Name: Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer lutilisation de pinces magnétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la mesure de la protéolyse à molécule unique par pinces magnétiques pour étudier l'effet de la charge mécanique sur le clivage enzymatique du collagène par MMP-1. Cette méthode parallèle et économique permet d'obtenir des données cinétiques précises.

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Ce travail a été soutenu par le Prix de carrière Burroughs Wellcome à l&#39;interface scientifique (ARD), le National Institutes of Health à travers le directeur du NIH Programme Innovateur Prix Nouveau 1-DP2-OD007078 (ARD), le William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), et le Stanford Cardiovascular Institute Jeune bourse pré-doctorale (JC). Les auteurs tiennent à remercier James pour le prêt Spudich équipement de microscopie.

1. Préparation des cellules de débit <ol><li> Lamelles (# 1.5, 22x22 mm et 22x40 mm, VWR) sont nettoyés à l'aide sonication. <ol><li> Ajouter les lamelles d'un petit récipient en verre capable de tenir les lamelles et le montage dans le sonicateur (voir étape 2). </li><li> Remplissez le récipient avec de l'isopropanol et sonifier dans un bain sonique pendant 20 minutes. </li><li> Jeter l'isopropanol et rincer les lamelles avec de grandes quantités d'eau déminéralisée produite par un appareil Barnsted MilliQ ou un dispositif similaire. Remplissez le récipient avec de l'eau et à une sonication pendant 20 minutes. </li><li> Après sonication, sécher les lamelles dans un flux d'eau filtrée, air exempt de poussière. Utilisez seulement des lamelles qui apparaissent propres (c.-à-pas de bavures). </li><li> Doucement la flamme des lamelles pour quelques secondes afin de les nettoyer de toute poussière et l'humidité restante: passer les lamelles à travers une flamme de gaz produite avec un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle en raison de l'excès de chaleur. Cette étape supprime la surface résiduellecontaminants. </li></ol></li><li> En utilisant du scotch double face, fixez les deux lamelles ensemble. Couper la bande ~ 3 cm de longueur et 0,3 cm de largeur. Attacher la bande sur la lamelle mm 22x40 laissant un canal 1,6 cm au milieu. Utiliser un embout de pipette pour appuyez doucement sur la lamelle afin de s'assurer que la bande a bien respecté. </li></ol> 2. Configuration magnétique Pince à épiler et d'étalonnage <ol><li> Pinces magnétiques ont été installés à l'aide permanents aimants de terres rares comme décrit précédemment 10,12. Un support en L en aluminium a été construit avec un trou d'épingle de 1 mm de diamètre et monté sur une verticale z-traducteur (Thorlabs) pour moduler la hauteur des pinces. Deux permanents de terres rares aimants sont fixés au support de chaque côté du trou d'épingle pour créer le piège magnétique (figure 1). </li><li> Préparation de l'ADN: l'ADN de phage lambda marqué à son extrémité 5 'et 3' extrémités avec de la biotine et la digoxigénine (IDT ADN, San Diego, CA) a été utilisée pour calibrer le magpinces magnétiques. <ol><li> Mélanger 50 uL de 4 nM λ-ADN avec 2 pi de 40 nM oligonucléotide conjugué biotine et de la chaleur à 60 ° C pendant 10 minutes. Puis, lentement, laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Ajouter ligase d'ADN selon les spécifications du fabricant et ligaturer à la température ambiante pendant 3 heures. </li><li> Ajouter 2 ul de 400 nM oligonucléotide digoxigénine conjugué et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. </li><li> Ajouter 1,5 pi de 10 mM d'ATP et continuer la ligature de l'oligonucléotide conjugué à la digoxigénine l'ADN-λ pendant 3 heures. </li><li> Retirez les oligonucléotides en excès et la ligase ADN à l'aide de 100 filtres de spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un total de l'échange de tampon de 1000 fois dans du tampon TE est suffisant pour éliminer les oligos excédentaires. Remarque: Il est important de ne pas utiliser des vitesses d'essorage&gt; 500xG parce qu'elle conduira à la tonte de l'ADN. </li><li> Examiner un échantillon de l'ADN par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7% pour que l'ADN in'est pas dénaturé ou cisaillés. </li><li> Mesurer la concentration de l'ADN. L'utilisation d'un Nanodrop spectromètre UV-Vis (Thermo Scientific) est recommandée car le volume d'échantillon disponible peut être très faible. </li></ol></li><li> Préparer les cellules de flux tel