Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l'utilisation de pinces magnétiques

L’objectif global de cette procédure est d’étudier l’effet de la charge mécanique sur le clivage protéolytique de protéines uniques de manière très parallèle et rentable. Dans cette démonstration, le clivage du collagène par la métalloprotéinase matricielle est examiné dans un premier temps, des garnisseurs de collagène sont fixés à la lamelle de verre d’une cellule d’écoulement, suivie de la fixation de billes magnétiques de taille micrométrique aux molécules de collagène individuelles. La deuxième étape consiste à monter la cellule d’écoulement dans l’appareil de la pince à épiler magnétique et à vérifier que les billes non spécifiquement fixées ont été retirées de la surface de la lamelle.

Ensuite, la protéase est ajoutée aux cellules d’écoulement. La dernière étape consiste à déterminer le taux de protéolyse en surveillant le détachement des billes en temps réel. En mesurant les taux de détachement des billes à différentes concentrations et forces de protéase, il est possible de dériver des paramètres cinétiques zoologiques standard en utilisant des quantités infimes de substrat et de protéase.

De plus, cette technique fournit des informations uniques sur l’effet de la force mécanique sur le taux de protéolyse et sur les changements structurels de la protéine de substrat qui accompagnent le clivage. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes telles que les traces T optiques et la microscopie à force atomique, est que cette technique est à haut débit et rentable. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la force efficace sur le clivage protéolytique de protéines uniques, l’instrumentation et les techniques peuvent être appliquées à un large éventail de problèmes biophysiques, y compris l’effet de la force sur le repliement et la confirmation des protéines.

Commencez la préparation de la cellule d’écoulement en nettoyant les lamelles de recouvrement à l’aide de la sonication. Ajoutez les lamelles dans un petit récipient en verre capable de les contenir qui s’adapte à l’ator. Remplissez le récipient d’isopropanol et de sonicate dans un bain pendant 20 minutes et rincez les lamelles avec de grandes quantités d’eau déminéralisée.

Remplissez le récipient d’eau et de sonicate pendant 20 minutes. Après sonication, séchez, le couvercle se glisse dans un flux d’air filtré et exempt de poussière. Inspectez les lamelles et n’utilisez que celles qui ne laissent pas de taches.

Allumez doucement les lamelles de recouvrement pendant quelques secondes pour les nettoyer de la poussière et de l’humidité restantes en passant le couvercle. Se glisse à travers une flamme de gaz produite par un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle en raison d’un excès de chaleur. Cette étape permet d’éliminer les contaminants de surface résiduels.

Ensuite, utilisez du scotch double face pour fixer les deux lamelles ensemble. En coupant d’abord le ruban d’environ trois centimètres de longueur et 0,3 centimètre de largeur, fixez le ruban à une lamelle de 22 x 40 millimètres, en laissant un canal de 1,6 centimètre au milieu. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur la lamelle pour vous assurer que le ruban adhésif a bien adhéré.

L’appareil de pince magnétique a été construit par ce laboratoire à l’aide d’un support en L en aluminium avec un trou d’épingle d’un millimètre de diamètre et monté sur un traducteur vertical en Z pour moduler la hauteur de la pince à épiler. Deux aimants permanents en terres rares ont été fixés au support de chaque côté du sténopé pour créer le gradient de champ magnétique. Un bon calibrage du piège magnétique est essentiel à cette procédure.

Pour garantir le succès, nous utilisons deux méthodes différentes, comme indiqué dans cette section. Pour calibrer le piège magnétique, pour l’étalonnage, utilisez de l’ADN préalablement préparé à partir d’un phage Lambda, marqué à ses cinq extrémités principales et trois premières avec de la biotine et de l’oxygène, comme décrit dans le protocole écrit. Pour fixer d’abord l’ADN à la cellule d’écoulement, remplissez la cellule d’écoulement avec une solution d’oxygène et d’anticorps anti-D et laissez l’anticorps adhérer à la surface du verre pendant 15 minutes.

Ensuite, mangez la surface de la cellule d’écoulement pour empêcher le collage non spécifique de l’ADN en ajoutant une solution de BSA à la cellule d’écoulement. Notez que pour cette étape d’évaluation et toutes les étapes suivantes, le volume de réactif ajouté à la cellule d’écoulement doit être d’au moins deux fois. Le volume de la cellule d’écoulement, qui dans cette démonstration est de 75 microlitres, incube la cellule d’écoulement à température ambiante pendant 45 minutes.

Après avoir répété cette étape, ajoutez 50 pico molaires d’ADN lambda fonctionnalisé et laissez-le se fixer à la lamelle pendant 15 minutes, lavez l’excès d’ADN avec un XPBS. Enfin, ajoutez des billes super paramagnétiques enrobées de streptavidine et laissez-les se fixer à l’ADN immobilisé pendant 15 minutes. Dans cette démonstration, des billes de 2,8 micromètres sont utilisées.

Éliminez l’excès de billes avec un XPBS. Ensuite, effectuez l’étalonnage de la pince à épiler magnétique en déplaçant les aimants permanents à une position éloignée de la surface de l’échantillon. Placez ensuite la cellule d’écoulement préparée dans le microscope.

