Name: Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Apprenez à cultiver des neurones sympathiques à partir de ganglions cervicaux supérieurs de rats périnataux et à induire leur croissance dendritique avec BMP-7 ou Matrigel. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse neuronale.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les avantages de ce modèle comprennent: (a) les cultures sont composées d&#39;une population homogène de neurones sympathiques dépourvus d&#39;autres types cellulaires 17,23; (b) les exigences du facteur de croissance des neurones sympathiques sont bien établies, ce qui permet l&#39;utilisation de milieu défini, et une variété de milieux définis, et les substrats fonctionnent bien pour la croissance et le maintien de neurones sympathiques 23; (c) les neurones dans ces cultures de répondre uniformém...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles de verre </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 mm lamelle ronde n ° 1 Epaisseur de verre allemand </td></tr><tr><td> Bent pipettes pointe </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-lysine </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Solution stock 1 mg / ml </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-pince Dumont ne. 4 et 5 </td><td> Outils belle science (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 aiguilles de calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz milieu L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hank solution de sel équilibrée (Ca-,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM faible taux de glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> L&#39;insuline / transferrine / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Des acides gras libres BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Bioproduits Harlan </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Jambon support F-12 nutriment (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Cytosine arabinoside </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Éviter la répétition des cycles gel-dégel </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> PGO 4, 5 et 6 de travailler tout aussi bien que la BMP-7 et sont parfois plus faciles à obtenir dans le commerce </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pêcheur </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-rat MAP2 anticorps </td><td> Sternberg monoclonaux Inc </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 de chèvre anti-souris </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Milieu de montage </td><td> Prolongez sondes moléculaires kit Antifade </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

La forme de la dendritique arbre détermine l&#39;apport total synaptique d&#39;un neurone peut recevoir 1-3, et influe sur les types et la distribution de ces intrants 4-6. Modification des modes de croissance dendritique et la plasticité sont associés à la fonction neurocomportementale avec facultés affaiblies dans les modèles expérimentaux 7, et sont pensés pour contribuer à des symptômes cliniques observés dans les deux troubles neurodéveloppementaux 8-10 et les maladies neurodégénératives 11-13. Ces observations soulignent l&#39;importance fonctionnelle de la régulation précisément la morphologie dendritique, et suggèrent que l&#39;identification des mécanismes qui contrôlent la croissance dendritique ne sera pas seulement faire progresser la compréhension de la façon dont la connectivité neuronale est régulée au cours du développement normal, mais peut également donner un aperçu sur les nouvelles stratégies thérapeutiques pour diverses maladies neurologiques. Des études mécanistiques de la croissance dendritique serait grandement facilitée par la disponibilité osystème modèle FA qui permet aux neurones à titre expérimental est passé d&#39;un état ​​dans lequel ils ne s&#39;étendent pas aux dendrites celui dans lequel ils élaborent un arbre dendritique comparable à celle de leur homologues dans les in vivo. Les cultures primaires de neurones sympathiques dissociés de ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rongeurs périnatales fournir un tel modèle. Lorsqu&#39;elle est cultivée dans un milieu défini en l&#39;absence de sérum et les cellules gliales ganglionnaire, les neurones sympathiques d&#39;étendre un processus unique qui est axonale, et cet état ​​persiste pendant unipolaire semaines à plusieurs mois dans la culture 14,15. Cependant, l&#39;ajout de protéines soit morphogénétique osseuse-7 (BMP-7) 16,17 ou 18 à Matrigel le milieu de culture déclenche ces neurones d&#39;étendre les processus multiples qui répondent aux critères morphologiques, biochimiques et fonctionnelles pour les dendrites. Neurones sympathiques dissociés de la CTB de rongeurs périnatales et cultivés dans des conditions définies sont une population homogène de neurones 19qui répondent de manière uniforme à l&#39;activité dendrite-promotion de Matrigel, BMP-7 et autres PGB de la decapentaplegic (DPP) et 60A sous-familles 17,18,20,21. Important, le Matrigel-et BMP-induite dendrite formation se produit en l&#39;absence de changements de la survie des cellules ou la croissance des axones 17,18. Ici, nous décrivons comment mettre en place des cultures dissociées de neurones sympathiques provenant de la CTB de rats périnatales afin qu&#39;ils soient adaptés à l&#39;sélective dendrite-promotion de l&#39;activité de Matrigel ou MPG.

Nous décrivons un protocole pour l&#39;utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

La forme de l'arborisation dendritique détermine l'apport synaptique total qu'un neurone peut recevoir 1-3, et influence les types et la distribution de ces apports...

