Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l'aide Débitmétrie photoacoustique

L'objectif de l'expérience suivante est de détecter la présence d'un cancer avant la formation de tumeurs secondaires. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant et en séparant des échantillons sanguins de patients atteints de mélanome au stade quatre. Dans un deuxième temps, le sang est introduit dans une chambre d'écoulement photoacoustique, ce qui permet la détection et l'isolement des cellules de mélanome.

Ensuite, les cellules capturées sont imagées afin de confirmer la présence de mélanome détecté. Les résultats démontrent la capacité du système à détecter et isoler précisément et rapidement les cellules de mélanome à l’aide de formes d’ondes photoacoustiques et de techniques d’imagerie cellulaire. Le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes de détection des cellules circulantes de mélanome, telles que la R-T-P-C-R, le tri magnétique cellulaire et d'autres méthodes, est qu'elle est sans étiquetage et permet la capture des cellules circulantes de mélanome sans modifier leur surface ni les fixer sur un substrat.

Pour préparer un échantillon en vue de la détection d'un cancer métastatique, commencez par prélever environ 10 millilitres de sang total à partir d'un patient atteint d'un cancer de stade quatre. Dans deux tubes vacutainer de cinq millilitres, centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 3000 tr/min. L'échantillon de sang se séparera en trois couches distinctes. La couche inférieure est constituée des érythrocytes.

La couche intermédiaire, également appelée couche de buffy coat, contient les leucocytes et les cellules de mélanome, et la couche supérieure contient le plasma et les plaquettes. Retirez autant de plasma que possible sans perturber le buffy coat. Ajoutez 250 microlitres de son opaque 10 77 à des tubes de 2 millilitres.

À l’aide d’une pipette pasteur de neuf pouces, prélevez le plasma restant, tout le buffy coat et la couche supérieure des érythrocytes, en veillant à recueillir moins de 500 microlitres. Transférez la solution dans les tubes wind Trobe préparés précédemment.

Le sang va de nouveau se séparer, mais cette fois les érythrocytes seront séparés par le hispa, permettant une extraction facile de la couche buffy. Utilisez une pipette Pesa de neuf pouces pour isoler entièrement la couche buffy et placez-la dans un tube eend orph de deux millilitres. Ensuite, suspendez-la dans 1,5 millilitre de PBS avec 2 % volume par volume entre 20.

Pour construire une chambre d'écoulement, commencez par un cylindre en acrylique de huit millimètres de long, ayant un diamètre extérieur de 20 millimètres et un diamètre intérieur de 17 millimètres. Ensuite, percez trois trous de cinq millimètres de diamètre à travers le côté du cylindre, espacés d'angles de 90 degrés les uns par rapport aux autres. Puis, coupez trois morceaux de tube polymère et insérez-les dans les trous percés.

Étirez du film parafilm sur le fond de l'anneau en acrylique afin de créer une étanchéité. Le parafilm formera une cuvette peu profonde avec l'anneau en acrylique et retiendra la solution d'acrylamide qui constituera une chambre d'écoulement. Passez un fil de 1,6 millimètre de diamètre à travers les morceaux de tubulure directement opposés l'un à l'autre, en veillant à ce que seul le fil soit visible au milieu de l'anneau, à travers la troisième pièce de tubulure.

Insérez un fil de 1,6 millimètre de diamètre et positionnez le tube à un millimètre du fil suspendu. Ces fils empêchent l'acrylamide d'entrer dans le tube. Préparez cinq millilitres d'acrylamide.

Versez ensuite rapidement le mélange dans l'anneau acrylique, en le remplissant jusqu'au bord. Après quelques secondes, la solution gélifie. Pour fabriquer un moule de chambre à écoulement, retirez soigneusement les fils en veillant à ne pas perturber le gel d'acrylamide, laissant ainsi un trajet d'écoulement cylindrique et un emplacement pour positionner une fibre optique focalisée sur ce trajet.

La chambre d'écoulement est désormais prête à être utilisée avec du gel à ultrasons sur le plan acoustique. Coupler un transducteur acoustique piézoélectrique en fluorure de polyvinylidène au-dessus du trajet d'écoulement directement sur la chambre d'écoulement. À l'aide d'un câble bayonet neo cons ou BNC, relier le transducteur à l'entrée d'un récepteur large bande.