que décrit dans l'article 1. </li><li> Pour la fixation de l'ADN à la cellule de flux, ajoutez anticorps anti-digoxigénine (IgG de mouton; 1 pg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Allemagne) et de lui permettre d'adhérer à la surface du verre pendant 15 minutes. </li><li> Passiver la surface de la cellule d'écoulement pour empêcher le collage non spécifique de l'ADN par addition de 2 mg ml de BSA -1, 0,1% de Tween-20 dans du PBS 1x. Incuber à température ambiante pendant 45 minutes. </li><li> Répétez l'étape 2.5. </li><li> Ajouter 50 pM de fuctionalized λ-ADN et permettent d'attacher à la lamelle pendant 15 minutes. </li><li> Laver tout excédant d'ADN avec 1x PBS. </li><li> Ajouter billes superparamagnétiques recouvertes de streptavidine (billes 1 um = 2 pg mL -1; 2,8 um = perles 20 pg ml -1 </li><li> Laver excès de billes avec 1x PBS. </li><li> Magnétique d'étalonnage Brucelles <ol><li> Déplacer les aimants permanents à une position qui est éloignée de la surface d'échantillon (&gt; 15 mm). </li><li> Placez la cellule d'écoulement préparée dans le microscope. </li><li> Déplacer les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d'écoulement. </li><li> Choisissez le plan focal de λ-ADN billes fonctionnalisées en se concentrant sur les perles loin de surfaces de verre les deux. Le plan focale correcte est celui dans lequel les perles ont un centre souhaités lumineuse. </li><li> Prenez une vidéo du mouvement talon à 80 Hz ou plus pour 500 cadres. </li><li> Déplacer l'aimant plus proche de la surface d'échantillon. Pour les distances supérieures de 5 mm, déplacer par incréments de 1 mm. Pour les distances entre 1 et 5 mm, déplacer par incréments de 0,5 mm. Pour les distances inférieures à 1 mm, déplacer par incréments de 0,25 mm. </li><li> Répétez les étapes 2.11.5 et 2.11.6 à chaque position de l'aimant nouvelle. </li><li> Pour chaque ensemble de donnéesdéfinir, suivre le centre des billes en utilisant un ajustement 2D gaussien. </li><li> Calculer la force par l'intermédiaire des fluctuations browniennes en utilisant: </li></ol><img alt="Équation 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation 1"> où k B T est l'énergie thermique de Boltzmann, L est la longueur de λ-ADN, et &lt;x 2&gt; est la variance dans la position centroïde. <ol start="10"><li> Confirmez l'exactitude des forces en cochant la calcul de la force par l'intermédiaire d'un ajustement du spectre de puissance de Lorentz afin de trouver la fréquence Atténuation. Force appliquée est liée à la fréquence rolloff par la relation: </li></ol><img alt="Équation 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation 2"> Où 0 est la fréquence ƒ rolloff, a est le rayon de talon, et μ est la viscosité du fluide 12. </li></ol> 3. Pièce jointe Peptide de collagène pour Cellules à écoulement Afin de donner un exemple concret de l'application de notre méthodologie, nous décrivons les travaux récents de notre laboratoire qui caractérise la protéolyse d'un peptide modèle collagène trimérique. Nous prévoyons que cette approche générale peut être largement appliquée à d'autres protéines et polynucléotides. <ol><li> Le peptide modèle collagène consiste en une N-terminale 6x His-tag pour la purification, suivie par un code 5x myc, (PPM) de 10 à appliquer formation de triple hélice, le collagène a1 résidus 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), qui forment la MMP- une site de reconnaissance, la séquence foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), et un KKCK C-terminale de faciliter le marquage avec la biotine-maléimide. Foldon dérive de la protéine T4 fibritin-phage, et stabilise trimères modèle de collagène lorsqu'il est fondu à l'extrémité N - ou C-terminale 13,14. </li><li> Le peptide de collagène et de MMP-1 protéines ont été exprimées et purifiées comme décrit précédemment 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> Ajouter anti-myc (15 ug mL -1) à la cellule d'écoulement et incuber à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l'anti-myc à joindre à la surface de la cellule d'écoulement. </li><li> Passiver la cellule d'écoulement afin de prévenir de fixation non spécifique de protéines en utilisant 5 mg ml -1 BSA de la même manière que décrit dans l'étape 2.5. </li><li> Ajouter 150 peptide de collagène pM et lui permettre de joindre à l'anticorps par l'intermédiaire du tag myc pendant 45 minutes. </li><li> Laver excès de collagène à l'aide du tampon PBS. </li><li> Ajouter