Name: Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez la spectroscopie de corrélation de fluorescence pour quantifier le partitionnement des radeaux lipidiques dans les cellules vivantes. Cette méthode mesure les temps de diffusion des sondes fluorescentes pour étudier la dynamique membranaire.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Nous sommes également reconnaissants à la Fondation de l&#39;ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) pour leur soutien financier.

1. Calibrage de l'installation de FCS <ol><li> Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle. </li><li> Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l'intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l'acquisition. </li><li> Préparer une solution fraîche de la toxine cholérique Alexa488 dilué dans du PBS pour atteindre une concentration de 1 pg / ml (17,5 nM). </li><li> Optimiser imagerie confocale de la solution en utilisant la détection interne du microscope. </li><li> Se mettre en mode de balayage et de choisir un point dans l'échantillon de solution. Assurez-vous que la durée de l'éclairage laser est suffisamment long pour effectuer vos acquisitions FCS (&gt; 5 minutes). </li><li> Mettre à la détection externe par le SPAD et le logiciel FCS. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien suiTed à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, de 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. </li><li> L'acquisition de 10 séries de mesures secondes 30. Le temps d'acquisition doit être optimisé pour votre échantillon (compromis entre le meilleur échantillonnage et les problèmes de photoblanchiment). </li><li> Analysez vos données (voir l'étape 4) à veiller à ce que vous avez une courbe d'auto-corrélation correspondant à une espèce fluorescentes diffusion en solution (équation dans la Fig. 2) et que le temps de diffusion obtenu après le montage est correct (environ 0,2 ms) (Fig. . 3). </li></ol> 2. La coloration des cellules vivantes avec des lipides radeaux Marker <ol><li> Plate cellules HEK293 sur 8-même Labteks recouvertes de poly-L-lysine (1mg/ml) la veille de l'imagerie afin de s'assurer que leur adhérence est correcte. Utiliser le milieu sans rouge de phénol pour s'assurer qu'il n'y a pas de perturbation du signal de fluorescence. </li><li>Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée). </li><li> Ajouter la toxine cholérique Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) dans 500 ul HBSS aux cellules pendant 30 minutes à 37 ° C. Toxine cholérique se liera à ganglioside GM1, connu pour être partitionnée préférentiellement dans des radeaux lipidiques. </li><li> Laver les cellules deux fois avec HBSS (solution de Hank saline tamponnée). </li></ol> 3. FCS Acquisition de données sur des cellules vivantes <ol><li> Placez les cellules colorées sur la platine du microscope. Assurez-vous que la température et de CO 2 conditions sont optimales autrement cela peut conduire à des artefacts dans les temps de diffusion. </li><li> Optimiser imagerie confocale d'une cellule d'intérêt en utilisant la détection interne du microscope (fig. 4). </li><li> Se mettre en mode de numérisation et de choisir un point dans la membrane plasmique de la cellule d'intérêt. Effectuer 1-2 images en direct de la cellule afin de s'assurer de la cellule ne se déplace pas lors de l'acquisition. </li><li> Mettre à la détection externe de la SPAD et à la douce FCSware. Surveillez votre signal de fluorescence et assurez-vous qu'il est bien adapté à la SPAD (signal suffisant, mais pas de saturation, 10 000 à 50 000 points / s est très bien). Si nécessaire, modifier la position z, le gain et / ou la puissance du laser pour atteindre correcte signal de fluorescence. Si cela ne suffit pas, vous pouvez envisager de modifier les conditions de coloration. </li><li> L'acquisition de 10 échantillons de mesures secondes 30. Comme la plupart des cellules sont auto-fluorescente, vous pouvez voir une diminution de la fluorescence au cours des premières acquisitions, en raison de l'auto-fluorescence décoloration. </li></ol> 4. FCS Analyse des données <ol><li> Définissez l'intervalle de corrélation et de générer des courbes d'auto-corrélation avec le logiciel FCS. L'intervalle de corrélation varient généralement entre le temps de latence plus court résoluble à le plus longtemps possible (comme les statistiques de la mesure devient de plus en plus insuffisante lorsque le temps de corrélation maximale s'approche le temps total d'acquisition, le temps de