Reliez la sortie du filtre à l'oscilloscope pour déclencher ce dernier. Placez une photodiode près du transducteur et utilisez un câble B NNC pour la brancher à l'oscilloscope. Extrayez le petit tube de la chambre d'écoulement jusqu'à ce qu'une petite poche d'air se forme, puis couplez-le au transducteur.

Insérez ensuite la fibre optique et remplissez la poche d'eau afin de réduire les signaux d'interface et d'augmenter la quantité de lumière laser appliquée au trajet d'écoulement. En raison de l'ouverture numérique de la fibre optique et de la courte distance qui la sépare du trajet d'écoulement, le laser n'irradiera qu'un seul bouchon d'échantillon à la fois, garantissant ainsi que l'échantillon directement en face du laser soit bien celui qui génère les signaux photoacoustiques.

Ensuite, fixez un raccord en T à un bras de la chambre d'écoulement et deux pompes à seringue aux autres branches du raccord. Une seringue contient de l'air, tandis que l'autre contiendra la suspension cellulaire préparée précédemment. Démarrez ensuite les deux pompes à seringue.

Lorsque les deux fluides admissibles atteignent la jonction en T, ils sont divisés en bouchons homogènes et s'écoulent devant le transducteur. Illuminez l'échantillon en écoulement avec un laser à impulsions nanosecondes pour générer des ondes photoacoustiques dans les cellules de mélanome. Étant donné que la mélanine est un absorbeur optique large bande, n'importe quelle longueur d'onde laser visible peut être utilisée.

Un signal apparaissant sur l'oscilloscope lorsqu'un caillot se trouve au-dessus du transducteur indique que ce caillot contient un mélanome. Suivez-le à travers le système avant de le déposer dans un flacon de collecte. Pour préparer les échantillons en vue d'une cytochimie immunocytochimique, placez des lames de verre dans des entonnoirs cyto et insérez-les dans le cytofuge pour une centrifugation permettant aux cellules capturées d'adhérer aux lames de verre.

Mettre 100 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS dans chaque entonnoir. Puis centrifuger à 600 tr/min pendant trois minutes. Après la centrifugation, ajouter les échantillons cellulaires dans les entonnoirs CyTOF, puis centrifuger à 600 tr/min pendant trois minutes.

Pulvériser les lames avec un fixateur à base d'éthanol. Rincer ensuite les lames dans du PBS pendant 10 minutes, deux fois, afin de bloquer la liaison non spécifique. Incuber chaque lame avec un mélange de 10 microlitres de sérum de chèvre et de 90 microlitres de PBS pendant une heure à température ambiante.

Après l'incubation, versez délicatement le liquide des lames et ajoutez la solution d'anticorps primaire. Chaque lame doit contenir 1 % de sérum de lapin, 1 % d'anticorps anti-CD45 de souris et 10 % de sérum de chèvre dans du PBS ; incubez pendant une heure dans une chambre humide à température ambiante. Ensuite, lavez les lames dans du PBS pendant 10 minutes, trois fois.

Incubez ensuite les lames avec les anticorps secondaires fluorescents appropriés, à l'abri de la lumière, pendant une heure à température ambiante, puis videz les lames. Lavez-les ensuite dans du PBS pendant cinq minutes, trois fois, afin de colorer les noyaux ; incubez les cellules avec 0,1 microgramme par millilitre de DPI pendant une minute. Puis videz les lames et rincez à l’aide de PBS.

Enfin, à l’aide d’un milieu de montage à base de résine, placez une lamelle au-dessus de l’échantillon cellulaire, scellez la lamelle avec du vernis incolore et observez au microscope fluorescent. Les formes d’onde photoacoustiques provenant des globules blancs et des cellules de mélanome sont présentées ici à gauche. Les globules blancs, ne possédant aucune pigmentation intrinsèque, ne produisent aucune onde photoacoustique et apparaissent comme une ligne plate de bruit électronique à droite.

Cependant, les cellules de mélanome pigmentées produisent une onde photoacoustique intense. Après l'immunocytochimie et la coloration chimique, les cellules de mélanome cultivées présentent des signaux tachetés en bleu ; une cellule marquée est mise en évidence en vert par superposition d'images pour DPI et mart1 avec CD45 comme indicateur des leucocytes. Cette figure montre des cellules de mélanome parmi plusieurs globules blancs après leur développement.

Notre technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la détection du cancer pour explorer le phénomène de métastase, afin d'améliorer à la fois la détection du cancer et, ultimement, de guérir sa propagation mortelle.