L'objectif de cette procédure est de cultiver des neurones sympathiques afin de pouvoir manipuler leur croissance dendritique. Cela est réalisé en isolant d'abord les ganglions cervicaux supérieurs de jeunes rongeurs péri-natals dans des conditions stériles. La deuxième étape consiste à dissocier les ganglions afin d'obtenir une suspension monocellulaire, qui est ensuite ensemencée sur les substrats préparés.Milieu défini Inde. Ensuite, après avoir traité les cultures avec un anti-mitotique afin d'éliminer les cellules non neuronales, traiter les cultures avec des BMP ou du Matrigel pour induire la croissance dendritique. Enfin, une double immunoréactivité est utilisée pour visualiser les dendrites étendues des neurones sympathiques en culture.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la culture primaire de neurones hippocampiques, réside dans la possibilité de manipuler l'état morphologique des neurones DYS de telle sorte que moins de 5 % des neurones en culture possèdent des dendrites, ou que plus de 95 % des neurones en culture présentent une forte élongation axonique. Pour préparer les cultures associées du ganglion cervical supérieur (SCG) à partir de ratons prénatals âgés de 19 à 21 jours embryonnaires, rasez d'abord l'abdomen d'un rat gravide euthanasié, désinfectez la peau avec de l'éthanol 70 %, puis retirez les cornes utérines en conditions stériles en évitant d'endommager les intestins ou d'autres organes internes. Placez les cornes utérines dans une boîte de Petri stérile de 150 millimètres. Ensuite, transférez la boîte de Petri dans un récipient contenant de la glace.Pour anesthésier les embryons afin d'euthanasier le petit, sectionner la moelle épinière le long de la ligne médiane sous les épaules. Cela sectionne également la veine cave, ce qui réduirait les saignements de l'artère carotide. Pendant la dissection du ganglion cervical supérieur, placer les embryons dans un milieu Leibovitz L-15 stérile supplémenté en pénicilline et en streptomycine. Ensuite, transférer les embryons dans une boîte de Pétri de 150 millimètres, à moitié remplie de Sil-Gard, et les placer sur le dos.Utilisez des aiguilles stériles de calibre 20 pour piquer le thorax et la tête en hyperextendant doucement le cou afin de faciliter la dissection du ganglion cervical supérieur (SCG) au microscope. Pratiquez une incision médiane le long du cou au niveau des clavicules pour découvrir les glandes sous-maxillaires. Retirez les glandes à l’aide de pinces fines afin d’exposer la couche musculaire.Ensuite, sectionner le muscle sterno-cléido-mastoïdien près de la clavicule, en soulevant délicatement le muscle omohyoïdien adjacent à la trachée. Ce muscle est très mince ; veiller à ne pas couper trop profondément afin d'éviter de déchirer l'artère carotide et le ganglion cervical supérieur (SCG) situés en dessous. Une fois ces couches musculaires retirées, l'artère carotide et le nerf vague doivent être clairement visibles.Le ganglion cervical supérieur se situe juste en dessous de la bifurcation de l'artère carotide. Disséquer le tissu des deux côtés de l'artère carotide à l'aide de pinces fines afin d'exposer le ganglion. Ensuite, utiliser deux pinces fines pour saisir l'artère carotide juste au-dessus et au-dessous respectivement du pôle rostral et du pôle caudal du ganglion cervical supérieur.Pour retirer la section de l'artère carotide située au-dessus du GCS ainsi que le GCS lui-même, il est probable que le ganglion plexiforme, qui se trouve à ce stade du développement en regard du GCS, soit également éliminé lors de cette étape. Placer le tissu disséqué dans une boîte de culture stérile de 35 millimètres contenant du milieu L 15 et des antibiotiques. Ensuite, retirer le GCS de tous les petits avant de passer aux étapes suivantes.Ensuite, séparez délicatement le ganglion cervical supérieur de l'artère carotide et de tout autre tissu. Éliminez-les pendant la dissection. Retirez la capsule des ganglions.Ensuite, transférez les ganglions vers une autre boîte stérile de 35 millimètres contenant du milieu L 15. Pour dissocier le GCS, retirez le milieu L 15. Remplacez-le par une solution de Hank équilibrée sans calcium ni magnésium, contenant de la collagénase dys.Incubez ensuite à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Transférez ensuite le SCG dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Amenez le volume à 10 millilitres avec du L15 supplémenté de BSA à une concentration finale d'un à deux milligrammes par millilitre.Centrifuger à 200 fois G à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes, éliminer le surnageant et laver une fois de plus avec le milieu L 15 supplémenté en BSA après le deuxième lavage. Retirer le milieu L 15 et reprendre les ganglions dans deux millilitres de milieu de culture.Trier le milieu des cellules environ trois à quatre fois à l’aide d’une pipette à embout courbé poli à la flamme. S’assurer que la pipette est préalablement recouverte de BSAL 15 avant le tri afin de minimiser l’adhérence des cellules au verre. Laisser les gros agrégats se déposer pendant environ une minute, puis transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.Ajouter ensuite davantage de milieu de culture aux SCG restants et au troisième passage. Une fois les agrégats sédimentés, transférer la suspension cellulaire du deuxième passage vers celle recueillie après le premier passage. Répéter ce processus plusieurs fois jusqu'à ce que les ganglions soient majoritairement dissociés.Jetez tous les agrégats restants après la quatrième centrifugation. Pour les cellules dissociées à partir d'un litre de ratons, le volume total du milieu dans la suspension cellulaire doit être ajusté à huit à 10 millilitres. En ajoutant du milieu de culture supplémentaire, resuspendez délicatement les cellules à l’aide d’une pipette. Ensuite, prélève un petit aliquot pour la détermination de la densité cellulaire.Ajustez le volume de la suspension cellulaire afin d'obtenir une densité cellulaire deux fois supérieure à celle souhaitée en culture. Ensuite, répartissez 250 microlitres de suspension cellulaire par puits. Pour les études morphométriques de la croissance dendritique, nous ensemencions généralement les cellules dans des plaques de 24 puits à faible densité, environ cinq fois 10 puissance quatre cellules par puits.Ensuite, placez les cultures de SCG sur la plaque en porcelaine pour dessiccateur dans le dessiccateur en verre contenant de l'eau stérile. Injectez environ 120 millilitres de dioxyde de carbone dans le dessiccateur avant de le fermer hermétiquement. Après cela, placez l'ensemble du dessiccateur dans une étuve et réglez-la à 35,5 degrés Celsius.Dans cette procédure, nourrissez la culture en renouvelant la moitié du milieu 24 heures après la mise en culture, et répétez cette opération trois fois par semaine afin d'éliminer les cellules non neuronales de la culture. L'agent anti-mitotique, RRC, à une concentration d'un à deux micromolaire, est généralement ajouté au milieu de culture à ce moment-là.Ensuite, ajouter le milieu de culture frais contenant le RSC dans chaque puits et cultiver pendant 48 heures afin d'induire la croissance dendritique après élimination des cellules non neuronales et réduction significative du taux de RSC. Ajouter du Matrigel ou de la BMP sept au milieu de culture au jour cinq. In vitro, nourrir ensuite la culture comme décrit précédemment, illustré ici par un neurone développé dans des conditions témoins, présentant un manque de dendrites, comme en témoignent l'absence de prolongements immuno-positifs pour la MAP deux.En revanche, ce neurone, qui a été exposé à la BMP-7, présente plusieurs dendrites immuno-positives pour la MAP2 à extrémités effilées, visibles ici. Les neurones sympathiques en culture sont cultivés pendant cinq à sept jours avant le traitement par la BMP-7, suivi d'une exposition à la BMP-7 à une concentration de 30 à 50 nanogrammes par millilitre pendant deux jours. Remarquez le début de la croissance dendritique.Les cultures sont cultivées pendant sept à 14 jours en l'absence de bmp.Seven. Elles continuent d'exhiber uniquement une croissance axonale, tandis que les cultures traitées avec BMP.Seven à 30 à 50 nanogrammes par millilitre pendant sept à 14 jours.Présenter une croissance dendritique robuste. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler le ganglion cervical supérieur. Préparer une culture dissociée de neurones sympathiques pour l'étude de la morphogenèse neuronale et manipuler expérimentalement la croissance dendritique.