latence maximale est limitée à 80% de la temps d'acquisition sur la Picoquant le logiciel). </li><li> Pour chaque échantillon, exporter des fichiers correspondant à des fluctuations de fluorescence et d'auto-corrélation en tant que fonction du temps. </li><li> Utiliser une analyse des données et des logiciels de montage telles que l'origine Pro pour importer les fichiers. </li><li> Pour chaque échantillon, assurez-vous qu'il n'ya pas de photoblanchiment lors de l'acquisition soit la fluorescence reste stable pendant les 30 secondes. Jeter toute mesure affichage photoblanchiment car cela pourrait provoquer artificiels temps de diffusion plus longs. </li><li> Vérifiez que la forme de la courbe restant FCS est correct (voir figure 5). Déterminer la courbe moyenne de FCS. </li><li> Monter la courbe avec le modèle mathématique approprié (Fig. 2). Cet ajustement sera de vous donner le temps de diffusion (s) et la proportion de molécules qui diffusent avec ce temps de diffusion (ESE) (s). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple d'un étalonnage avec un FCS toxine cholérique Alexa488 solution est montré dans la figure 3 (figure 3A), individuels et moyens des courbes FCS ont été calculés. Mean courbes FCS ont été équipés avec des équations correspondant à différents modèles de diffusion (exemples de la figure 2). Le paramètre classiquement considéré pour déterminer la qualité d'un ajustement est le coefficient de détermination R 2. Le plus proche R 2 est à 1, le meilleur est le modèle. Dans ce cas, le modèle le plus précis pour s'adapter à la courbe moyenne de FCS est la description d'une population de molécules fluorescentes diffusant librement en trois dimensions (l'équation 1 dans la figure 2 et la figure 3B). Le temps de diffusion provenant de l'ajustement est de 0,32 ms. Résidus de courbe-raccord (figure 3C) et R 2 facteur (0,99906) fournir une estimation de la qualité de l'ajustement. Un exemple d'analyse FCS pour la toxine cholérique Alexa488 teinté HEK293 cellules est illustré à la figure 5. La forme moyenne multiphasique courbe FCS révèle l'existence de populations de molécules fluorescentes avec des temps de diffusion différents. Le meilleur ajustement de cette courbe correspond à un modèle à trois populations de sondes fluorescentes: deux avec une diffusion entravée (diffusion en deux dimensions, comme dans le plan de la membrane) et un diffusant librement en trois dimensions (équation 2 dans la Figure 2 et Figure 5) . Population ce dernier correspond à des molécules fluorescentes se déplacent en dehors du plan de membrane, à savoir, soit liaison ou déliaison à leurs cibles membrane, pour atteindre la membrane à travers la voie de sécrétion ou de recyclage, ou sortant de la membrane par endocytose. Les deux temps de diffusion à la membrane, ce qui correspond à la toxine cholérique lié à GM1, sont de 2 ms (25% de molécules), correspondant à la diffusion à l'extérieur de radeaux lipidiques, et 75 ms (50% de molécules), correspondant à la diffusion dans des radeaux lipidiques . S'il vous plaît noter que toute photoblanchimentING lors de l'acquisition conduira à artificielles temps de diffusion plus longs donc peut-être la création d'un biais vers la localisation de GM1 dans les domaines radeaux lipidiques. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentation schématique de la FCS set-up (photo modifiée de MARQUER et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Exemple de modèles de diffusion et équations correspondantes utilisées pour ajuster les courbes d'autocorrélation. Le paramètre de structure S peuvent être écrites en tant que S = z 0 / n 0 avec z 0 le rayon focale effective le long de l'axe optique de 1 / e 2 intensité et l'efficacité w0 laTeral rayon focal à 1 / e 2 intensité. Ces valeurs peuvent être extraites à partir d'un écart de points fonction classique (PSF) de mesure. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 en solution pour l'étalonnage de FCS. A) de fluctuation de fluorescence en fonction du temps pour un exemple représentatif d'une acquisition 30 secondes. B) Moyenne courbe d'autocorrélation obtenue à partir de 10 échantillons de 30 secondes d'acquisition équipé avec l'équation 1 (voir Figure 2). C) Résidus de l'ajustement de courbes. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. HEK-293 cellules colorées avec la toxine cholérique Alexa488. Les cellules ont été imagées sur un microscope confocal SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) sur la ligne laser 488nm interne. Fluorescence ont été recueillies avec un objectif x60 apochromatique immersion plan de l'huile entre 500et 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Evaluation du temps de diffusion de la toxine cholérique Alexa488 à la membrane plasmique des cellules HEK293. A) courbe moyenne autocorrélation équipé avec l'équation 2 (voir Figure 2). B) Les résidus de l'ajustement de courbes. (Modifié d'après MARQUER et al. 12)

