. Une manière directe et relativement simple de déterminer la toxicité polyQ-dans la levure est de mesurer les défauts de croissance de cellules de levure exprimant polyQ-expansion protéines. Ce manuscrit décrit trois approches expérimentales complémentaires pour déterminer la toxicité polyQ-dans la levure par la mesure de la croissance des cellules de levure exprimant polyQ-expansion protéines. Les deux premières approches expérimentales de surveiller la croissance des levures sur les assiettes, la troisième approche surveille la croissance des cultures de levures liquides en utilisant l&#39;instrument BioscreenC. En outre, ce manuscrit décrit les difficultés expérimentales qui peuvent survenir lors de la manipulation des modèles polyQ levure et décrit les stratégies qui vous aideront à éviter ou àminimiser ces difficultés. Les protocoles décrits ici peuvent être utilisées pour identifier et à caractériser les voies génétiques et des petites molécules qui modulent polyQ-toxicité. En outre, les tests décrits peuvent servir de modèles pour des analyses précises de la toxicité causée par d&#39;autres maladies associées à des protéines mal repliées dans les modèles de levure.

Ce manuscrit décrit trois protocoles complémentaires pour évaluer la toxicité de polyglutamine (polyQ)-extension protéines dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Ces protocoles peuvent être facilement modifié pour contrôler la toxicité d&#39;autres protéines mal repliées dans la levure.