des billes de streptavidine superparamagnétiques revêtu (1 perles um = 2 pg mL -1 et 2,8 um = perles 20 pg mL -1) et de leur permettre de se fixer aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Les perles de 1 um doit être dilué à la concentration souhaitée dans du PBS. Les 3 perles um doit être séparé de la solution en utilisant des aimants puissants, alors en solution dans du PBS. Ce processus doit être répété 3 fois. Nous avons remarqué que cette étape est essentielle pour GEt les 3 perles um de se lier à la surface immobilisée peptide de collagène. </li></ol> 4. Essai protéolyse vigueur <ol><li> Une fois la cellule de flux est assemblé avec le peptide de collagène et des billes magnétiques, l'image de la cellule de flux dans le piège magnétique sous peu, ~ 1 pN vigueur. Dans notre expérience, une sous-population des perles est parfois faiblement collée à la surface d'une manière non-spécifique. L'application de la force modeste veille à ce que ces perles sont libérés. </li><li> Ajouter une enzyme activée à la cellule d'écoulement. Dans ce cas, MMP-1 a été pré-activée en ajoutant 3,5 mM APMA (4-aminophénylmercurique acétate) et incubées à 37 ° C pendant 3 heures. L'activation a été vérifiée par SDS-PAGE. </li><li> Dès que la cellule de flux est ré-introduit dans l'appareil magnétique pince à épiler, enregistrer une vidéo couvrant quelques champs de vue, généralement céder plusieurs centaines de perles attachées. Ce sera t = 0. </li><li> Répétez le même processus d'enregistrement de plusieurs champs de vue (alors qu'il rentrait to le même champ de vision) en des points de temps réguliers, jusqu'à ce que toutes les perles se détachent ou pas encore protéolyse est perceptible. </li><li> Kinetic analyse des données <ol><li> Compter les perles dans les différents domaines de vue à différents moments et de les moyenner. Normaliser le nombre de billes en divisant le nombre moyen de billes à chaque point temporel par le nombre de billes à l'instant t = 0. Cela garantit que nous pouvons comparer les taux de protéolyse à partir d'expériences différentes, parce que le nombre absolu de perles sera différent d'une expérience à. </li><li> Tracer le rapport en tant que fonction du temps. Dans ce cas, nous l'avons monté sur une décroissance exponentielle plus une constante. </li></ol><img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation 3"> où f (t) est le rapport des perles attachées (ou les molécules de collagène unproteolyzed), t est le temps, a est la fraction de billes attachés par une attache collagène, b est le taux de décroissance constante, et cest la fraction de billes qui sont attachés de manière non spécifique. <ol start="3"><li> La même expérience est répétée à force variable et les concentrations de MMP-1 pour élucider l'effet de la force sur la protéolyse du collagène par la MMP-1. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le protocole ci-dessus décrit une nouvelle utilisation de pinces magnétiques (Figure 1) pour étudier l'effet de la force sur la protéolyse enzymatique. Nous calibré la pince à épiler pour 1 pm et 3 perles um utilisant à la fois l'ampleur des fluctuations observées browniens et le calcul de la fréquence roll-off à des positions différentes aimant (Figure 2). Dans les expériences de protéolyse de force, la configuration est similaire, sauf que l'ADN est remplacé par du collagène (figures 3, 4). Le nombre normalisé de billes restantes peuvent être tracées en fonction du temps pour trouver les taux de protéolyse (Figure 5), et ce processus peut êtrerépétée pour différentes concentrations d'enzymes et des forces. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma du processus d'étalonnage piège magnétique (pas à l'échelle). Deux aimants permanents de terres rares créer un champ magnétique qui tire sur le bourrelet superparamagnétique. Traduire l'aimant de haut en bas permet de régler la force appliquée. Les perles sont imagées en utilisant un classique champ lumineux microscope avec la lumière qui traverse un trou d'épingle entre les deux aimants Encart:. Image prise avec un objectif 40x air. Les tranchants, des points ronds correspondent aux billes attachés à la surface de lamelle. Les objets out-of-discussion sont des perles détachées. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Graphiques de force calibrée en fonction de la distance aimant de la surface d'échantillon de 1 pm (gauche) et 2,8 microns (droite) de talons. Les données ont été ajustées à la fonction empirique <img alt="Équation4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation4"> , Où x est la distance entre l'aimant. Une = 31,8, b = 5,61, et c = 4,39 pour les billes 1 um et une = 140, b = 3,10 et c = 1,86 pour les bourrelets 3 um. Ces valeurs sont spécifiques à notre instrument spécifique et de la géométrie expérimentale, et chaque instrument doit être étalonné individuellement. Les barres d'erreur à chaque point représentent une variabilité ~ 10% en force appliquée sur un bourrelet à base de talon, en raison de la variabilité de la taille des billes. La force appliquée est proportionnelle au volume des perles, et le volume varie bourrelet ~ 9% par rapport à la moyenne (selon les spécifications du fabricant). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Configuration dosage force la protéolyse (Pas à l'échelle). Le modèle de trimère collagène est fixée à la surface de la lamelle intermédiaire myc / anti-myc conjugaison. Les billes revêtues de streptavidine superparamagnétiques sont attachés à des trimères de collagène par une liaison biotine-streptavidine. Activé MMP-1 coupes du collagène dans le temps, provoquant les billes de se détacher de la surface et de s'éloigner du plan focal. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Dessin schématique d'une protéolyse en fonction du temps. La caricature montre un champ de l'échantillon de vue au fil du temps que la protéolyse se produit. Au fil du temps, MMP-1 coupe le collagène et les perles se détacher et de s'éloigner du plan focal, sous l'influence du champ magnétique. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 5"> Taux de protéolyse Figure 5. Dépendent force appliquée 16. Montré sont données recueillies à 1,0 pN (3 uM MMP-1, noir), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rouge) et 13 pN (0,2 uM MMP-1; magenta). Les taux de protéolyse (paramètres de l'ajustement) sont les suivantes: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN), et 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). La fraction de perles unproteolyzed à des moments longs (&gt; 15 minutes) reste à peu près constante à ~ 0,25 travers différentes expériences. Les barres d'erreur correspondent à la statistique de Poisson, reflétant le nombre d'observations à chaque instant. L'erreur à chaque point temporel pour les billes n est le n 1/2. L'erreur dans la fraction de perles attachées a été calculé par erreur propagation.1 perles um ont été utilisées pour 1,0 et 6,2 pN pN expériences et 2,8 um perles ont été utilisés pour des expériences pN 13.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce protocole décrit une nouvelle utilisation d&#39;une technique seule molécule classique. Pinces magnétiques permettent à moyen et à haut débit des tests de molécules simples d&#39;une manière rentable. Cependant, comme toutes les techniques expérimentales il ya des défis et les pièges potentiels. Limitations de pinces magnétiques Par rapport à un piège optique de la résolution spatiale et temporelle d&#39;un appareil de MT est faible. En outre, les forces générées...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Micro couvercle en verre # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro couvercle en verre # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> ADN ligase T4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigénine </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Anticorps </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 streptavidine </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-aminophénylmercurique Acétate </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotine-maléimide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Marquée à la biotine oligo </td><td> IDT ADN </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> Digoxigénine marqué oligo </td><td> IDT ADN </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> Collagènegène du peptide </td><td> ADN 2.0 </td><td> Synthèse à façon </td></tr><tr><td> MMP-1 d&#39;ADNc </td><td> Base de données de Harvard plasmide </td><td></td></tr><tr><td> z-traducteur </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Contrôleur de servomoteur pour les traducteurs </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexée unique molécule mesures protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

