Essai Fréquence d'adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l'interface cellule-cellule

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer la cinétique d’interaction entre les ligands du récepteur lorsque les deux molécules sont ancrées à la surface des cellules en interaction. Ceci est réalisé en fonctionnalisant d’abord les globules rouges, qui sont les capteurs d’adhésion avec des ligands et en préparant les cellules porteuses de récepteurs. Dans un deuxième temps, la chambre de la micro-pipette est assemblée et des tests d’adhérence sont effectués pour enregistrer les événements d’adhérence.

Ensuite, la courbe de probabilité d’adhésion en fonction du temps de contact des cellules est tracée et ajustée avec le modèle. Afin d’estimer les paramètres cinétiques, on obtient des résultats qui montrent l’affinité de liaison effective bidimensionnelle et le taux de désactivation estimé à partir des données. Alors, d’où nous vient l’idée de ce test ?

Les gens étudient l’interaction entre les jambes des récepteurs. Mesurer principalement les forces de rupture et nous faisons la même chose, mais un jour, nous avons pensé que nous pourrions simplement mesurer le résultat binaire zéro pour l’absence d’adhésion et un pour l’adhésion et dériver la mesure de la cinétique à partir de ces mesures zéro un pour montrer le dosage de la fréquence des micro-tuyaux. Le Dr Veronica Zana Zina, chercheuse scientifique de mon laboratoire, vous montrera l’expérience.

Les globules rouges isolés du sang total sont biotinylés pour le dosage de la fréquence d’adhésion. Pour commencer cette procédure, centrifugez le tube contenant des globules rouges isolés, aliquote 10 microlitres de granules de globules rouges dans chacun des nombreux flacons et ajoutez la quantité correspondante de PBS dans chaque flacon pour préparer plusieurs concentrations d’exaltation de la biotine des globules rouges. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon à huit alésages molaires de 0,1 molaire dans chaque flacon.

Ajoutez ensuite une quantité calculée de solution de biotine dans chaque flacon et vortex immédiatement. Pendant quelques secondes, placez chaque flacon de globules rouges à l’intérieur d’un tube conique de 50 millilitres et incubez sur un rotateur pendant 30 minutes à température ambiante après 30 minutes, ajoutez un tampon EAS 45 dans chaque flacon et centrifugez pendant deux minutes à 2000 rotations par minute. Répétez deux fois le lavage avec le tampon EAS 45 pour un total de trois lavages.

Enfin, ajoutez 100 microlitres de tampon EAS 45 dans chaque flacon et stockez-le à quatre degrés Celsius pour fonctionnaliser les ligands à la surface des globules rouges en les incitant à l’étape précédente, les globules rouges sont incubés avec une concentration saturée de streptocoque TTR pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et lavés trois fois avec le tampon EAS 45 pendant deux minutes à 2000 rotations par minute. Après cela, incubez les globules rouges directement avec le ligand biotinylé ou incubez les globules rouges avec l’anticorps de capture biotinylé correspondant, suivi d’une incubation avec des ligands. Le protocole montré dans cette vidéo utilise l’anticorps de capture biotinylé.

Les micropipettes sont fabriquées à l’aide de tubes capillaires en verre de silicate. Utilisez d’abord un extracteur de micro-pipette pour tirer les tubes capillaires. Ensuite, utilisez un micro-manipulateur avec une micro-forge pour couper la pointe de la micro-pipette à la taille souhaitée de l’ouverture.

Le diamètre requis varie généralement de un à cinq microns en fonction de la taille des cellules à utiliser dans l’étude. Pour préparer la chambre cellulaire, utilisez deux morceaux de verre de protection de microscope coupés à la taille souhaitée, nettoyez la poussière des lamelles de recouvrement avec un plumeau à air, ajoutez le milieu de la chambre cellulaire et scellez la chambre avec de l’huile minérale des deux côtés pour éviter l’évaporation du fluide. Cela changera l’osmolarité pendant l’expérience.

Le système de micro-pipettes utilisé dans cet essai se compose de trois sous-systèmes, un sous-système d’imagerie pour l’observation, l’enregistrement et l’analyse des mouvements de la cellule aspirée par micro-pipette, un sous-système de micro-manipulation pour permettre la sélection de cellules dans la chambre cellulaire et un sous-système de pression pour l’aspiration des cellules en micro-pipettes. La pièce centrale du sous-système d’imagerie est un microscope inversé avec une immersion dans l’huile de 100 fois. Les images objectives sont détectées par une caméra de dispositif à couple de charge et envoyées à un magnétoscope.

Une minuterie vidéo est couplée au système pour garder une trace du temps. Après avoir rempli la micropipette d’eau déminéralisée, placez-la dans son support sur un entraînement mécanique monté sur le microscope. La micro-pipette peut être positionnée avec précision à l’aide d’un manipulateur hydraulique micrométrique à trois axes.

L’un des porte-micro-pipettes est monté sur un traducteur piézoélectrique programmé par ordinateur. Cela permet à la pipette d’être déplacée avec précision et dans un cycle de test d’adhérence. Le sous-système de régulation de la pression est utilisé pour contrôler l’aspiration.

Au cours de l’expérience, une conduite hydraulique relie le porte-micropipette à un réservoir de fluide. Un positionneur mécanique fin permet de manipuler avec précision la hauteur du réservoir. Une fois la chambre assemblée, une micro-pipette est installée, injecte les cellules dans la chambre pour commencer le test, aspire les cellules en interaction par les pipettes respectives et utilise le traducteur électrique PSO pour faire entrer et sortir le contact du globule rouge avec le neutrophile avec une zone de contact et un temps contrôlés.