Les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure

Le repliement incorrect des protéines est associé à de nombreuses maladies humaines, en particulier aux maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser la levure comme plateforme expérimentale pour évaluer et analyser la toxicité associée aux polyglutamines. Expansion des protéines après la croissance de levures dans des conditions réprimant l'expression des polyglutamines. Trois tests de croissance complémentaires de cellules de levure exprimant une protéine d'expansion toxique de polyglutamine sont réalisés afin d'évaluer de manière fiable la toxicité lors du premier test de croissance présenté.Ici, la toxicité des polyglutamines est surveillée au moyen d'un test de culture sur boîte. En tant que second test de croissance complémentaire, un test de pointage est utilisé pour détecter même les différences subtiles dans la croissance cellulaire. L'approche la plus quantitative est illustrée dans le troisième test, où les cellules de levure sont cultivées en culture liquide et la toxicité est suivie par l'observation de la densité optique à 600 nanomètres, permettant finalement d'obtenir des résultats reproductibles et quantitatifs.Ce document étudie la toxicité des polyglutamines dans les cellules de levure par un examen minutieux de leur croissance sur des boîtes de culture et en milieux liquides. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant les mécanismes des troubles liés au mauvais repliement des protéines, notamment en élucidant les bases génétiques et cellulaires de la toxicité associée aux protéines mal repliées, y compris les protéines polyglutamine. Une analyse systématique a permis d'établir la séquence exacte d'acides aminés d'une protéine à expansion poly Q nécessaire pour induire une toxicité chez la levure.Cette protéine toxique à expansion poly Q contient une étiquette flag au niveau du terminus aminé, suivie de 17 acides aminés provenant de la séquence originale de la protéine huntingtine, d'une région poly Q et d'une fusion au niveau du terminus carboxy à une protéine fluorescente. Les cellules de levure exprimant ces protéines à expansion poly Q, autrement toxiques, peuvent ne présenter aucun défaut de croissance en raison de l'apparition de suppresseurs spontanés de la toxicité poly Q, ce qui peut compromettre le succès de toute expérience visant à caractériser la toxicité poly Q ou ses modificateurs. Afin d'éviter l'apparition fréquente de ces suppresseurs spontanés, veillez à prendre des mesures préventives, notamment l'utilisation de cellules de levure fraîches pour les expériences de toxicité. Évitez de conserver la levure pendant de longues périodes et récupérez fréquemment de nouvelles colonies de levure à partir de stocks congelés.Surveillez régulièrement l'expression et l'agrégation des protéines toxiques à expansion poly Q par microscopie fluorescente. Maintenez les cellules de levure dans un milieu qui réprime l'expression des protéines toxiques en tout temps. Avant de commencer toute mesure de toxicité.En guise de mesure préventive finale, utilisez plusieurs transformants indépendants pour chaque expérience. Pour commencer, les tests de croissance décrits dans ce protocole permettent d'obtenir des cellules de levure codant pour l'expression des protéines à expansion poly Q en utilisant trois millilitres de milieu de levure sélectif contenant du glucose comme seule source de carbone. Inoculez trois cultures à partir de trois transformants indépendants et incubez les cultures toute la nuit à 30 degrés Celsius.Dans ces conditions, les cellules n'expriment pas la protéine avec expansion poly Q en raison de la répression par le glucose. Évitez que les cultures de nuit ne surcroissent en maintenant la densité optique à 600 nanomètres en dessous de un afin de surveiller les défauts par la croissance sur boîtes. Premièrement, effectuez une dilution au 1/1000 d'une culture de levure de nuit ayant une DO 600 de 0,5 à l'aide de milieu sélectif contenant du glucose, puis répartissez uniformément 50 microlitres de chaque culture diluée sur une boîte contenant un milieu sélectif avec du glucose comme seule source de carbone, afin d'obtenir environ 700 colonies par boîte pour chaque culture diluée.Plaquez également sur un milieu sélectif contenant du galactose. En tant que seule source de carbone, incubez les boîtes pendant trois à quatre jours à 30 degrés Celsius après l'incubation. Prenez une photographie de chaque boîte et comptez le nombre de colonies sur les boîtes contenant du glucose et du galactose.Dans des conditions idéales, il devrait y avoir aucune ou très peu de colonies sur la plaque contenant du galactose lorsqu'on utilise des cellules de levure exprimant une protéine hautement toxique avec une expansion poly Q. Le test de dépôt est plus quantitatif que le test de culture en milieu solide et peut donc révéler même de légères différences de toxicité de la séquence poly Q. Au sein d'une même expérience et sur la même plaque, pour commencer les tests de dépôt dans un milieu contenant du glucose, diluez les cultures nocturnes ayant atteint une DO 600 de 0,1 en pipetant 200 microlitres de chaque culture diluée dans des plaques stériles de 96 puits, puis préparez cinq dilutions sérielles quintuplées dans de l'eau stérile à l'aide d'une pipette multicanal et d'un répartiteur automatique (frogger transfer).Les suspensions cellulaires sont étalées sur des plaques contenant un milieu sélectif dont le glucose est la seule source de carbone. En outre, transférez les cellules sur des plaques contenant un milieu sélectif dont le galactose est la seule source de carbone, laissez sécher les plaques, puis incubez-les à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre jours avant de prendre une photographie de chaque plaque. Le test de croissance en milieu liquide est le plus quantitatif des trois tests décrits ici pour surveiller la toxicité des poly Q chez la levure.Le Bio Screen C est un appareil qui mesure automatiquement la densité optique de cultures de levures dans des plaques de 100 puits, incubées à des températures définies et avec une agitation contrôlée. D'autres méthodes de culture des cellules de levure et de mesure de leur densité optique peuvent également être utilisées pour commencer à concentrer les cellules de levure cultivées toute une nuit dans un milieu minimal contenant le glucose comme seule source de carbone. Après centrifugation, laver les cellules avec trois millilitres d'eau stérile.Répétez le lavage deux fois, en centrifugeant les cellules entre chaque lavage à l’aide du milieu contenant du galactose. Diluez les cellules lavées jusqu’à une DO 600 de 0,1. Ensuite, remplissez chaque puits de la plaque BioScreen C à 100 puits avec 300 microlitres des cultures de levures diluées et insérez la plaque dans l’appareil.Ouvrez le programme d'expérience easy bio screen. Déterminez le nombre d'échantillons à surveiller. Réglez la température à 30 degrés Celsius.Fixer la durée des expériences à trois jours et régler les intervalles de mesure à 15 minutes. Régler également le filtre sur 600 nanomètres brun et le mode d'agitation sur 15 secondes avant chaque mesure, à intensité moyenne. Après avoir défini les paramètres, commencer l'expérience.L'écran bio, l'instrument et le logiciel associé produisent des feuilles de calcul Excel contenant chaque point de données enregistré pendant l'expérience. À l'aide d'Excel, des courbes de croissance peuvent être établies pour chaque échantillon, et la croissance de différents échantillons peut être comparée. Les résultats présentés ici proviennent du test de dénombrement sur boîte.Environ 700 cellules de levure ont été étalées sur des boîtes de Pétri et incubées pendant trois jours à 30 degrés Celsius sur la boîte contenant le milieu au glucose. L'expression de la protéine toxique à expansion poly Q n'est pas induite. En revanche, lorsque les cellules de levure ont été ensemencées sur un milieu au galactose, l'expression de la protéine toxique à expansion poly Q est induite.Remarquez que dans l'expérience présentée ici, aucune suppression spontanée n'a eu lieu. De même, dans le test de dépôt, l'expression de la protéine toxique à expansion Poly Q est observée sur le galactose et non sur le glucose. Milieu cinq, dilution sérielle quintuple de cellules de levure contenant soit une protéine Poly Q non toxique, soit une protéine à expansion Poly Q toxique, déposées sur des boîtes contenant du glucose, qui répriment l'expression des protéines, ou sur des boîtes contenant du galactose, qui induisent leur expression, dans l'expérience bio screen C.La croissance de cultures cellulaires de levures exprimant soit une protéine poly Q non toxique, soit une protéine d'expansion poly Q toxique a été suivie à l'aide de l'instrument Bio Screen C, comme décrit dans cette vidéo. L'effet de l'expression de la protéine d'expansion poly Q toxique sur la croissance cellulaire est évident ici. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller la toxicité des protéines polyglutamine chez la levure. Le test de croissance en milieu liquide est le plus quantitatif des trois tests, car il peut même détecter des différences subtiles de toxicité des polyglutamines.Mais veuillez vous rappeler de le combiner avec au moins l'un des deux tests de culture pour éviter les problèmes liés aux suppressions spontanées de la toxicité des polyglutamines.

