Détection de multiplication et un clone moléculaire infectieux du virus Maedi-visna qui exprime Green Fluorescent Protein

L'objectif général de cette procédure est de propager et de détecter un clone infectieux de Mildy par rapport à l'absence de virus, exprimant une protéine fluorescente verte. Cette protéine fluorescente verte a été clonée dans le gène de la capside pour D utp Ace dans le génome du virus Myy Ner.

Le clone infectieux est contenu dans deux plasmides. Premièrement, les deux plasmides portant les séquences myy Ner sont coupés avec l'enzyme de restriction xpa un et ligaturés. Deuxièmement, des cellules de plexus choroïde de mouton sont transfectées avec la construction.

Enfin, les cellules infectées par le virus myy vino sont détectées par microscopie fluorescente et cytométrie en flux. Bonjour, je suis Stefano Neron de l'Institut TER de pathologie expérimentale de l'Université d'Islande. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de propager et de détecter un clone moléculaire infectieux du virus my vasculaire qui exprime une protéine fluorescente verte.

Le clone moléculaire est contenu dans les plasmides P huit XSP cinq EGFP et P soixante-sept ou de 12 kilobases et 4,5 kilobases respectivement. Couper des quantités équimolaires des deux plasmides, à savoir 4,4 microgrammes de P huit XSP cinq EGFP et 1,6 microgramme de P soixante-sept ou avec XPA un et ligaturer avant la transfection. Une fois la ligature terminée, incuber le mélange de ligature à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Deux jours avant la transfection, semer 10 puissance six cellules SCP dans un flacon de culture tissulaire T 25 et faire croître les cellules pendant deux jours dans 5 millilitres de DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau et de 2 millimolaire de glutamine, sans antibiotiques, jusqu’à une confluence de 90 % en monocouche.

Si les cellules n'ont pas atteint 90 %CO après deux jours, laissez les cellules croître un jour supplémentaire. Le sérum de mouton peut être remplacé par du sérum de veau fœtal FBS. Nous utilisons couramment le sérum de mouton car certains souches de MVV sont inhibées par le FBS.

Cette souche de MVV, cependant, n'est pas inhibée par le SFB. Lorsque les cellules sont prêtes pour la transfection, changer le milieu pour du DMEM contenant 1 % de sérum de veau ou de SFB, sans antibiotiques. Nous utilisons du Lipofectamine 2000 pour la transfection : diluer l'ADN dans 500 microlitres de milieu opti MEM, diluer 20 microlitres de Lipofectamine 2000 dans 500 microlitres de milieu opti MEM, puis laisser à température ambiante pendant cinq minutes.

Après une incubation de cinq minutes, mélangez l'ADN dilué avec le lipofectamine 2000 pour un volume total de 1000 microlitres. Mélangez délicatement et incubez de 22 à 30 minutes. À température ambiante, ajoutez le mélange de transfection au flacon T 25 contenant les cellules SCP et le milieu, en mélangeant par des mouvements de bascule doux.

Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le jour suivant, changer le milieu par du DMEM contenant 1 % de sérum, deux millimolaire de glutamine, 100 UI par millilitre de pénicilline et 100 UI par millilitre de streptomycine. Surveiller la production de GFP et des cellules SCP par microscopie fluorescente inversée.

Une faible efficacité de transfection peut être attendue avec ces cellules primaires, généralement entre cinq et quinze pour cent. Poursuivre l'incubation à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant plusieurs jours afin de permettre la propagation du virus dans la fiole. Il faut généralement entre sept et quatorze jours pour obtenir une infection complète. Récolter le virus par Ali, en transférant le surnageant dans des tubes einor.

Faire centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3000 tr/min pendant cinq minutes afin d'éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant contenant le virus dans de nouveaux tubes.

Conserver à moins 80 degrés Celsius trois fois 10 à la puissance 4 cellules SCP dans 100 microlitres de milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum, 2 millimolaire de glutamine, 100 UI par millilitre de pénicilline et 100 UI par millilitre de streptomycine par puits.

Dans une plaque de 96 puits, incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Si les cellules sont confluentes le jour suivant, changer le milieu par du DMEM contenant 1 % de sérum. Ayant 100 microlitres dans chaque puits, diluer le virus de la manière suivante.

Ajouter 180 microlitres de DMEM contenant 1 % de sérum par puits à quatre fois 10 puits dans une plaque de 96 puits à fond rond ou en V pour une dilution sériée dix fois en quadruplet. Ajouter 20 microlitres de virus dans chacun des quatre puits de la première colonne de la plaque. Puis, à l’aide d’une pipette multicanal, pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de bien mélanger les échantillons.

Changez les embouts de pipette et transférez 20 microlitres dans les quatre puits suivants, et ainsi de suite. Laissez les derniers puits sans virus comme témoin négatif. Ajoutez 100 microlitres de la dilution du virus aux cellules SEP et à l'incubateur de milieu.

37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Observer la fluorescence GFP et les effets cytopathogènes pendant deux semaines. Les effets cytopathogènes consistent en un arrondissement des cellules et une diminution de leur transparence par rapport aux cellules normales, avec des prolongements cellulaires s'étendant, conduisant à l'apparition de cellules multinucléées et à la mort cellulaire.

Calculer la titration du virus en utilisant la méthode de Reed-Muench pour une surveillance rapide de la réplication du virus. Les cellules infectées peuvent être examinées par cytométrie en flux après traitement à la trypsine. Environ 10 puissance cinq cellules infectées.

Lavez une fois avec du PBS et RÉSUSPENDEZ dans 500 microlitres. PBS ajoutez 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 4 % pour une concentration finale de 2 %, incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Récupérez les cellules par centrifugation à 3000 ou PMM pendant cinq minutes.

Laver deux fois avec du PBS pendant cinq minutes et analyser sur un analyseur de cytométrie en flux. Compter 10 000 événements. Le clone moléculaire exprimant la GFP de mon virus présenté ici peut être utile pour analyser les interactions hôte-virus et la pathogénicité de mon neurovirus, tant in vivo qu'in vitro.

Bien qu'il n'ait pas été démontré que mon neurovirus puisse affecter les cellules humaines, il est important d'observer toutes les précautions de niveau de biosécurité. Les cellules et le plasmide peuvent être obtenus auprès de notre laboratoire. Bonne chance dans vos expériences.