Un événement adien est observé lorsque le globule rouge s’allonge lors de la séparation cellulaire, un événement de non-adhésion correspond à l’absence d’élongation des globules rouges. Enregistrez les événements d’adhésion observés en ajoutant un pour l’adhésion ou zéro pour l’absence d’adhésion. Dans une colonne d’une feuille de calcul Excel.

Enregistrez la fréquence d’adhérence en fonction de la courbe de temps de contact en utilisant au moins trois paires de cellules différentes pour chaque temps de contact. Pour obtenir une moyenne et un MEB comme contrôle, enregistrez la courbe de liaison non spécifique en utilisant des globules rouges recouverts d’un ligands pertinent et/ou en bloquant les ligands ou les récepteurs à l’aide de leur blocage fonctionnel spécifique. Les anticorps monoclonaux, la fréquence d’adhésion spécifique à chaque point de temps de contact peuvent être calculés en supprimant la fréquence d’adhésion non spécifique.

Les données spécifiques de fréquence d’adhésion en fonction du temps de contact sont ajustées par un modèle probabiliste qui décrit un second ordre en avant et un premier ordre. Interaction inverse en une seule étape entre une seule espèce de récepteurs et une seule espèce de ligands dans cette équation, KA est l’affinité 2D. KA est le taux de réduction 2D.

MR et ML sont les densités respectives de récepteurs et de ligands et AC est la zone de contact. L’ajustement de la courbe a deux paramètres, ac, k, a et K désactivé car AC et KA sont regroupés et appelés collectivement comme affinité 2D effective son produit avec le taux de désactivation est le 2D effectif sur le taux AC K sur est égal à AC KA fois K désactivé. Voici un exemple de la détermination de l’intégrine alpha L bêta deux.

Densité de site sur les neutrophiles. Les neutrophiles ont d’abord été incubés, un microgramme par millilitre de E sélectine IG, puis ont saturé les concentrations de CD 11 humain conjugué au PE, d’un anticorps monoclonal ou d’un anticorps IgG de souris pertinent comme témoin. Après 30 minutes, les échantillons d’incubation ont été lavés et lus sur un cytomètre en flux avec une quantité standard.

Perles d’étalonnage PE brillantes. Le panneau A montre les histogrammes de fluorescence des billes d’étalonnage ainsi que ceux des cellules E sélectionnées en IG ou non. La coloration spécifique des anticorps monoclonaux du CD 11 A est représentée par des courbes solides et la coloration des anticorps de contrôle de correspondance des isotypes pertinente est représentée par des courbes pointillées.

Le panneau B montre le processus de quantification de la densité. Le log 10 a été calculé pour l’intensité fluorescente moyenne de chacune des quatre billes. Valeur maximale d’étalonnage à partir du panneau A et pour les molécules de PE spécifiques au lot par bille.

Une régression linéaire de log 10 molécules de PE par bille en fonction de la fluorescence de log 10 a été tracée pour les cellules intrusées resélectionnées. Le log 10 fi est égal à 3,99 indiqué par le cercle plein bleu et 2,23 indiqué par le cercle ouvert bleu pour l’anticorps monoclonal spécifique et l’anticorps témoin respectivement. Lorsque l’équation linéaire de X a été résolue, le nombre total d’alpha L bêta deux ou de neutrophiles a été calculé comme étant de 9 587.

La densité de surface a été calculée à 43 sites par micron carré en utilisant 8,4 microns comme diamètre des neutrophiles. Le graphique suivant montre la fréquence d’adhérence fi pour une liaison spécifique à une seconde et 10 secondes. Temps de contact mesurés à partir de cycles de test d’adhésion répétés entre des globules rouges enrobés ICAM un et des neutrophiles humains exprimant l’intégrine alpha L bêta deux.

En revanche, la fréquence d’adhésion courante fi pour la liaison non spécifique à une seconde et dix secondes de contact est mesurée à partir de cycles de test adion répétés entre des globules rouges enrobés d’IgG humains et des neutrophiles humains exprimant l’intégrine alpha L bêta deux. Ce dernier graphique illustre la cinétique de la liaison de I, A, un, à l’intégrine neutrophile, à l’intégrine, à L, à la bêta, à deux, les probabilités d’adhésion mesurées pour trois paires de cellules à chaque temps de contact ont été moyennées et tracées en fonction du temps de contact pour contrôler la liaison non spécifique. Deux conditions différentes ont été utilisées.

Un globule rouge enrobé de l’anticorps anti-capture TFC et incubé avec des IgG humaines au lieu d’ICAM, un IG et deux neutrophiles se liant à des globules rouges non enrobés de l’anticorps de capture. La liaison non spécifique enregistrée sous forme de courbe de contrôle IgG humaine a été utilisée pour obtenir une courbe de probabilité d’adhésion spécifique. En utilisant l’équation précédemment illustrée pour la correction de liaison non spécifique.

La courbe de probabilité d’adhésion spécifique corrigée a été ajustée avec l’ajustement du modèle. La courbe de probabilité d’adhésion spécifique a renvoyé l’affinité de liaison effective. Un CKA est égal à 1,4 fois 10 puissance moins quatre microns à la puissance quatre et koff est égal à 0,3 s moins un.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la cinétique d’interaction du ligand récepteur lorsque les deux molécules s’ancrent à la surface des cellules d’interaction I. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler les premiers entraînements, les densités latérales des ligands varient de sorte que l’adhésion de la fréquence soit dans la fourchette moyenne et se rappeler que travailler avec du sang et certaines des régions pour un traitement spécifique, par exemple, le sodium et le DM peut être extrêmement dangereux. Par conséquent, des précautions telles que la lecture attentive de la fiche signalétique des réactifs et le port de gants lors de l’exécution de cette procédure sont requises.