Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Le but de cette procédure est de cultiver des neurones sympathiques afin de pouvoir manipuler leur croissance dendritique. Ceci est accompli en isolant d’abord les ganglions cervicaux supérieurs des petits rongeurs périnataux dans des conditions stériles. La deuxième étape consiste à dissocier les ganglions pour former une suspension unicellulaire qui est plaquée sur les substrats préparés.

Inde défini moyen. Ensuite, après avoir traité les cultures avec des anti-mitotiques pour éliminer les cellules non neuronales, traitez les cultures avec des BMP ou du matrigel pour induire la croissance dendritique. En fin de compte, l’immunoréactivité de la carte deux est utilisée pour montrer les dendrites étendues des neurones sympathiques en culture.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la culture primaire de neurones de l’hippocampe, est qu’il est possible de manipuler l’état morphologique des neurones DYS de telle sorte que moins de 5 % des neurones en culture ont des dendrites, ou plus de 95 % des neurones en culture présentent une excroissance ntique robuste Pour préparer les cultures associées de la SCG à partir des petits rats prénataux à 19 à 21 jours embryonnaires, Rasez d’abord l’abdomen d’une rat enceinte euthanasiée, nettoyez l’éthanol 70 % sans peau, puis retirez les cornes utérines dans des conditions stériles et évitez d’endommager les intestins ou d’autres organes internes. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri stérile de 150 millimètres. Ensuite, transférez la boîte de Pétri sur une casserole de glace.

Pour anesthésier les petits embryonnaires afin d’euthanasier le chiot, coupez la moelle épinière le long de la ligne médiane sous son épaule. Cela coupe également la veine caverneuse, ce qui réduirait les saignements de l’artère carotide Lors de la dissection de la SCG, placez les embryons dans un milieu L 15 stérile de Leibovitz complété par de la pénicilline et de la streptomycine. Transférez ensuite les embryons dans une boîte de Pétri de 150 millimètres, à moitié remplie de sil guard et placez-les sur leur dos.

Utilisez les aiguilles stériles de calibre 20 pour épingler le thorax et la tête, en hyperétendant doucement le cou afin de faciliter la dissection de la SCG au microscope. Faites une incision médiane le long du cou au niveau des clavicules pour révéler les glandes sous-maxillaires. Retirez les glandes à l’aide de pinces fines afin d’exposer la couche musculaire.

Ensuite, coupez le muscle sterno-cléido-mastoïdien près de la clavicule, en soulevant doucement le muscle omohyoïdien à côté de la trachée. Ce muscle est très fin, évitez donc de couper trop profondément, ce qui déchirerait l’artère carotide sous-jacente et la SCG. Une fois ces couches musculaires retirées, l’artère carotide et le nerf vague devraient être clairement visibles.

Le SCG se trouve juste en dessous de la bifurcation de l’artère carotide émoussée. Disséquez le tissu des deux côtés de l’artère carotide avec la pince fine afin d’exposer le ganglion. Ensuite, à l’aide de deux pinces fines, saisissez l’artère carotide juste au-dessus et en dessous du cristallin rostral et cordal du SCG respectivement.

Pour enlever la section de l’artère carotide située au-dessus de la SCG ainsi que la SCG elle-même, il est probable que le ganglion du nœud coulant, qui se trouve à côté de la SCG à ce stade de développement, sera également retiré à cette étape. Placez le tissu disséqué dans une boîte de culture stérile de 35 millimètres contenant du milieu L 15 et des antibiotiques. Après cela, retirez le SCG de tous les chiots avant de passer aux étapes suivantes.

Ensuite, séparez doucement le SCG de l’artère carotide et de tout autre tissu. Retirer pendant la dissection. Retirez la capsule des ganglions.

Transférez ensuite les ganglions dans une autre boîte stérile de 35 millimètres contenant du milieu L 15. Pour dissocier le SCG, prélever le milieu L 15. Remplacez-le par une solution de tri d’équilibre sans collagénase dys de calcium et de magnésium.

