Name: Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à laide Débitmétrie photoacoustique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez la détection et l'isolement des cellules de mélanome circulantes par cytométrie photoacoustique sans marquage. Cette méthode permet une identification rapide et précise pour le diagnostic précoce du cancer.

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Nous reconnaissons l&#39;appui du Département de Génie Biologique et le Christopher S. Bond Life Sciences Center de l&#39;Université du Missouri. Nous reconnaissons le soutien octroi du Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 et les NIH R21CA139186-0. Nous remercions également les sciences de la vie Programme de premier cycle Research Opportunity à l&#39;Université du Missouri, de l&#39;Université du Missouri moléculaire Cytologie Core et l&#39;Université du Missouri College of Engineering de soutien financier.

1. Préparation de l&#39;échantillon de sang <ol><li> Dessinez environ 10 ml de sang entier d&#39;un patient du cancer de stade IV en deux 5 ml vacutainers. </li><li> Centrifuger les tubes pendant dix minutes à 3000 tours par minute (rpm). </li><li> L&#39;échantillon de sang sera séparé en trois couches différentes: la couche inférieure comprend les érythrocytes, la couche intermédiaire, appelée aussi la couche leucocytaire, contient les leucocytes et les cellules de mélanome, et la couche supérieure contient le plasma et les plaquettes. Retirez le plasma autant que possible sans perturber la couche leuco-plaquettaire. </li><li> Placer 250 pi d&#39;Histopaque 1077 dans deux tubes 1 ml Wintrobe. </li><li> Avec une pipette 9 &quot;Pasteur, extraire le plasma restant, la couche leuco-ensemble, et même la couche supérieure des globules rouges, en veillant à collecter &lt;500 ul. </li><li> Placer la solution au sommet de la couche d&#39;Histopaque et centrifuger les tubes Wintrobe dans 15 ml tubes coniques de 10 minutes à 3000 rpm. </li><li> Le sang sera de nouveauséparés, mais cette fois les érythrocytes seront séparés par le Histopaque, permettant l&#39;extraction facile de la couche leuco-plaquettaire. Utilisez un 9 &quot;pipette Pasteur pour obtenir la couche leuco-ensemble et le placer dans un tube Eppendorf de 2 ml. </li><li> Suspendre la couche leucocytaire dans 1,5 ml de PBS avec 2% v / v de Tween 20. </li></ol> 2. Construction Chambre de circulation <ol><li> Obtenir un cylindre acrylique, 20 mm de diamètre extérieur, 17 mm de diamètre intérieur, et de 8 mm de haut. Percez trois trous 5 mm de diamètre dans le côté du cylindre à angles de 90 degrés les uns des autres. Couper trois morceaux de tube polymère (1,6 mm de diamètre interne, 5 mm de diamètre extérieur), et les placer dans les trous percés. </li><li> Étirez Parafilm à travers le fond de l&#39;anneau de l&#39;acrylique pour faire un joint étanche à l&#39;eau. Le parafilm forme un bol peu profond avec l&#39;anneau acrylique et tiendra la solution d&#39;acrylamide qui forment une chambre de flux. </li><li> Suspendre un fil de 1,6 mm de diamètre à travers les morceaux de tubes qui sont en face de lal&#39;autre, en s&#39;assurant que le fil seul est visible à travers le milieu du ring. Remplissez le troisième morceau de tube avec un fil de 1,6 mm de diamètre et la position du tube 1 mm du fil de suspension. Ces fils de prévenir l&#39;acrylamide de pénétrer dans le tuyau. Après l&#39;acrylamide se solidifie, le fils sera extraite, laissant une voie d&#39;écoulement cylindrique et un endroit pour placer une fibre optique se concentre sur le chemin d&#39;écoulement. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;acrylamide préparés [20 g d&#39;acrylamide (Sigma Aldrich), 0,7 g de bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml d&#39;eau distillée] pour un petit bécher. Mesurer 0,02 g de persulfate d&#39;ammonium (Sigma) et l&#39;ajouter au bécher. Mélanger avec une barre de remuer pendant 3 minutes. Ajouter 20 uL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) dans le bécher. Verser rapidement le mélange dans l&#39;anneau acrylique, le remplissage vers le haut. Après quelques secondes, la solution sera de gel, fabriquer un moule chambre d&#39;écoulement. Retirez délicatement les fils hors, en veillant à ne pas perturber le gel d&#39;acrylamide. La Cham des fluxbre est maintenant prêt à utiliser. </li></ol> 3. Débitmétrie photoacoustique mise en place <ol><li> Acoustiquement quelques un transducteur piézoélectrique acoustiques fluorure de polyvinylidène (Panametrics) pour une chambre d&#39;écoulement à l&#39;aide de gel échographique directement au-dessus du chemin d&#39;écoulement. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un Bayonet Neill-Concelman (BNC) par câble, connecter le capteur à l&#39;entrée d&#39;un récepteur large bande RITEC-640A (filtre passe-bas: out, filtre passe-haut: 1 MHz, imput impédance de 50 Ohms, d&#39;amplification: 35 dB). Connectez la sortie du filtre à l&#39;oscilloscope (Tektronix TDS 2024B). Pour déclencher l&#39;oscilloscope, une photodiode (Thorlabs) est établi à proximité du capteur et est branché sur l&#39;oscilloscope en utilisant un câble BNC. </li><li> Un connecteur en T (petites pièces) est attaché à un bras de la chambre d&#39;écoulement. Deux pompes à seringues (Braintree scientifique) sont connectés aux autres branches du connecteur. Une seringue contient de l&#39;air, tandis que l&#39;autre contient la suspension cellulaire préparée dans la partie 1. Régler les débits à100 ul / minute. </li><li> Extraire le tube de la chambre de petite couler jusqu&#39;à une petite poche d&#39;air de formes, et d&#39;insérer une fibre de 1 mm de diamètre coeur optique ayant une ouverture numérique 0,37 dans cet emplacement. Remplissez la poche avec de l&#39;eau afin de réduire les signaux d&#39;interface et d&#39;augmenter la quantité de lumière laser appliquée à la voie d&#39;écoulement. En raison de l&#39;ouverture numérique de la fibre optique et à courte distance de la trajectoire d&#39;écoulement, le laser ne irradient une limace de l&#39;échantillon à un moment donné, faire en sorte que l&#39;échantillon directement en face du laser est le même échantillon de créer des signaux photoacoustique. L&#39;énergie du laser devrait être d&#39;environ 28 mJ / cm 2 avec une taille de spot de 7 mm 2. </li><li> Tournez les deux pompes seringue sur. Lorsque les deux fluides non miscibles atteindre la jonction en T, ils seront divisées en limaces homogène et des flux passés du transducteur. </li><li> Irradier les échantillons qui coule avec un laser pulsé nanoseconde pour générer des ondes photoacoustique dans les cellules de mélanome. Comme la mélanine est un broadbet optiques d&#39;absorption, toute longueur d&#39;onde laser visible peut être utilisé. </li><li> Si un signal apparaît sur l&#39;oscilloscope quand un slug est au sommet de la sonde, la limace contient un mélanome, et devraient être suivis par le système jusqu&#39;à tomber dans un flacon de collecte. </li></ol> 4. Immunocytochimie <ol><li> Prenez les limaces capturées à un Cytospin 4 Centrifugeuse (Thermo Scientific) afin de les fixer à des lames de verre. Placer les lames de verre en Cytofunnels (Shandon EZ Cytofunnel simple avec Filtre brun carte Thermo Scientific) et les charger dans la Cytospin 4 Centrifugeuse. Mettez 100 uL de 1% de sérumalbumine bovine (Sigma) dans du PBS dans chaque entonnoir et puis centrifuger à 600 rpm pendant 3 minutes afin d&#39;aider les cellules capturées coller à la lame de verre. </li><li> Après centrifugation, ajouter les échantillons de cellules à l&#39;Cytofunnels puis centrifuger à 600 rpm pendant 3 minutes. Vaporiser ensuite les lames avec un fixateur à base d&#39;éthanol. </li><li> Laver les lames dans du PBS pendant 10 minutes deux fois. </li><li&gt; Pour bloquer les liaisons non spécifiques, incuber chaque diapositive avec un mélange de 10 ul de sérum de chèvre (Sigma) et 90 ul de PBS pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Après l&#39;incubation, décanter les diapositives et incuber avec la solution d&#39;anticorps primaire pendant 1 heure dans une chambre humide à température ambiante. Chaque diapositive doit contenir 1% MART-1 anticorps élevé chez le lapin, 1% de CD-45 anticorps élevé chez la souris, du sérum de chèvre 10%, et 89% de PBS. </li><li> Après incubation, laver les lames dans du PBS pendant 10 minutes trois fois. </li><li> Les lames sont ensuite incubés dans une solution d&#39;anticorps secondaire, qui a fluorophore lié à l&#39;anticorps. Le mélange contient 0,05% de chèvre anticorps anti-lapin, 0,05% de chèvre anticorps anti-souris, du sérum de chèvre de 0,1%, et 99% de PBS. Les lames sont incubées dans l&#39;obscurité pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Après incubation, décanter les diapositives laver dans du PBS pendant 5 minutes trois fois. </li><li> Pour les taches pour un noyau, incuber les cellules avec 0,1 pg / ml de DAPI (Invitrogen) pour1 minute. Puis transvaser les diapositives et les laver dans du PBS. </li><li> Monter une lamelle sur l&#39;échantillon de cellules au moyen de 20 uL d&#39;un média à base de résine de fixation par lame. Sceau de la lamelle avec du vernis à ongles transparent pour préserver la diapositive. Maintenant, les diapositives sont prêts à être imagées avec un microscope à fluorescence. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Les formes d&#39;onde photoacoustique à partir de globules blancs et cellules de mélanome sont montrés ici. Les globules blancs, n&#39;ayant pas de pigmentation inhérents, ne produisent pas de vagues photoacoustique et manifeste une ligne fixe de bruit électronique (à gauche). Les cellules du mélanome pigmentées produit une onde robustes photoacoustique (à droite). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Après coloration immunocytochimique, les cellules de mélanome en culture montrent des signaux DAPI dans blue tout MART1 est surligné en vert. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Superposition des images pour DAPI et MART1, comme dans la Figure 2, avec CD45 comme un indicateur de leucocytes, cette figure montre les cellules de mélanome parmi plusieurs globules blancs.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
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<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator est le fondateur et président de Technologies Viator Inc, une société formée pour commercialiser des technologies photoacoustique pour l&#39;amélioration de la santé humaine.

