Name: Détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus Maedi-visna qui exprime Green Fluorescent Protein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez la propagation d'un clone infectieux du virus Maedi-visna exprimant la GFP dans des cellules de plexus choroïde de mouton. Cette méthode permet de visualiser la réplication virale par microscopie à fluorescence et cytométrie en flux.

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Ce travail a été financé par le Fonds de recherche en islandais et l&#39;Université d&#39;Islande Fonds pour la recherche.

1. La transfection Le clone moléculaire est contenue dans deux plasmides, p8XSp5-EGFP et p67r, de 12 kb et 4,5 kb, respectivement 9,10. <ol><li> Couper des quantités équimolaires de deux plasmides, soit 4,4 mg d'p8XSp5-EGFP et 1,6 mg d'p67r par XbaI et ligaturer avant la transfection. </li><li> Pour la ligature, utilisez une unité de Weiss de ligase dans une réaction de 50 ul et incuber à 16 ° C pendant la nuit. </li><li> Lorsque la ligature est terminée, incuber le mélange de ligature à 65 ° C pendant 15 min pour l'inactivation de la ligase. Cette étape peut être omise. </li><li> Deux jours avant la transfection, les graines de 10 6 cellules SCP dans un flacon de culture de tissu T25, et cultiver des cellules pour deux jours dans 5 ml de DMEM + 10% de sérum d'agneau et la glutamine 2 mM, sans antibiotiques pour une monocouche de 90% de confluence. Si les cellules n'ont pas atteint 90% de confluence, après deux jours, laissez les cellules à croître, une journée supplémentaire. </li></ol> Remarque: Le sérum d'agneau peut être remplacé par du sérum de veau fœtal (FBS). Nous utilisons régulièrement l'agneau du sérum, car certaines souches de MVV sont inhibées par FBS; cette souche MVV n'est pas inhibée par FBS, cependant. <ol start="5"><li> Lorsque les cellules sont prêtes pour la transfection, le changement moyen du DMEM avec du sérum de 1% (sérum ou d'agneau FBS) sans antibiotiques. Nous utilisons Lipofectamin 2000 (Invitrogen) pour la transfection. </li><li> Diluer l'ADN dans 500μl milieu Opti-MEM. </li><li> Diluer 20 pi Lipofectamin 2000 dans 500μl milieu Opti-MEM et laisser à température ambiante (TA) pendant 5 min. </li><li> Après l'incubation de 5 min, mélanger l'ADN dilué avec Lipofectamine diluée 2000 (volume total = 1000 pl). Mélanger doucement et incuber pendant 20-30 min à température ambiante. </li><li> Ajouter le mélange de transfection (1 ml) à la fiole contenant des cellules T25 SCP et moyennes entreprises (5 ml). Mélanger en berçant doucement. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 durant la nuit (18 - 24 h). </li><li> Changer moyennes le jour suivant pour DMEM avec du sérum de 1%, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU 100IU. </li><li> Surveiller la production de la GFP dans les cellules par microscopie fluorescente SCP inversé. Faible efficacité de la transfection peut s'attendre avec ces cellules primaires, généralement de 5 - 15%. </li><li> Incuber encore à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant plusieurs jours afin de permettre la propagation du virus dans le ballon. Il prend habituellement 7-14 jours pour une infection complet. </li><li> Récolte du virus par aliquotage le surnageant dans des tubes Eppendorf. Spin dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant contenant le virus à de nouveaux tubes. Conserver à -80 ° C. </li></ol> 2. Titrage du virus <ol><li> Graine 3x10 4 cellules SCP dans 100 pl de milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml, par puits dans une plaque à 96 puits. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Si les cellules sont confluentes le lendemain, changement de milieu de DMEM avec 1% de sérum, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml, 100 ul de chaque puits. </li><li> Diluer le virus de la façon suivante: <ol><li> Ajouter 180 pl de DMEM avec du sérum de 1%, 2 mM de glutamine, pénicilline et streptomycine 100IU/ml 100IU/ml par puits à 4 x 10 puits dans un fond de 96 puits rond ou V-bottom assiette. </li><li> Pour des dilutions en série décuplé en quatre exemplaires, ajouter 20 ul de virus à chaque 4wells dans la première colonne de la plaque, et en utilisant une pipette à quatre canaux, pipette haut et bas pour s'assurer que les échantillons soient bien mélangés. Changement des embouts de pipette et transférer 20 ul de la 4 prochaines puits et ainsi de suite. Laissez les derniers puits sans virus pour un contrôle négatif. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ml de la dilution du virus aux cellules SCP et moyennes entreprises. </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. Observer la fluorescence de la GFP et les effets cytopathiques pendant deux semaines. Effets cytopathiques sont constitués de cellules deviennent arrondies et moins transparents que les cellules normales avec les processus qui s'étend, en terminant par les cellules apparaissant multinucléaire et la mort cellulaire. </li><li> Calculer le virus de titre (DICT50) en utilisant la méthode de Reed Muench 11. </li></ol> 3. Analyse FACS des cellules infectées Note: Pour le suivi rapide de la réplication du virus, les cellules infectées peuvent être examinés par cytométrie en flux. <ol><li> Trypsiniser cellules infectées (environ 10 5), laver avec du PBS 1x et de remettre en suspension dans 500μl de PBS. </li><li> Ajouter 500 ul solution de paraformaldéhyde à 4% (2% en concentration finale), incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Pellet cellules dans une microcentrifugeuse à 3000 rpm pendant 5 min. </li><li> Laver avec du PBS 2x5 min et d'analyser sur un analyseur FACScan. Comptez 10 000 événements. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Ce virus devrait être pleinement infectieuses et de répliquer à un titre de 10 juin à 10 juillet DICT 50 / ml. Les cellules infectées sont fluorescentes et peuvent être détecté par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. Typiquement, la GFP peut être détecté dans plus de 60% des cellules dans les cultures de cellules infectées en utilisant la cytométrie de flux (Fig. 1). De même, lorsque visualisé par microscopie à fluorescence, la majorité des cellules sont fluorescentes (figure 2A et B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Analyse FACScan de cellules infectées par le SCP KV1772-EGFP virus après 7 jours d'infection. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Microscopie à contraste de phase de cellules infectées par le SCP KV1772-EGFP après 7 jours d'incubation (A). Mêmes cellules visualisées par microscopie à fluorescence (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La GFP exprimer clone moléculaire de MVV présentés ici devraient être utiles pour analyser les interactions de la cellule hôte et la pathogénicité du MVV fois in vitro et in vivo. Le virus obtenu après 7-14 jours de la réplication a incontestablement acquis une certaine mutations dues à l&#39;imprécision de la transcriptase inverse. Cependant, il ya des limites à l&#39;utilisation de ce clone comme un vecteur seul cycle. La première est que l&#39;utilisation du clone est restreinte aux cellules de moutons et de chèvres ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus maedi-visna qui exprime green fluorescent protein