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C'est un protocole décrivant la façon d'isoler et de culture primaire de neurones sympathiques des ganglions cervicaux supérieurs (GCS) de ratons nouveau-né.

Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)

De nombreuses études récentes ont identifié des mutations dans les protéines synaptiques associés à des pathologies cérébrales. Primaire des cultures de neurones corticaux offrent une grande flexibilité dans l'examen des effets de ces protéines associées à la maladie sur la morphologie des épines dendritiques et la motilité.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Cette vidéo présente une méthode in vitro pour générer des neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Les hPSC sont différenciées en cellules de crête neurale (NCC) sur un support de matrice de membrane basale à l’aide d’un milieu de différenciation. Les NCC sont ensuite dissociés et formés en sphéroïdes à l’aide d’un autre milieu de différenciation. Enfin, les sphéroïdes sont transformés en neurones sympathiques postganglionnaires à...

Génération de neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

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Stimulation des neurones sensoriels du ganglion de la racine dorsale à l’aide d’un agoniste du récepteur neuropeptide

Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.

Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

Nous décrivons l’isolement, la dispersion et le placage des cellules primaires de pulpe dentaire (DP) avec les neurones trigéminaux (TG) cultivés au-dessus des filtres transwell. Les réponses cellulaires des cellules DP peuvent être analysées avec l’immunofluorescence ou l’analyse d’ARN/protéine. L’immunofluorescence des marqueurs neuronaux avec la microscopie confocale permet l’analyse des réponses de excroissance neurite.

Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Apprenez à cultiver des neurones sympathiques à partir de ganglions cervicaux supérieurs de rats périnataux et à induire leur croissance dendritique avec BMP-7 ou Matrigel. Cette méthode permet d'étudier la morphogenèse neuronale.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

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