Détecter les CTC est encore un domaine de recherche intense avec très peu d&#39;applications cliniques en raison de l&#39;épineux problème d&#39;isoler les cellules tumorales rares. Beaucoup d&#39;autres techniques sont en cours d&#39;évaluation pour la détection de la CCT, y compris la RT-PCR, la capture cellulaire microfluidique, la capture immunomagnétique, et d&#39;autres méthodes 8-12. Cependant, la détection photoacoustique de spectacles CMC promets que c&#39;est une étiquette libre et fournit un moyen rapide et précis pour capturer les petits, légers particules absorbant. Le protocole décrit à isoler les globules blancs est très efficace, mais un faible nombre de globules rouges dans l&#39;échantillon. Ces cellules Rouge contaminent également absorber la lumière laser, mais à un niveau considérablement diminué. Pour assurer les globules rouges ne pas interférer avec notre système de détection du mélanome, cinq échantillons de patients sains ont été introduits dans le système et aucun a donné un signal, indiquant que les globules rouges sont présents à de faibles concentrations suffisantes pourêtre négligé. Une série d&#39;études de concentration ont été réalisées en utilisant des cellules de mélanome en culture et le système de flux photoacoustique a prouvé sensibles à 1 cellule / uL (données non publiées). Ces études sont en cours et comprendra bientôt des essais en utilisant des échantillons patient atteint de cancer. Cette technique photoacoustique est également en cours d&#39;évaluation pour une utilisation chez les non-pigmentées CTC, comme du sein et cancer de la prostate en attachant des chromophores exogènes. Nous avons effectué des travaux préliminaires en utilisant des nanoparticules d&#39;or sur le cancer cells13. Ces tests ont montré que les nanoparticules peuvent fournir l&#39;absorption optique nécessaire pour générer des ondes photoacoustique. Le défi reste technique consiste à fixer ces particules aux cellules cancéreuses de manière sélective.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide débitmétrie photoacoustique

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Des cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules qui sont séparés d&#39;une tumeur macroscopique et la propagation à travers les systèmes sanguin et lymphatique des tumeurs secondaires de graines 1,2,3. CTC sont des indicateurs de la maladie métastatique et leur détection dans les échantillons sanguins peuvent être utilisés pour diagnostiquer le cancer et surveiller la réponse du patient au traitement. Depuis CTC sont rares, comprenant environ une cellule tumorale parmi des milliards de cellules sanguines normales chez les patients cancéreux avancés, leur détection et leur énumération est une tâche difficile. Nous exploitons la présence du pigment dans les cellules de mélanomes les plus à générer photoacoustique, ou induite par laser ondes ultrasonores dans un cytomètre de flux personnalisées pour la détection des cellules de mélanome en circulation (CMC) 4,5. Ce processus implique la séparation d&#39;un échantillon de sang total par centrifugation et l&#39;obtention de la couche de globules blancs. Si elle est présente dans le sang total, les CMC seront séparées avec les globules blancs à cause de la densité similaire. Ces cellules sont remises en suspension danstampon phosphate salin (PBS) et introduite dans le débitmètre. Plutôt que d&#39;un flux continu de la suspension de cellules sanguines, nous avons provoqué deux flux de phase afin de capturer ces cellules pour une étude plus approfondie. Dans deux flux de phase, deux liquides non miscibles dans un système microfluidique répondre à un carrefour et la forme en alternance les limaces de 6,7 liquide. PBS a suspendu les globules blancs et les limaces de l&#39;air sous forme microlitre qui sont séquentiellement irradiés avec une lumière laser. L&#39;ajout d&#39;un tensioactif à la phase liquide permet la formation limaces uniforme et l&#39;utilisateur peut créer différentes limaces de taille en modifiant les débits des deux phases. Les limaces de l&#39;air et les limaces de PBS avec les globules blancs ne contiennent pas d&#39;absorbeurs de lumière et donc, ne produisent pas de vagues photoacoustique. Toutefois, les limaces de globules blancs qui contiennent même des CMC seule absorber la lumière laser et de produire des ondes acoustiques de haute fréquence. Ces limaces qui génèrent des ondes photoacoustique sont séquestrés et collectées pour la coloration cytochimique pour verifiction de la CMC.