Ensuite, incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Après cela, transférez le SCG dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 millilitres. Portez le volume à 10 millilitres avec du L 15 complété par du BSA à une concentration finale d’un à deux milligrammes par millilitre.

Centrifuger à 200 fois G à température ambiante pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, jetez le supinate et lavez-le à nouveau avec du L 15 complété par du BSA après le deuxième lavage. Retirez le milieu L 15 et rincez les ganglions dans deux millilitres de culture.

Moyenne, tri notez les cellules environ trois à quatre fois à l’aide d’une pipette à pointe courbée polie au feu. Assurez-vous que la pipette est recouverte d’un BSAL 15 avant le TRI afin de minimiser l’adhérence des cellules au verre. Laissez les gros amas se déposer pendant environ une minute, puis transférez la suspension cellulaire dans un cône de 15 millilitres.

Par la suite, ajoutez plus de milieu de culture au SCG et au taux de tri restants. Une fois que les touffes se sont déposées, transférez la suspension cellulaire du deuxième tri à celle recueillie après le premier tri. Répétez ce processus plusieurs fois jusqu’à ce que les ganglions soient presque dissociés.

Jetez tous les amas restants après le quatrième tri pour les cellules dissociées d’un litre de petits rats, le volume total de milieu dans la suspension cellulaire doit être porté à huit à 10 millilitres. En ajoutant du milieu de culture supplémentaire, remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Prélevez ensuite une petite aliquote pour déterminer la densité cellulaire.

Ajustez le volume de la suspension cellulaire afin d’obtenir deux fois la densité cellulaire souhaitée dans la culture. Ensuite, aliquote 250 microlitres de suspension cellulaire par puits. Pour les études morphométriques de la croissance dendritique, nous plaquons généralement les cellules dans 24 plaques de puits à faible densité, environ cinq fois 10 des quatre cellules par puits.

Placez ensuite les cultures SCG sur la plaque de dessiccation en porcelaine dans la dessiccature en verre contenant de l’eau stérile. Injectez environ 120 millilitres de dioxyde de carbone dans le dessiccateur avant de le fermer. Après cela, placez l’ensemble du dessiccation dans un incubateur et réglez-le à 35,5 degrés Celsius.

Dans cette procédure. Nourrissez la culture en remplaçant la moitié du milieu 24 heures après le placage et répétez l’opération trois fois par semaine pour éliminer les cellules non neuronales de la culture. L’agent anti-mitotique, RRC, sous forme de concentration d’une à deux micromolaires, est généralement ajouté au milieu de culture à ce moment-là.

Ajoutez ensuite le milieu de culture frais avec RSC dans chaque puits et cultivez pendant 48 heures pour induire la croissance dendritique après que les cellules non neuronales ont été éliminées et que le niveau de RSC a été considérablement réduit. Ajouter le matrigel ou le BMP sept au milieu de culture le cinquième jour. In vitro, puis nourrir la culture comme décrit précédemment, montré ici comme un neurone cultivé dans les conditions de contrôle avec l’absence de dendrites, comme en témoigne l’absence de MAP, deux processus immunopositifs.

En revanche, ce neurone, qui a été exposé à BMP sept, présente plusieurs dendrites immunopositives effilées montrées ici. Les neurones sympathiques en culture sont de cinq à sept jours en culture avant le traitement avec BMP sept et après le traitement avec BMP sept à 30 à 50 nanogrammes par millilitre pendant deux jours. Remarque, le début de la croissance dendritique.

La culture a poussé pendant sept à 14 jours en l’absence de bmp. Sept. Continuer à ne présenter qu’une croissance axonale pendant que les cultures sont traitées avec BMP. Sept. À 30 à 50 nanogrammes par millilitre pendant sept à 14 jours.

Présente une croissance dendritique robuste. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler SCG. Préparer la culture dissociée de neurones sympathiques pour l’étude de la morphogenèse neuronale et manipuler expérimentalement l’excroissance dendritique.