Essai Fréquence d'adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l'interface cellule-cellule

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer la cinétique des interactions récepteur-ligand lorsque les deux molécules sont ancrées à la surface des cellules en interaction. Cela est réalisé en premier lieu en fonctionnalisant les globules rouges, qui servent de capteurs d'adhésion, avec des ligands, puis en préparant des cellules exprimant le récepteur. Dans un deuxième temps, la chambre à micropipette est assemblée et des tests d'adhésion sont effectués afin d'enregistrer les événements d'adhésion.

Ensuite, la courbe de la probabilité d'adhésion en fonction du temps de contact des cellules est tracée et ajustée au modèle. Afin d'estimer les paramètres cinétiques, des résultats sont obtenus, montrant l'affinité de liaison effective en deux dimensions et la constante de dissociation estimées à partir des données. D'où provient donc l'idée de ce test ?

Les chercheurs étudient l'interaction entre les récepteurs et les ligands. La plupart du temps, ils mesurent les forces de rupture, et nous faisons la même chose, mais un jour, nous nous sommes demandé s'il était possible de simplement mesurer le résultat binaire — zéro en l'absence d'adhésion et un en cas d'adhésion — et d'en déduire une mesure de la cinétique à partir de ces mesures binaires afin de montrer le test de fréquence par micro-pipette. La Dre Veronica Zana Zina, chercheuse scientifique dans mon laboratoire, vous présentera l'expérience.

Les globules rouges isolés à partir de sang total sont biotinylés pour le test de fréquence d'adhérence. Pour commencer cette procédure, centrifuger le tube contenant les globules rouges isolés, aliquoter 10 microlitres de culot de globules rouges dans chacun de plusieurs flacons et ajouter la quantité correspondante de PBS à chaque flacon afin de préparer plusieurs concentrations de biotinylation des globules rouges. Ensuite, ajouter 10 microlitres de tampon bore huit 0,1 molaire à chaque flacon.

Ensuite, ajouter une quantité calculée de solution de biotine à chaque flacon et vortexer immédiatement. Placer chaque flacon d'hématies dans un tube conique de 50 millilitres pendant plusieurs secondes, puis incuber sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, ajouter le tampon EAS 45 à chaque flacon et centrifuger pendant deux minutes à 2000 rotations par minute. Répéter le lavage avec le tampon EAS 45 deux fois, pour un total de trois lavages.

Enfin, ajouter 100 microlitres de tampon EAS 45 dans chaque flacon et conserver à quatre degrés Celsius pour fonctionnaliser les ligands à la surface des globules rouges. Comme indiqué à l'étape précédente, les globules rouges sont incubés avec une concentration saturée de strep TTR pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis lavés trois fois avec le tampon EAS 45 pendant deux minutes à 2000 rotations par minute. Ensuite, soit incuber directement les globules rouges avec le ligand biotinylé, soit incuber les globules rouges avec l'anticorps de capture biotinylé correspondant, suivi d'une incubation avec les ligands. Le protocole présenté dans cette vidéo utilise l'anticorps de capture biotinylé.

Les micropipettes sont fabriquées à l’aide de capillaires en verre borosilicaté à point de fusion ax. Utilisez d’abord un tireur de micropipettes pour étirer les capillaires. Ensuite, utilisez un micromanipulateur équipé d’une microforge pour couper l’extrémité de la micropipette afin d’obtenir une ouverture de la taille souhaitée.

Le diamètre requis varie généralement entre un et cinq micromètres, selon la taille des cellules utilisées dans l'étude. Pour préparer la chambre à cellules, utilisez deux morceaux de lamelles de microscope découpés à la taille souhaitée, éliminez la poussière des lamelles à l’aide d’un souffleur d’air, ajoutez le milieu de la chambre à cellules et scellez la chambre avec de l’huile minérale des deux côtés afin d’éviter l’évaporation du milieu. Cela modifierait l’osmolarité pendant l’expérience.