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d&#39;intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c&#39;est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c&#39;est le cas pour...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sous-unité toxine B du choléra-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamère) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle </td><td> La vie des services d&#39;imagerie </td><td> Le Cube et la boîte de </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM série (100 um zone sensible) </td><td></td></tr><tr><td> Passe-haut 488 nm filtre </td><td> Semrock </td><td> 488 nm de blocage de bord Brightline filtre passe-long N ° de pièceails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> Unité de détection de FCS </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 modules </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition et d&#39;auto-corrélation de logiciels </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel de montage </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Au cours des quinze dernières années la notion que les membranes cellulaires ne sont pas homogènes, et s&#39;appuyer sur des microdomaines à exercer leurs fonctions est désormais largement admis. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en sphingolipides. Ils jouent un rôle dans les processus physiologiques cellulaires tels que la signalisation, et de 1,2 le trafic, mais sont également pensés pour être des acteurs clés dans plusieurs maladies dont les infections virales ou bactériennes et les maladies neurodégénératives 3. Pourtant, leur existence est encore un sujet de controverse 4,5. En effet, la taille radeau lipidique a été estimé à environ 20 nm 6, loin sous la limite de résolution du microscope conventionnel (environ 200 nm), les empêchant ainsi de l&#39;imagerie directe. Jusqu&#39;à présent, les principales techniques utilisées pour évaluer la partition de protéines d&#39;intérêt à l&#39;intérieur de radeaux lipidiques étaient membranes résistant aux détergents (DRM) d&#39;isolement et de co-patching avec des anticorps. Bien que largement utilisé becal&#39;utilisation de leur mise en œuvre assez facile, ces techniques étaient enclins à des artefacts et donc critiqué 7,8. Les améliorations techniques sont donc nécessaires pour surmonter ces objets et d&#39;être en mesure de sonder lipidique des radeaux de partition dans les cellules vivantes. Nous présentons ici une méthode pour l&#39;analyse sensible de lipides radeaux partition de protéines par fluorescence-étiquetés ou des lipides dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette méthode, appelée spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS), repose sur la disparité des temps de diffusion de sondes fluorescentes situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. En fait, comme en témoignent les deux membranes artificielles et des cultures cellulaires, les sondes serait de diffuser beaucoup plus rapidement en dehors qu&#39;à l&#39;intérieur des radeaux lipidiques denses 9,10. Pour déterminer des temps de diffusion, minute fluctuations de fluorescence sont mesurées en fonction du temps dans un volume focal (environ 1 femtolitre), situé à la membrane plasmique de cellules avec un microscope confocal (fig.1). Les courbes d&#39;auto-corrélation peut alors être tirée de ces fluctuations et équipé des modèles appropriés de diffusion mathématiques 11. FCS peut être utilisé pour déterminer le radeau lipidique de cloisonnement de sondes différentes, tant qu&#39;ils sont marquées par fluorescence. Fluorescente marquage peut être obtenue par expression de protéines de fusion fluorescentes ou par liaison de ligands fluorescents. Par ailleurs, FCS peut être utilisé non seulement dans des membranes artificielles et des lignées cellulaires, mais aussi dans des cultures primaires, tel que décrit récemment 12. Il peut également être utilisé pour suivre la dynamique de la séparation des lipides radeau après l&#39;addition de drogues ou de changements dans la composition des lipides membranaires 12.

