Visualisation des vasculaire Ca ^{2 +} Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la signalisation calcique vasculaire déclenchée par les espèces réactives de l’oxygène dérivées de la péricrine ou r os. Ceci est accompli en visualisant d’abord R os à l’aide de colorants sensibles à l’oxydation dans les macrophages actifs. Les ROS peuvent également être visualisés dans les cellules endothéliales à l’aide de capteurs fluorescents à base de plasmides.

Ensuite, procédez à la visualisation simultanée du traqueur de cellules des macrophages activés marqués en rouge et de la grippe de quatre cellules endothéliales marquées dans un modèle de co-culture. Enfin, mesurez la signalisation calcique dans les cellules endothéliales déclenchée par R os dérivé des macrophages. En utilisant un système d’imagerie confocale.

Ces résultats permettent de mettre en évidence les niveaux de R os de manière indépendante et d’évaluer simultanément la mobilisation intracellulaire du calcium déclenchée par les ROS dérivés de Peregrine. Cette méthode permet l’évaluation simultanée de deux molécules de signalisation différentes qui suscitent intimement une signalisation vasculaire et un simulateur de cadre physiopathologique. Deux postdoctorants de mon laboratoire, Karthik et Raj, feront la démonstration de la procédure sur des mesures brutes et calciques et des interactions entre les cellules endothéliales des macrophages.

Culture de macrophages dérivés de monocytes de souris sur des boîtes de 35 millimètres à fond de verre. Ensuite, défiez les cellules avec des agonistes des récepteurs de type Toll et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Pour la visualisation du cytosolique.

Les ROS ajoutent un colorant sensible à l’oxydation et incubent les cellules pendant 20 minutes. Visualisez maintenant les cellules sur une platine à température contrôlée d’un système d’imagerie confocale. Alternativement, pour visualiser les ROS mitochondriaux dans les cellules activées par TLR, ajoutez l’indicateur de superoxyde mitochondrial et incubez les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Pour un contrôle négatif, traitez les cellules avec du PBS ou du DMSO pour un contrôle positif. Traitez les cellules avec deux millimolaires d’antimycine. Procédez à la visualisation de toutes les cellules sur la platine à température contrôlée d’un système d’imagerie confocale.

À l’aide du logiciel image J, analysez toutes les données d’image. Le capteur fluorescent détecte spécifiquement les concentrations submicromolaires de peroxyde et, en fonction de l’expression des mammifères, la conception du vecteur peut cibler le cytoplasme ou les mitochondries. À l’aide de l’électroporation, créez des lignes stables de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires de souris portant un plasmide d’hyperexpression inapproprié.

Pour faciliter la croissance des cellules de la colonie à faible densité dans le TMEM complet et l’incubation pendant 48 heures, remplacer le milieu par un milieu de culture complet complété par un antibiotique de sélection. Dépister les clones pour le pourcentage le plus élevé de cellules hyper positives et amplifier la culture pour créer des lignées hyper positives stables dans des expériences individuelles. Semez les cellules sur des lamelles enrobées de gélatine à 0,2 % et cultivez pendant la nuit jusqu’à 80 % de confluence.

Activez maintenant les cellules avec les ligands TLR et incubez pendant six heures à 37 degrés Celsius. Pour la détection des ROS cytoplasmiques, montez les lamelles de recouvrement des cellules sur une chambre cellulaire adélo. Ajoutez un millilitre de réservoirs de préchauffage, équilibrez la solution saline et placez la chambre sur une platine à température contrôlée du système d’imagerie confocale.

Enregistrer les changements de fluorescence dans les cellules pour la détection des mitochondries. ROS. Inclure un contrôle positif de deux micromolaires antimycine A.Ensuite, préparer les lamelles de recouvrement des cellules traitées pour la microscopie confocale. Effectuez l’analyse d’images à l’aide du logiciel image J.

Commencez avec des cellules endothéliales cultivées à 80 % de confluence sur des lamelles de verre recouvertes de gélatine pour la visualisation et la mesure des changements de calcium intracellulaires. Incuber les cellules dans le colorant fluorescent grippe oh 4h00 à température ambiante pendant 30 minutes pour minimiser la perte de colorant laver les cellules avec une solution d’imagerie expérimentale contenant une zone pyro suen. Montez maintenant les glissières du couvercle sur une chambre cellulaire adelo à 800 microlitres de solution d’imagerie expérimentale préchauffée et positionnez les cellules sur une platine à température contrôlée du système d’imagerie confocale dans un tube séparé.

Utilisez 500 nanogrammes par millilitre de cell tracker red C-M-T-P-X pendant 15 minutes pour marquer la population de macrophages à l’étude, laver les cellules et remettre les pastilles en suspension dans 200 microlitres de solution d’imagerie expérimentale. Ajoutez maintenant les macrophages étiquetés sur la grippe oh 4h00 du matin chargée. Les cellules endothéliales de la chambre confocale enregistrent la fluorescence verte et rouge toutes les trois secondes pendant 10 minutes.

Dans cette expérience, les cellules J 7 74 0,1 ont été testées avec des ligands TLR deux, trois et quatre pendant six heures. Les images confocales représentatives montrent une augmentation du R os cytosolique mesurée par DCF. Il est intéressant de noter que la fluorescence rouge des mitoses indique une augmentation similaire des ROS mitochondriaux.

Ces changements de fluorescence sont quantitatifs. Ainsi, les résultats doivent être normalisés et exprimés sous forme de changement de pli relatif par traitement, le signal antimycine a valide un contrôle positif pour la production de ROS mitochondriaux. Cette figure montre des images des niveaux de peroxyde endothélial, cytosolique et mitochondrial exprimant de manière stable l’hyper cyto ou l’hyper D mito.

MP ECS stimulé par des agonistes du TLR. La quantification de la variation moyenne de la fluorescence démontre une augmentation de l’hyperfluorescence cyto et de l’hyperfluorescence D mito après six heures de stimulation dans un système de co-culture. Pour évaluer la signalisation ROS pèlerine, des macrophages de mirin fraîchement isolés de souris Fox null de type sauvage et de GP 91 ont été activés par un microgramme par millilitre de LPS pendant six heures.

Les macrophages ont été marqués en rouge avec C-M-T-P-X et ajoutés à la grippe verte quatre. Chargé. MPM ecs. Il est intéressant de noter que les macrophages activés par le LPS isolés chez des souris de type sauvage ont déclenché une mobilisation importante et rapide du calcium dans le MPM ECS par rapport aux macrophages des souris Fox null GP 91

Bien que LI tente d’adopter cette procédure, il est important de se rappeler que le téléchargement prolongé ou l’exposition au laser entraînent une auto-oxydation du DCF. Il est crucial d’éviter le photoblanchiment de l’hyper cyto et de l’hyper D mitral. Une fois maîtrisée, la mesure de l’AR dans les macrophages ainsi que dans les cellules endothéliales peut être effectuée en sept heures si elle est effectuée correctement.