La génération et la détection des forces mécaniques est un aspect omniprésent de la physiologie cellulaire, en rapport direct avec le cancer métastatique 1, 2 et athérogenèse cicatrisation de la plaie 3. Dans chacun de ces exemples, les cellules à la fois exercer une force sur leur environnement et, simultanément, par voie enzymatique de remodeler la matrice extracellulaire (MEC). L&#39;effet des forces sur ECM est donc devenue un domaine d&#39;intérêt considérable en raison de son importance biologique et médicale susceptible 4-7. Techniques molécules simples telles que le piégeage optique 8, microscopie à force atomique 9, et des pinces magnétiques 10,11 permettre aux chercheurs de sonder la fonction des enzymes au niveau moléculaire en exerçant des forces sur les protéines individuelles. Parmi ces techniques, pinces magnétiques (MT) sont remarquables par leur faible coût et à haut débit. MT exercer des forces dans la gamme de ~ 1-100 pN et peut fournir milliseconde résolution temporelle,qualités qui sont bien adaptés à l&#39;étude du mécanisme enzymatique à la molécule seul niveau 12. Nous rapportons ici un test MT hautement parallélisable pour étudier l&#39;effet de la force sur la protéolyse de molécules de protéines uniques. Nous présentons l&#39;exemple spécifique de la protéolyse d&#39;un peptide de collagène trimérique par la matrice métalloprotéinase 1 (MMP-1); cependant, ce test peut être facilement adapté à l&#39;étude d&#39;autres substrats et des protéases.

Dans cet article, nous décrivons l&#39;utilisation de pinces magnétiques pour étudier l&#39;effet de la force sur la protéolyse enzymatique à l&#39;échelle de la molécule unique d&#39;une manière hautement parallélisables.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

La génération et la détection des forces mécaniques sont des aspects omniprésents de la physiologie cellulaire, ayant une pertinence directe avec la métastase cancéreuse1, l'athérogénèse2...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier l'effet de la charge mécanique sur le clivage protéolytique de protéines individuelles de manière hautement parallèle et rentable. Dans cette démonstration, le clivage du collagène par la métalloprotéinase matricielle un est examiné dans un premier temps : des trimères de collagène sont fixés sur la lame de verre d'une cellule d'écoulement, puis des billes magnétiques de taille micrométrique sont attachées aux molécules individuelles de collagène. La deuxième étape consiste à monter la cellule d'écoulement dans l'appareil de pinces magnétiques et à vérifier que les billes fixées de manière non spécifique ont été éliminées de la surface de la lame. Ensuite, la protéase est ajoutée aux cellules d'écoulement. La dernière étape consiste à déterminer la vitesse de protéolyse en surveillant en temps réel le détachement des billes. En mesurant les taux de détachement des billes à différentes concentrations de protéase et à différentes forces, il est possible d'obtenir des paramètres cinétiques zoologiques standards en utilisant des quantités minimes de substrat et de protéase.En outre, cette technique fournit des informations uniques sur l'effet de la force mécanique sur la vitesse de protéolyse et sur les changements structuraux du protéine substrat qui accompagnent le clivage. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que les traces optiques T et la microscopie à force atomique réside dans sa capacité de traitement élevé et son faible coût. Bien que cette méthode permette d'obtenir des indications sur la force effective exercée lors du clivage protéolytique de protéines uniques, les instruments et techniques peuvent être appliqués à un large éventail de problèmes biophysiques, notamment l'effet de la force sur le repliement des protéines et la conformation.Commencez la préparation de la cellule d'écoulement en nettoyant les lamelles par sonication. Ajoutez les lamelles dans un petit récipient en verre pouvant les contenir et s'adaptant dans le bain de l'ator. Remplissez le récipient avec de l'isopropanol et soniquez pendant 20 minutes dans un bain ator, puis rincez les lamelles avec de grandes quantités d'eau déionisée.Remplir le récipient d'eau et soniquer pendant 20 minutes. Après la sonication, sécher les lamelles dans un courant d'air filtré exempt de poussière. Examiner les lamelles et n'utiliser que celles qui sont exemptes de traces.Flambez doucement les lamelles pendant quelques secondes afin de les nettoyer de toute poussière ou humidité résiduelle en faisant passer les lamelles