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna (MVV) est un lentivirus de moutons, provoquant lentement progressive pneumonie interstitielle et d&#39;encéphalite 1. Les cellules cibles primaires du MVV in vivo sont considérés comme des 2 lignée des monocytes. Certaines souches de MVV peuvent se reproduire dans d&#39;autres types cellulaires, toutefois 3,4. La protéine fluorescente verte est un marqueur couramment utilisé pour étudier les lentivirus dans des cellules vivantes. Nous avons inséré le gène EGFP dans le gène codant pour dUTPase du MVV. Le gène dUTPase est bien conservée dans la plupart des souches de lentivirus des ovins et caprins et a été montré pour être important dans la réplication du CAEV 5. Toutefois, dUTPase a été montré pour être dispensable pour la réplication du clone moléculaire de MVV utilisées dans cette étude in vitro et in vivo 6. Réplication MVV est strictement limitée aux cellules de mouton ou de chèvre d&#39;origine. Nous utilisons une lignée de cellules primaires de la choroïde de mouton du plexus (cellules SCP) pour la transfection et la propagation du virus 7. La MVV fluorescente est entièrement infectieuses et expression de l&#39;EGFP est stable pendant au moins six passages 8. Il ya une bonne corrélation entre les mesures de DICT 50 et EGFP. Ce virus devrait donc être utile pour la détection rapide des cellules infectées dans les études du tropisme cellulaire et la pathogénicité in vitro et in vivo 8.

Nous décrivons un clone moléculaire du maedi-visna qui exprime la GFP et est entièrement infectieuses. La réplication de ce virus peut être détecté en utilisant la microscopie par fluorescence et la cytométrie de flux.

Détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus Maedi-visna qui exprime Green Fluorescent Protein

Le virus du maedi-visna (MVV) est un lentivirus des ovins, responsable d'une pneumonie interstitielle et d'une encéphalite à progression lente1. Les principales cellules cibles du MVV dans...

