Assay Repliement intracellulaire

L’objectif global de l’expérience suivante est de mesurer la protéine intracellulaire dépendante du chaperon, qui se replie après un choc thermique. À l’aide d’un rapporteur de luciférase, transfectez d’abord des cellules avec des plasmides enrobant le gène rapporteur de la luciférase et le chaperon d’intérêt. Ensuite, divisez les cellules transfectées pour les points de temps de récupération dans le plan expérimental.

Le lendemain, la chaleur choque les cellules pour induire le déploiement des protéines. Permettre la récupération pour retrouver le repliement intracellulaire des protéines, puis mesurer l’activité du rapporteur de la luciférase. Les résultats mesurent le repliement des protéines dépendant du temps et dépendant du chaperon sur la base du dosage de la luciférase.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de repliement in vitro, est la possibilité d’avoir une lecture physiologique de l’effet des composés ou des protéines sur l’activité chaperonne. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie d’un large éventail de maladies comme les maladies neurodégénératives ou le cancer, car les chaperons jouent un rôle important dans le développement de ces pathologies. Tout d’abord, préchauffez le milieu de culture, le PBS et la trypsine à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Laver une culture confluente de cellules HEK 2 93 avec cinq millilitres de PBS. Ensuite, appliquez un millilitre de trypsine contenant 0,025 % d’EDTA, tournez doucement la plaque pour une répartition uniforme de la trypsine et incubez à 37 degrés Celsius. Secouez périodiquement la plaque pour vérifier le détachement de la cellule.

Maintenant, suspendez les cellules dans 10 millilitres de milieu DMEM complet et transférez-les dans un tube de faucon de 50 millilitres. Ensuite, énumérez les cellules à l’aide d’une contre-plaque de Beckman. Les cellules ont une fluidité d’environ 60 à 70 % et incubent pendant six à huit heures.

Équilibrez le gène extrême, neuf réactifs à la température ambiante et l’aliquote du milieu libre sérique à 37 degrés Celsius. Pipetez le milieu sans sérum dans deux tubes einor. Ajoutez ensuite le réactif extreme gene nine sans toucher la paroi du tube einor, incubez pendant cinq minutes à température ambiante.

Pendant ce temps, préparez les mélanges de transfection NA 2D dans le premier tube, ajoutez la luciole vanille et un contrôle vectoriel vide dans le deuxième tube. Ajouter la luciole à la vanille et le chaperon moléculaire. Ajoutez l’ADN au réactif de transfection, mélangez le vortex et incubez à température ambiante pendant 20 minutes.

Continuez à ajouter ce mélange sur les cellules plaquées et incubez pendant 24 heures. Récoltez les cellules transfectées à l’aide de cellules de trypsine à 60 à 70 % de fluidité dans des plaques à six puits, et laissez-les dans l’incubateur pendant la nuit. Aspirez le milieu des cellules transfectées.

Ajoutez ensuite un millilitre de tampon anti-chaleur et incubez pendant 30 minutes. Pour arrêter la synthèse des protéines Denovo, scellez les couvercles avec des bandes de paraforme et incubez dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirez maintenant le paraform et replacez les cellules dans l’incubateur pour les récupérer à des moments précis.

Récoltez les cellules et lavez-les une fois dans du PBS Pour une lyse cellulaire efficace, congelez la pastille cellulaire dans de l’azote liquide, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse passive dilué. Maintenant, aliquote en trois exemplaires. 30 microlitres de lysat cellulaire par puits d’une plaque de 96 puits.

Afin d’évaluer l’efficacité de la transfection, commencez par les échantillons de référence non choqués. Pour mesurer l’activité de la luciférase exécutée, préparez du Lucifer frais de 0,2 millimolaire dans un tampon de réaction contenant un tampon de réaction A TP millimolaire et un tampon de réaction d’ezine de 0,2 micromolaire. Insérez la plaque à 96 puits dans le luminomètre et démarrez le programme.

Station de travail Wallach 1420. Introduisez la pompe dans le tube Falcon contenant 0,2 tampon de réaction d’ézine micromolaire. Choisissez dans le menu, l’option entretien du distributeur, et cochez la pompe.

Sélectionnez l’option Remplir pour modifier la disposition de la plaque. Choisissez l’option, explorez le protocole et les résultats dans le menu. Sélectionnez le protocole.

Sélectionnez maintenant les puits à lire. Retournez dans le gestionnaire Wallach et cliquez sur démarrer pour mesurer les émissions d’échantillons. À 482 nanomètres, procédez à l’entretien du distributeur et sélectionnez-en un vide et pompez pour libérer toute la solution résiduelle dans le tube.

Maintenant, déplacez le tube vers un faucon contenant de l’eau et cochez, rincez. Poursuivez en sélectionnant vide. Placez ensuite le tube de la pompe un dans le tampon de réaction et le tube de la pompe deux dans la solution LUCIFÉRIENNE.

Modifiez la disposition de la plaque. Sélectionnez remplir pour la première pompe et la deuxième pompe. Dans le menu de maintenance du distributeur, sélectionnez le protocole et commencez à mesurer la longueur d’onde de la réaction luciférase de 560 nanomètres.

À la fin de la répétition, répétez la procédure, vide, affleurant, vide. Pour la première pompe et la deuxième pompe, consultez les résultats dans le Wallach 1420 Explorer. Chaque expérience est associée à un essai.

Numéro Nom d’utilisateur Date de début et de fin Résultats de l’exportation sous forme de fichier Excel. Pour l’analyse, le repliement des protéines est directement lié au temps de récupération. Dans cette expérience, les cellules sont évaluées à différents moments après un choc thermique.

En l’absence et en présence d’un chaperon moléculaire. Comme prévu, le pourcentage de luciférase repliée augmente avec le temps de récupération prolongé chez les témoins et les cellules transfectées avec le chaperon moléculaire. En revanche, un ensemble de données non valide affiche des valeurs R au carré médiocres pour la corrélation entre le temps et le repliement.

Suite à cette technique, d’autres méthodes comme le dosage in vitro des TPA peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’inhibition de l’activité enzymatique du chaperon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les protéines intracellulaires. Nous suivons après le choc de l’attelage.