à travers une flamme de gaz produite par un bec Bunsen, en prenant soin de ne pas déformer la lamelle à cause d'une chaleur excessive. Cette étape élimine les contaminants résiduels présents à la surface.Ensuite, utilisez du ruban adhésif double face pour fixer les deux lamelles ensemble. Commencez par découper le ruban sur une longueur d'environ trois centimètres et une largeur de 0,3 centimètre, puis appliquez-le sur une lamelle de 22 par 40 millimètres, en laissant un canal de 1,6 centimètre au milieu. Utilisez la pointe d'une pipette pour appuyer doucement sur la lamelle afin de vous assurer que le ruban adhère correctement.L'appareil de pinces magnétiques a été construit par ce laboratoire à l'aide d'un support en aluminium en forme de L comportant un orifice circulaire d'un millimètre de diamètre, monté sur un translateur vertical Z afin de moduler la hauteur des pinces. Deux aimants permanents en terre rare ont été fixés de part et d'autre de l'orifice sur le support afin de créer un gradient de champ magnétique. Un étalonnage correct du piège magnétique est essentiel à cette procédure.Pour garantir le succès, nous utilisons deux méthodes différentes décrites dans cette section. Pour étalonner le piège magnétique, utilisez l'ADN préparé précédemment à partir du phage Lambda, marqué à ses extrémités 5' et 3' par la biotine et la doxygénine, comme indiqué dans le protocole écrit. Pour fixer l'ADN sur la cellule d'écoulement, commencez par remplir la cellule d'écoulement avec une solution d'anticorps anti-doxygénine et laissez l'anticorps adhérer à la surface en verre pendant 15 minutes.Ensuite, bloquer la surface de la cellule à écoulement pour éviter l'adhérence non spécifique de l'ADN en ajoutant une solution de BSA dans la cellule à écoulement. Remarque : pour cette étape de blocage et pour toutes les étapes ultérieures, le volume du réactif ajouté dans la cellule à écoulement doit être au moins deux fois supérieur au volume de la cellule. Le volume de la cellule à écoulement, qui est dans cette démonstration de 75 microlitres, incuber la cellule à écoulement à température ambiante pendant 45 minutes.Après avoir répété cette étape, ajoutez 50 pico molaire d'ADN lambda fonctionnalisé et laissez-le s'attacher à la lame pendant 15 minutes, puis rincez l'excès d'ADN avec un XPBS. Enfin, ajoutez des billes superparamagnétiques revêtues de streptavidine et laissez-les s'attacher à l'ADN immobilisé pendant 15 minutes. Dans cette démonstration, des billes de 2,8 micromètre sont utilisées.Éliminer les billes en excès avec un XPBS. Ensuite, effectuer l'étalonnage des pinces magnétiques en déplaçant les aimants permanents vers une position éloignée de la surface de l'échantillon. Puis placer la cellule d'écoulement préparée dans le microscope.Placer les aimants permanents en position au-dessus de la cellule d'écoulement. Choisir le plan focal des billes fonctionnalisées par l'ADN Lambda en mettant au point sur les billes situées loin des deux surfaces de verre. Le plan focal correct est celui dans lequel les billes souhaitées présentent un centre brillant.Enregistrez une vidéo du mouvement des billes à une fréquence supérieure à 80 hertz pendant 500 images. Rapprochez l'aimant de la surface de l'échantillon et enregistrez une vidéo du mouvement des billes à chaque position. Pour des distances supérieures à cinq millimètres, avancez par incréments d'un millimètre entre les distances de un et cinq millimètres.Déplacez-vous par incréments de 0,5 millimètre pour des distances inférieures à un millimètre, déplacez-vous par incréments de 0,25 millimètre. Pour chaque jeu de données, suivez le centre des billes à l'aide d'un ajustement gaussien 2D. Calculez la force à partir des fluctuations browniennes comme décrit dans le protocole écrit. Vérifiez l'exactitude des forces en contrôlant le calcul de la force par un ajustement du spectre de puissance (ajustement de Lian).Afin de déterminer la fréquence de décrochage, la relation entre la force appliquée et la fréquence de décrochage peut être établie dans le texte précédent l'attachement du peptide de collagène aux cellules d'écoulement, exprimer et purifier les protéines peptide de collagène et MMP-1. Commencez par ajouter la solution d'anticorps anti-MIC à la cellule d'écoulement et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre à l'anticorps anti-MIC de s'attacher à la surface de la cellule d'écoulement. Bloquez la cellule d'écoulement pour éviter l'attachement non spécifique des protéines à l'aide de BSA à 5 milligrammes par millilitre. Ajoutez 150 picomolaires de peptide de collagène et laissez-le s'attacher à l'anticorps via la marque M ttag pendant 45 minutes.