Le système de micropipette utilisé dans ce dosage comprend trois sous-systèmes : un sous-système d'imagerie permettant d'observer, d'enregistrer et d'analyser les mouvements de la cellule aspirée par micropipette, un sous-système de micromanipulation permettant la sélection de cellules à partir de la chambre à cellules, et un sous-système de pression destiné à aspirer les cellules dans les micropipettes. L'élément central du sous-système d'imagerie est un microscope inversé équipé d'un objectif à immersion huile de 100 fois. Les images de l'objectif sont détectées par une caméra à dispositif à transfert de charge et transmises à un magnétoscope.

Une minuterie vidéo est couplée au système pour suivre le temps. Après avoir rempli la micropipette avec de l'eau déionisée, placez-la dans son support sur un entraînement mécanique monté sur le microscope. La micropipette peut être positionnée avec précision à l'aide d'un micromanipulateur hydraulique à trois axes.

Un des supports de micropipette est monté sur un translateur piézoélectrique programmé par ordinateur. Cela permet de déplacer la pipette avec précision et de réaliser un cycle de test d'adhésion. Le sous-système de régulation de pression est utilisé pour contrôler l'aspiration.

Pendant l'expérience, une ligne hydraulique relie le porte-micropipette à un réservoir de fluide. Un positionneur mécanique fin permet de manipuler précisément la hauteur du réservoir. Une fois la chambre assemblée, des micropipettes sont mises en place, les cellules sont injectées dans la chambre pour commencer le test, les cellules en interaction sont aspirées par les micropipettes respectives, puis le translateur électrique PSO est utilisé pour déplacer l'érythrocyte vers ou hors du contact avec le neutrophile, avec une surface et une durée de contact contrôlées.

Un événement d'adhérence est observé lorsque le globule rouge s'allonge lors de la séparation des cellules ; un événement sans adhérence correspond à l'absence d'allongement du globule rouge. Enregistrez les événements d'adhérence observés en ajoutant un pour l'adhérence ou zéro pour l'absence d'adhérence, dans une colonne d'un tableur Excel.

Enregistrez la courbe de la fréquence d'adhérence en fonction du temps de contact en utilisant au moins trois paires de cellules différentes pour chaque temps de contact. Pour obtenir une moyenne et une erreur standard de la moyenne (ESM) comme témoin, enregistrez la courbe de liaison non spécifique en utilisant des globules rouges revêtus de ligands appropriés et/ou en bloquant les ligands ou récepteurs à l’aide d’un inhibiteur fonctionnel spécifique. Des anticorps monoclonaux permettent de calculer la fréquence spécifique d’adhérence à chaque point de temps de contact en soustrayant la fréquence d’adhérence non spécifique.

Les données de fréquence d'adhésion spécifique en fonction du temps de contact sont ajustées à l'aide d'un modèle probabiliste décrivant une interaction unimoléculaire d'ordre deux dans le sens direct et d'ordre un dans le sens inverse entre une seule espèce de récepteurs et une seule espèce de ligands. Dans cette équation, KA est l'affinité en 2D. KA est la vitesse de dissociation en 2D.

MR et ML sont respectivement les densités du récepteur et du ligand, et AC est la surface de contact. L'ajustement de la courbe comporte deux paramètres, ac, k, a, et K off, car AC et KA sont regroupés et désignés collectivement comme l'affinité effective en 2D ; le produit de cette dernière par la vitesse de dissociation correspond à la vitesse effective d'association en 2D : AC K on est égal à AC KA multiplié par K off. On montre ici un exemple de détermination de l'intégrine alpha L bêta deux.

Densité d'expression à la surface des neutrophiles. Les neutrophiles ont d'abord été incubés avec un microgramme par millilitre d'E-sélectine Ig, puis avec des concentrations saturantes d'anticorps anti-CD11a humain conjugué au PE, un anticorps monoclonal, ou d'une IgG de souris appropriée comme témoin. Après une incubation de 30 minutes, les échantillons ont été lavés et analysés sur un cytomètre en flux selon les paramètres standards.