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. L&#39;acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l&#39;addition de drogues.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

Au cours des quinze dernières années, l'idée selon laquelle les membranes cellulaires ne sont pas homogènes et s'appuient sur des microdomaines pour exercer leurs fonctions est devenue largement acceptée.

Les radeaux lipidiques sont des microdomaines au sein de la membrane plasmique qui servent de centres d'organisation pour des processus cellulaires tels que la signalisation et le trafic intracellulaire. Ici, la partition des radeaux lipidiques au niveau de la membrane plasmique de cellules vivantes est quantifiée à l'aide de la spectroscopie de corrélation de fluorescence afin d'examiner la partition du ganglioside GM1 dans les radeaux lipidiques. Des cellules de mammifères sont sondées à l'aide de sous-unités B de la toxine cholérique marquées avec Alexa 488.Les protéines fluorescentes se lient au ganglioside GM1, qui est préférentiellement réparti dans les radeaux lipidiques, à l'aide de la microscopie confocale. Des fluctuations de fluorescence minimes au niveau de la membrane plasmique sont mesurées. Des courbes d'autocorrélation sont générées et ajustées à l'aide de modèles mathématiques de diffusion appropriés afin de déterminer les temps de diffusion du fluorophore.Étant donné que les sondes diffusent beaucoup plus rapidement à l'extérieur qu'à l'intérieur des radeaux lipidiques denses, les résultats obtenus indiquent le niveau de partitionnement. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, telles que l'isolement des membranes résistantes aux détergents ou le co-balisage par des anticorps, est que la FCS permet de déterminer le motif absolu, et non relatif, de greffage lipidique de la cible. De plus, elle peut être utilisée aussi bien pour les lipides que pour les protéines, à condition qu'elles soient marquées de manière fluorescente.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la maladie d'Alzheimer, comme quelle est l'importance des lipides dans la production du bêta-amyloïde ? Cela conduira à des découvertes importantes, telles que de nouveaux inhibiteurs se liant spécifiquement aux composants des greffons lipidiques. Commencez cette procédure en étalonnant le système de spectroscopie de corrélation de fluorescence ou FCS.Ce dispositif de FCS est composé d'un microscope confocal relié à une unité de détection externe équipée d'un filtre de détection et d'une photodiode à avalanche, ainsi qu'à un système de comptage de photons uniques corrélé en temps. Allumez les lasers du microscope confocal, l'ordinateur d'imagerie confocale et l'ordinateur d'acquisition de FCS. Ensuite, allumez l'incubateur et réglez-le à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Vérifiez que la diode à avalanche à photon unique, ou SPAD, est allumée et que le filtre de fluorescence à l'intérieur du SPAD convient bien à l'échantillon. Assurez-vous que le SPAD est synchronisé dans le temps. Une fois les paramètres du SPAD prêts pour l'acquisition, lancez le logiciel FCS PICO quant.Préparez une solution fraîche de toxine du choléra Alexa 488 diluée dans du PBS à une concentration finale de un microgramme par millilitre. Déposez la solution sur un coverslip. Ensuite, ajustez les réglages Z du microscope pour trouver le plan dans lequel la fluorescence est la plus intense.Pour passer en mode de balayage ponctuel, cliquez sur le bouton de point de photoblanchiment, puis cliquez sur l'écran de l'image pour choisir une région d'intérêt ponctuelle dans l'échantillon en solution. À l'aide du logiciel, réglez le temps d'exposition à plus de cinq minutes. Cela garantit que l'illumination par laser est suffisamment longue pour effectuer les acquisitions FCS.Ensuite, à l'aide du logiciel FCS, passez à la détection externe par le SPAD. Veillez à ce que le signal fluorescent se situe entre 10 000 et 50 000 impulsions par seconde. L'objectif est d'obtenir un bon signal sans saturation.Acquérir 10 séries de mesures en 32e sur le même champ. Le temps d'acquisition doit être optimisé pour l'échantillon afin d'obtenir un échantillonnage de haute qualité sans photoblanchiment. Une fois les données d'optimisation acquises, elles sont utilisées pour générer des courbes d'autocorrélation à partir desquelles les temps de diffusion des espèces fluorescentes seront déterminés. Premièrement.