Éliminer l'excès de collagène à l'aide de tampon PBS avant d'ajouter les billes de 2,8 micromètres dans la cellule d'écoulement. Elles doivent être séparées de la solution de billes revêtues de streptavidine à l'aide d'aimants puissants, puis resuspendues dans du PBS. Ce processus doit être répété trois fois.Cette étape est essentielle pour permettre aux billes de 2,8 micromètres de se lier au peptide de collagène immobilisé à la surface. Ensuite, ajoutez les billes superparamagnétiques revêtues de streptavidine et laissez-les s'attacher aux molécules de collagène pendant 45 minutes. Une fois que la cellule d'écoulement est assemblée avec le peptide de collagène et les billes magnétiques, observez la cellule d'écoulement dans le piège magnétique.Sous une faible force, une sous-population des billes est parfois faible, adhérant à la surface de manière non spécifique. L'application d'une force modérée garantit que ces billes sont libérées. Ajoutez l'enzyme activée à la cellule d'écoulement.Dans ce cas, la MMP-1 a été pré-activée en ajoutant 3,5 millimolaire de PMAA et incubée à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Dès qu'une chambre d'écoulement est réintroduite dans l'appareil de pinces magnétiques, enregistrez une vidéo couvrant plusieurs champs de vision, produisant typiquement plusieurs centaines de billes attachées. Cette mesure correspond à un temps égal à zéro.Répétez le même processus d’enregistrement de plusieurs champs de vision à intervalles de temps réguliers jusqu’à ce que toutes les billes se détachent ou qu’aucune protéolyse supplémentaire ne soit observable. Les pinces magnétiques ont été étalonnées pour des billes d’un micromètre et de 2,8 micromètres. En utilisant à la fois l’amplitude des fluctuations browniennes observées et le calcul de la fréquence de coupure à différentes positions de l’aimant lors des expériences de protéolyse forcée, le nombre normalisé de billes restantes peut être tracé en fonction du temps afin de déterminer la vitesse de protéolyse.Et ce processus peut être répété pour différentes concentrations d'enzymes et forces. Les taux de protéolyse dépendent de la force appliquée. Les taux de protéolyse ont été déterminés à un piconewton, 6,2 piconewtons et 13 piconewtons.La fraction de billes non dégradées, supérieure à 15 minutes, reste approximativement constante à 0,25 entre différentes expériences. Dans notre cas, le test nous a permis de mesurer l'efficacité catalytique de la MMP-1 en fonction de la force appliquée. En analysant les données, nous avons constaté que l'hélice triple du collagène doit localement se dérouler avant la protéolyse.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Il est important de se rappeler qu'au moins 30 à 50 billes par champ d'observation sont nécessaires pour obtenir une bonne signification statistique de vos données. N'oubliez pas qu'un A PMA peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants, de blouses de laboratoire et de masques faciaux doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette expérience.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer l'effet de la force sur le clivage protéolytique de protéines uniques à l'aide de pinces magnétiques. Les pinces magnétiques constituent un excellent outil pour l'étude d'expériences biophysiques sur des molécules uniques. Cette technique peut être étendue à d'autres combinaisons de protéases et de substrats.En outre, des techniques similaires peuvent être utilisées pour comprendre la dynamique structurale des protéines ainsi que pour étudier d'autres protéines qui se lient ou modifient l'ARN et/ou l'ADN.

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Bioingénierie

Pinces magnétiques, une technique de manipulation de molécule unique puissante, peuvent être adaptés pour les mesures directes de la torsion (en utilisant une configuration appelée librement orbite pinces magnétiques) et le couple (en utilisant une configuration appelée pinces de couple magnétique) dans les macromolécules biologiques. Lignes directrices pour l'exécution de ces mesures sont donnés, y compris les applications à l'étude de l'ADN et des filaments nucléo-protéines associées.

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