Perles de calibration en PE brillant. Le panneau A montre les histogrammes de fluorescence des perles de calibration ainsi que ceux des cellules traitées ou non traitées avec l'IG de sélectine E. La coloration par l'anticorps monoclonal spécifique CD11a est représentée par des courbes continues, et la coloration par l'anticorps de contrôle apparié d'isotype correspondant est représentée par des courbes en pointillés.

Le panneau B montre le processus de quantification de la densité. Le logarithme en base 10 a été calculé à partir de l'intensité fluorescente moyenne de chacune des quatre billes. Valeur du pic d'étalonnage issue du panneau A et nombre spécifique au lot de molécules de PE par bille.

Une régression linéaire du logarithme décimal du nombre de molécules de PE par bille en fonction du logarithme décimal de la fluorescence a été tracée pour les cellules sélectionnées à nouveau. Le log₁₀ fi est égal à 3,99, indiqué par le cercle bleu plein, et à 2,23, indiqué par le cercle bleu ouvert, pour l'anticorps monoclonal spécifique et l'anticorps de contrôle, respectivement. Lorsque l'équation linéaire pour X a été résolue, le nombre total d'alpha L bêta deux ou de neutrophiles a été calculé à 9 587.

La densité surfacique a été calculée à 43 sites par micron carré en utilisant un diamètre de 8,4 microns pour le neutrophile. Le graphique suivant montre la fréquence d'adhésion cumulative fi pour la liaison spécifique à une seconde et à 10 secondes. Les durées de contact ont été mesurées à partir de cycles répétés de tests d'adhésion entre des globules rouges revêtus de ICAM un et des neutrophiles humains exprimant l'intégrine alpha L bêta deux.

En revanche, on montre ici la fréquence d'adhérence en cours de déplacement fi pour la liaison non spécifique à des durées de contact d'une seconde et de dix secondes, mesurée à partir de cycles répétés de tests d'adhérence entre des globules rouges revêtus d'IgG humaine et des neutrophiles humains exprimant l'intégrine alpha L bêta deux. Ce dernier graphique illustre la cinétique des probabilités d'adhérence de I A un à l'intégrine alpha L bêta deux des neutrophiles ; les valeurs obtenues pour trois paires de cellules à chaque durée de contact ont été moyennées puis tracées en fonction de la durée de contact afin de contrôler la liaison non spécifique. Deux conditions différentes ont été utilisées.

Des globules rouges recouverts de l'anticorps de capture anti-TFC et incubés avec des IgG humaines au lieu de ICAM-1, ainsi que deux neutrophiles se liant à des globules rouges non recouverts de l'anticorps de capture. La liaison non spécifique, enregistrée sous forme de courbe témoin avec IgG humaines, a été utilisée pour obtenir une courbe de probabilité d'adhésion spécifique. Correction de la liaison non spécifique effectuée à l'aide de l'équation précédemment décrite.

La courbe corrigée de probabilité d'adhésion spécifique a été ajustée à l'aide d'un modèle d'ajustement. La courbe de probabilité d'adhésion spécifique a permis d'obtenir l'affinité de liaison effective. Un CKA égale 1,4 fois 10 à la puissance moins quatre micromètres à la puissance quatre et koff égale 0,3 s⁻¹.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer la cinétique des interactions récepteur-ligand lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules d'interaction I. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit les premiers essais, afin d'ajuster les densités du côté ligand de façon à ce que la fréquence d'adhésion se situe dans une gamme moyenne, et de se souvenir que le travail avec le sang et certains réactifs utilisés pour des traitements spécifiques, par exemple le sodium azoture et le DM, peut présenter des risques extrêmement élevés. Par conséquent, des précautions telles qu'une lecture attentive des fiches de données de sécurité (FDS) des réactifs et le port de gants pendant l'exécution de cette procédure sont obligatoires.