À l'aide du logiciel FCS, définissez l'intervalle de corrélation et générez une courbe d'autocorrélation correspondant aux espèces fluorescentes diffusant en solution. Pour chaque 32e mesure, le logiciel analysera chaque échantillon 32e indépendamment et générera des courbes d'autocorrélation à partir des intensités de fluorescence en utilisant une fonction mathématique classique qui indique le degré de similitude entre les observations en fonction de l'intervalle de temps les séparant. L'intervalle de corrélation s'étendra généralement du temps LAC le plus court résoluble au temps le plus long possible.Comme on peut le voir ici, la mesure devient moins précise lorsque le temps de corrélation maximal approche le temps total d'acquisition. Ici, le temps de décalage maximal est limité à 80 % du temps d'acquisition. Ensuite, pour chaque échantillon, exporter les fichiers correspondant aux fluctuations de fluorescence et à l'autocorrélation en fonction du temps. Puis importer les fichiers dans un logiciel d'analyse et d'ajustement de données tel qu'Origin Pro afin de vérifier qu'aucun photoblanchiment n'a eu lieu pendant l'acquisition.Examinez le fichier des fluctuations de fluorescence. La fluorescence doit être stable pendant les 30 secondes et doit être représentée par une ligne plate. Lorsque les mesures de fluorescence montrent un photoblanchiment.Ne pas utiliser les courbes FCS correspondantes pour des analyses supplémentaires, car cela pourrait provoquer des temps de diffusion artificiellement plus longs avec les courbes FCS restantes. Déterminer la courbe FCS moyenne en faisant la moyenne des valeurs d'autocorrélation pour chaque point temporel. Enfin, pour ajuster la courbe avec le modèle mathématique approprié, utiliser le module d'ajustement d'Origin Pro avec l'équation adéquate.Cet ajustement fournira le temps de diffusion des molécules et de la solution. Dans ce cas, il n'y a qu'une seule population qui diffuse librement par diffusion. Si le temps de diffusion obtenu est correct, il est d'environ 0,2 milliseconde.Le dispositif est bien étalonné et peut être utilisé pour des expériences ultérieures. Maintenant que l'étalonnage du dispositif a été vérifié, le système peut être utilisé pour mesurer le partitionnement des RAF lipidiques d'une flore. Quatre cellules vivantes d'intérêt retirent les cellules HEC 2 93 de l'incubateur.Les cellules doivent avoir été ensemencées la veille sur des lames Lab Tech à huit puits revêtues de poly-L-lysine afin qu'elles aient le temps d'adhérer dans un milieu sans phénol. Un pipetage rouge doit être utilisé pour éviter toute perturbation du signal de fluorescence. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement la majeure partie du milieu du puits, en veillant à ce que les cellules ne s’assèchent pas.Ensuite, ajoutez délicatement du HBSS dans le puits. Répétez ce lavage une fois pour chaque puits. Ajoutez ensuite 500 microlitres de toxine du choléra diluée, Alexa 488, aux cellules pendant 30 minutes.À 37 degrés Celsius, la toxine du choléra se liera au ganglioside GM1, connu pour être préférentiellement partitionné dans les radeaux lipidiques après l'incubation. Lavez les cellules deux fois avec du HBSS comme précédemment ; les cellules sont désormais prêtes pour l'acquisition des données FCS. Placez les cellules marquées sur la platine du microscope et vérifiez les réglages de température et de dioxyde de carbone.Optimisez l'imagerie confocale d'une cellule d'intérêt en utilisant la détection interne du microscope. Recherchez une cellule dont la membrane est bien colorée. Passez en mode de balayage ponctuel comme précédemment, puis choisissez un point sur la membrane plasmique de la cellule d'intérêt.Prenez