Déplacez les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d’écoulement. Choisissez le plan focal des billes fonctionnalisées Lambda DNA en vous concentrant sur les billes en les éloignant des deux surfaces de verre. Le plan focal correct est celui dans lequel les billes souhaitées ont un centre brillant.

Prenez une vidéo du mouvement du talon dont 80 hertz sont supérieurs pour 500 images. Rapprochez l’aimant de la surface de l’échantillon et enregistrez une vidéo du mouvement de la bille à chaque position. Pour les distances supérieures à cinq millimètres, déplacez-vous par incréments d’un millimètre pour les distances comprises entre un et cinq millimètres.

Déplacez-vous par incréments de 0,5 millimètre pour les distances inférieures à un millimètre, déplacez-vous par incréments de 0,25 millimètre Pour chaque ensemble de données, suivez le centre des perles à l’aide d’un ajustement gaussien 2D. Calcul de la force via les fluctuations browniennes comme décrit dans la procédure écrite. Confirmez la précision des forces en vérifiant le calcul de la force via un ajustement Lian du spectre de puissance.

Afin de trouver la fréquence de décroissance, la relation entre la force appliquée et la fréquence de décroissance peut être trouvée dans le texte précédant la fixation du peptide de collagène aux cellules d’écoulement, exprimer et purifier le peptide de collagène et les protéines MMP un. Commencez par ajouter la solution d’anticorps anti-micro dans la cellule d’écoulement et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l’anti-micro de se fixer à la surface de la cellule d’écoulement et d’empêcher la fixation non spécifique des protéines à l’aide de cinq milligrammes par millilitre. BSA Ajoutez 150 peptides de collagène picomolaire et laissez-le se fixer à l’anticorps via le ttag M pendant 45 minutes.

Lavez l’excès de collagène à l’aide d’un tampon PBS avant d’ajouter des billes de 2,8 micromètres à la cellule d’écoulement. Ils doivent être séparés de la division de streptocoque et de la solution de billes enrobées à l’aide d’aimants puissants, puis remis en suspension dans du PBS. Ce processus doit être répété trois fois.

Cette étape est essentielle pour que les billes de 2,8 micromètres se lient au peptide de collagène immobilisé en surface. Ensuite, ajoutez des billes super paramagnétiques enrobées de streptavidine streptovique et laissez-les se fixer aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Une fois que la cellule d’écoulement est assemblée avec du peptide de collagène et des billes magnétiques, imagez la cellule d’écoulement dans le piège magnétique.

Sous une force faible, une sous-population de billes est parfois faible, adhérant à la surface de manière non spécifique. L’application d’une force modeste garantit que ces billes sont libérées. Ajoutez de l’enzyme activée à la cellule d’écoulement.

Dans ce cas, la première MMP a été préactivée par l’ajout de 3,5 millimolaires de PMA et incubée à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Dès qu’une cellule d’écoulement est réintroduite dans l’appareil de la pince magnétique, enregistrez une vidéo couvrant plusieurs champs de vision, produisant généralement plusieurs centaines de billes attachées. Cette mesure correspond à un temps égal à zéro.

Répétez le même processus d’enregistrement de plusieurs champs de vision à des points de temps réguliers jusqu’à ce que toutes les billes se détachent ou qu’aucune autre protéolyse ne soit perceptible. Les pinces magnétiques ont été calibrées pour des billes d’un micromètre et de 2,8 micromètres. En utilisant à la fois l’amplitude des fluctuations browniennes observées et le calcul de la fréquence d’atténuation à différentes positions de l’aimant dans les expériences de protéolyse forcée, le nombre normalisé de billes restantes peut être tracé en fonction du temps pour trouver le taux de protéolyse.

Et ce processus peut être répété pour des concentrations et des forces enzymatiques variables. Les taux de protéolyse dépendent de la force appliquée. Les taux de protéolyse ont été déterminés à un pico Newton, 6,2 Pico Newtons et 13 Pico Newtons.

La fraction de billes non prouvées est supérieure à 15 minutes, reste approximativement constante à 0,25 dans différentes expériences. Dans notre cas, le test nous a permis de mesurer l’efficacité catalytique de MMP one en fonction de la force appliquée. En analysant les données, nous avons constaté que la triple hélice de collagène doit se dérouler localement avant la protéolyse.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Il est important de se rappeler qu’au moins 30 à 50 billes par combustible de vue sont nécessaires pour obtenir une bonne signification statistique de vos données. N’oubliez pas qu’une PMA peut être extrêmement dangereuse et que des précautions telles que des gants, des blouses de laboratoire et un masque facial doivent toujours être utilisées lors de la réalisation de cette expérience.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’effet de la force sur le clivage protéolytique de protéines uniques à l’aide d’une pince à épiler magnétique. La pince à épiler magnétique est un excellent outil pour comprendre les expériences biophysiques à molécule unique. Cette technique peut être étendue à d’autres combinaisons de protéases et de substrats.

De plus, des techniques similaires peuvent être utilisées pour comprendre la dynamique structurelle des protéines ainsi que pour comprendre d’autres protéines qui lient ou modifient l’ARN et/ou l’ADN.