L'objectif général de cette procédure est de propager et de détecter un clone infectieux de Mildy par rapport à l'absence de virus, exprimant une protéine fluorescente verte. Cette protéine fluorescente verte a été clonée dans le gène de la capside pour D utp Ace dans le génome du virus Myy Ner.Le clone infectieux est contenu dans deux plasmides. Premièrement, les deux plasmides portant les séquences myy Ner sont coupés avec l'enzyme de restriction xpa un et ligaturés. Deuxièmement, des cellules de plexus choroïde de mouton sont transfectées avec la construction.Enfin, les cellules infectées par le virus myy vino sont détectées par microscopie fluorescente et cytométrie en flux. Bonjour, je suis Stefano Neron de l'Institut TER de pathologie expérimentale de l'Université d'Islande. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de propager et de détecter un clone moléculaire infectieux du virus my vasculaire qui exprime une protéine fluorescente verte.Le clone moléculaire est contenu dans les plasmides P huit XSP cinq EGFP et P soixante-sept ou de 12 kilobases et 4,5 kilobases respectivement. Couper des quantités équimolaires des deux plasmides, à savoir 4,4 microgrammes de P huit XSP cinq EGFP et 1,6 microgramme de P soixante-sept ou avec XPA un et ligaturer avant la transfection. Une fois la ligature terminée, incuber le mélange de ligature à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Deux jours avant la transfection, semer 10 puissance six cellules SCP dans un flacon de culture tissulaire T 25 et faire croître les cellules pendant deux jours dans 5 millilitres de DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau et de 2 millimolaire de glutamine, sans antibiotiques, jusqu’à une confluence de 90 % en monocouche.Si les cellules n'ont pas atteint 90 %CO après deux jours, laissez les cellules croître un jour supplémentaire. Le sérum de mouton peut être remplacé par du sérum de veau fœtal FBS. Nous utilisons couramment le sérum de mouton car certains souches de MVV sont inhibées par le FBS.Cette souche de MVV, cependant, n'est pas inhibée par le SFB. Lorsque les cellules sont prêtes pour la transfection, changer le milieu pour du DMEM contenant 1 % de sérum de veau ou de SFB, sans antibiotiques. Nous utilisons du Lipofectamine 2000 pour la transfection : diluer l'ADN dans 500 microlitres de milieu opti MEM, diluer 20 microlitres de Lipofectamine 2000 dans 500 microlitres de milieu opti MEM, puis laisser à température ambiante pendant cinq minutes.Après une incubation de cinq minutes, mélangez l'ADN dilué avec le lipofectamine 2000 pour un volume total de 1000 microlitres. Mélangez délicatement et incubez de 22 à 30 minutes. À température ambiante, ajoutez le mélange de transfection au flacon T 25 contenant les cellules SCP et le milieu, en mélangeant par des mouvements de bascule doux.Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, changer le milieu par du DMEM contenant 1 % de sérum, deux millimolaire de glutamine, 100 UI par millilitre de pénicilline et 100 UI par millilitre de streptomycine. Surveiller la production de GFP et des cellules SCP par microscopie fluorescente inversée.Une faible efficacité de transfection peut être attendue avec ces cellules primaires, généralement entre cinq et quinze pour cent. Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant plusieurs jours afin de permettre la propagation du virus dans la fiole. Il faut généralement entre sept et quatorze jours pour obtenir une infection complète. Récolter le virus par Ali, en transférant le surnageant dans des tubes einor.Faire centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3000 tr/min pendant cinq minutes afin d'éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant contenant le virus dans de nouveaux tubes.Conserver à moins 80 degrés Celsius trois fois 10 à la puissance 4 cellules SCP dans 100 microlitres de milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum, 2 millimolaire de glutamine, 100 UI par millilitre de pénicilline et 100 UI par millilitre de streptomycine par puits.Dans une plaque de 96 puits, incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Si les cellules sont confluentes le jour suivant, changer le milieu par du DMEM contenant 1 % de sérum. Ayant 100 microlitres dans chaque puits, diluer le virus de la manière suivante.Ajouter 180 microlitres de DMEM contenant 1 % de sérum par puits à quatre fois 10 puits dans une plaque de 96 puits à fond rond ou en V pour une dilution sériée dix fois en quadruplet. Ajouter 20 microlitres de virus dans chacun des quatre puits de la première colonne de la plaque. Puis, à l’aide d’une pipette multicanal, pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de bien mélanger les échantillons.Changez les embouts de pipette et transférez 20 microlitres dans les quatre puits suivants, et ainsi de suite. Laissez les derniers puits sans virus comme témoin négatif. Ajoutez 100 microlitres de la dilution du virus aux cellules SEP et à l'incubateur de milieu.37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Observer la fluorescence GFP et les effets cytopathogènes pendant deux semaines. Les effets cytopathogènes consistent en un arrondissement des cellules et une diminution de leur transparence par rapport aux cellules normales, avec des prolongements cellulaires s'étendant, conduisant à l'apparition de cellules multinucléées et à la mort cellulaire.Calculer la titration du virus en utilisant la méthode de Reed-Muench pour une surveillance rapide de la réplication du virus. Les cellules infectées peuvent être examinées par cytométrie en flux après traitement à la trypsine. Environ 10 puissance cinq cellules infectées.Lavez une fois avec du PBS et RÉSUSPENDEZ dans 500 microlitres. PBS ajoutez 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 4 % pour une concentration finale de 2 %, incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Récupérez les cellules par centrifugation à 3000 ou PMM pendant cinq minutes.Laver deux fois avec du PBS pendant cinq minutes et analyser sur un analyseur de cytométrie en flux. Compter 10 000 événements. Le clone moléculaire exprimant la GFP de mon virus présenté ici peut être utile pour analyser les interactions hôte-virus et la pathogénicité de mon neurovirus, tant in vivo qu'in vitro.Bien qu'il n'ait pas été démontré que mon neurovirus puisse affecter les cellules humaines, il est important d'observer toutes les précautions de niveau de biosécurité. Les cellules et le plasmide peuvent être obtenus auprès de notre laboratoire. Bonne chance dans vos expériences.

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