une à deux images de la cellule pour vous assurer qu'elle ne bouge pas pendant l'acquisition. Passez à la détection externe par le spad et au logiciel FCS comme précédemment afin d'obtenir un signal correct compris entre 10 000 et 50 000. Modifiez la position en Z, le gain et/ou la puissance du laser.Acquérir 10 échantillons de 32e mesures, car la plupart des cellules sont autofluorescentes. Une diminution de la fluorescence peut survenir au cours des premières acquisitions en raison de l'atténuation de l'autofluorescence. Analyser les fluctuations de fluorescence comme précédemment afin de déterminer la courbe moyenne de FCS.Ensuite, ajuster la courbe moyenne de FCS multiphasique avec le modèle mathématique approprié. Utiliser le module d'ajustement d'Origin Pro avec l'équation adéquate. Cet ajustement fournira les temps de diffusion et la proportion de molécules diffusant avec ces temps de diffusion.Cette figure montre un exemple d'étalonnage FCS avec une solution de toxine du choléra marquée par l'Alexa 488. Après vérification que les mesures individuelles de fluorescence en fonction du temps ne présentaient aucun photoblanchiment, les courbes FCS individuelles et moyennes ont été calculées. Les courbes FCS moyennes ont été ajustées à l'aide d'équations correspondant à divers modèles de diffusion.Le paramètre classiquement pris en compte pour déterminer la qualité d’un ajustement est le coefficient de détermination R². Plus R² est proche de un, meilleur est l’ajustement, c’est-à-dire plus le modèle d’ajustement est précis. La courbe FCS moyenne est celle qui décrit une population de molécules fluorescentes diffusant librement en trois dimensions.Le temps de diffusion déduit de l'ajustement est de 0,32 milliseconde. Les résidus de l'ajustement des courbes et le facteur R carré fournissent une estimation de la qualité de cet ajustement. La valeur de R carré est de 0,99906, ce qui indique un bon ajustement.Un exemple d'analyse de FCS pour des cellules HC 2 93 marquées avec la toxine du choléra Alexa 4 88 est montré ici. Dans cet exemple, la toxine commence à être endocytée, comme en témoigne la présence de petits points fluorescents intracellulaires permettant d'évaluer la diffusion. Temps de la toxine du choléra Alexa 4 88 à la membrane plasmique.Les données ont été collectées et analysées comme décrit dans cette vidéo. La forme multiphasique de la courbe moyenne de FCS révèle l'existence de populations de molécules fluorescentes présentant des temps de diffusion différents. L'ajustement optimal pour cette courbe correspond à un modèle comportant trois populations de sondes fluorescentes, dont deux présentent une diffusion entravée.Diffusion en deux dimensions, comme dans le plan de la membrane, et une autre population diffusant librement en trois dimensions. Cette dernière population correspond à des molécules fluorescentes se déplaçant en dehors du plan de la membrane. Autrement dit, les molécules fluorescentes se lient ou se dissocient de cibles membranaires en atteignant la membrane via la voie de sécrétion ou de recyclage, ou quittent la membrane par endocytose.Deux temps de diffusion ont été observés au niveau de la membrane. 25 % des molécules présentaient des vitesses de diffusion de deux millisecondes, correspondant à une diffusion en dehors des radeaux lipidiques. 50 % des molécules présentaient des temps de diffusion de 75 millisecondes, correspondant à une diffusion au sein des radeaux lipidiques.Après le développement de cette procédure, le couplage d'une configuration optique alternative permet ensuite la détection de molécules uniques au-dessous de la limite de diffraction, ce qui autorise l'accès à une gamme plus large de temps de diffusion. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des radeaux lipidiques pour étudier les dynamiques liées aux maladies concernant la partition des radeaux lipidiques après modification de la composition lipidique de la membrane par des médicaments, dans des lignées cellulaires et des cultures primaires.

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