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Nous décrivons ici un écran surexpression plasmide...

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour évaluer l’effet neuroprotecteur d’un composé testé, l’astragalane, sur la survie neuronale chez Caenorhabditis elegans à partir de la neurotoxicité médiée par polyQ. Le test utilise Caenorhabditis elegans exprimant les répétitions polyQ anormalement expansées fusionnées à la GFP dans leurs neurones ASH pour mesurer la survie neuronale après le traitement par composé testé.

Un essai pour étudier l’effet d’un composé testé contre la neurotoxicité médiée par PolyQ chez les vers

Les modèles de protéinopathie de levure sont des outils précieux pour évaluer la toxicité et l’agrégation des protéines impliquées dans la maladie. Nous présentons ici des méthodes de criblage des banques de variants de Hsp104 pour les suppresseurs de toxicité. Ce protocole pourrait être adapté pour dépister n’importe quelle bibliothèque de protéines à la recherche de suppresseurs de toxicité de toute protéine toxique chez la levure.

Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Cet article décrit un test basé sur la croissance de levure pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Il fait également la démonstration d’une méthode d’extraction rapide des protéines de levure, adaptée au western blot pour confirmer biochimiquement les exigences de dégradation. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d’une variété de protéines.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ce protocole décrit une méthode de haut-débit pour dépister fonctionnellement héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae.

Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

Présenté ici sont quatre protocoles pour construire et exploiter la levure Saccharomyces cerevisiae reporter souches pour étudier le potentiel humain de transactivation P53, les impacts de ses diverses mutations associées au cancer, co-exprimé protéines d'interaction, et les effets de petites molécules spécifiques.

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

Les agents pathogènes bactériens sécrètent des protéines dans l'hôte qui ciblent des processus biologiques cruciaux. L'identification des voies d'accueil ciblées par les protéines effecteurs bactériens est essentielle pour lutter contre la pathogénie moléculaire. Ici, une méthode utilisant un suppresseur modifié de levure et un écran de toxicité pour élucider des voies d'hôte visées par les protéines bactériennes toxiques d'effecteur est décrite.

Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer les activités neuroprotectrices des composés de test chez Caenorhabditis elegans, y compris l’agrégation de polyglutamines, la mort neuronale et le comportement de chimioavoidance, ainsi qu’une intégration exemplaire de plusieurs phénotypes.

Caenorhabditis elegans comme système modèle pour la découverte de composés bioactifs contre la neurotoxicité médiée par les polyglutamines

Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.

Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Découvrez trois protocoles complémentaires d'analyses de croissance pour évaluer la toxicité des protéines polyglutamine dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces méthodes quantitatives permettent d'étudier les mécanismes de toxicité des protéines mal repliées.

Les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure

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