Nous avons développé un cytomètre en flux en utilisant des ultrasons pour détecter induite par laser circulant cellules de mélanome comme un indicateur précoce de la maladie métastatique.

Détection et isolement des cellules du mélanome de circulation à l&#39;aide Débitmétrie photoacoustique

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules qui se sont détachées d'une tumeur macroscopique et se sont propagées via les systèmes sanguin et lymphatique pour ensemencer...

L'objectif de l'expérience suivante est de détecter la présence d'un cancer avant la formation de tumeurs secondaires. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant et en séparant des échantillons sanguins de patients atteints de mélanome au stade quatre. Dans un deuxième temps, le sang est introduit dans une chambre d'écoulement photoacoustique, ce qui permet la détection et l'isolement des cellules de mélanome.Ensuite, les cellules capturées sont imagées afin de confirmer la présence de mélanome détecté. Les résultats démontrent la capacité du système à détecter et isoler précisément et rapidement les cellules de mélanome à l’aide de formes d’ondes photoacoustiques et de techniques d’imagerie cellulaire. Le principal avantage de notre technique par rapport aux méthodes existantes de détection des cellules circulantes de mélanome, telles que la R-T-P-C-R, le tri magnétique cellulaire et d'autres méthodes, est qu'elle est sans étiquetage et permet la capture des cellules circulantes de mélanome sans modifier leur surface ni les fixer sur un substrat.Pour préparer un échantillon en vue de la détection d'un cancer métastatique, commencez par prélever environ 10 millilitres de sang total à partir d'un patient atteint d'un cancer de stade quatre. Dans deux tubes vacutainer de cinq millilitres, centrifugez les tubes pendant 10 minutes à 3000 tr/min. L'échantillon de sang se séparera en trois couches distinctes. La couche inférieure est constituée des érythrocytes.La couche intermédiaire, également appelée couche de buffy coat, contient les leucocytes et les cellules de mélanome, et la couche supérieure contient le plasma et les plaquettes. Retirez autant de plasma que possible sans perturber le buffy coat. Ajoutez 250 microlitres de son opaque 10 77 à des tubes de 2 millilitres.À l’aide d’une pipette pasteur de neuf pouces, prélevez le plasma restant, tout le buffy coat et la couche supérieure des érythrocytes, en veillant à recueillir moins de 500 microlitres. Transférez la solution dans les tubes wind Trobe préparés précédemment.Le sang va de nouveau se séparer, mais cette fois les érythrocytes seront séparés par le hispa, permettant une extraction facile de la couche buffy. Utilisez une pipette Pesa de neuf pouces pour isoler entièrement la couche buffy et placez-la dans un tube eend orph de deux millilitres. Ensuite, suspendez-la dans 1,5 millilitre de PBS avec 2 % volume par volume entre 20.Pour construire une chambre d'écoulement, commencez par un cylindre en acrylique de huit millimètres de long, ayant un diamètre extérieur de 20 millimètres et un diamètre intérieur de 17 millimètres. Ensuite, percez trois trous de cinq millimètres de diamètre à travers le côté du cylindre, espacés d'angles de 90 degrés les uns par rapport aux autres. Puis, coupez trois morceaux de tube polymère et insérez-les dans les trous percés.Étirez du film parafilm sur le fond de l'anneau en acrylique afin de créer une étanchéité. Le parafilm formera une cuvette peu profonde avec l'anneau en acrylique et retiendra la solution d'acrylamide qui constituera une chambre d'écoulement. Passez un fil de 1,6 millimètre de diamètre à travers les morceaux de tubulure directement opposés l'un à l'autre, en veillant à ce que seul le fil soit visible au milieu de l'anneau, à travers la troisième pièce de tubulure.Insérez un fil de 1,6 millimètre de diamètre et positionnez le tube à un millimètre du fil suspendu. Ces fils empêchent l'acrylamide d'entrer dans le tube. Préparez cinq millilitres d'acrylamide.Versez ensuite rapidement le mélange dans l'anneau acrylique, en le remplissant jusqu'au bord. Après quelques secondes, la solution gélifie. Pour fabriquer un moule de chambre à écoulement, retirez soigneusement les fils en veillant à ne pas perturber le gel d'acrylamide, laissant ainsi un trajet d'écoulement cylindrique et un emplacement pour positionner une fibre optique focalisée sur ce trajet.La chambre d'écoulement est désormais prête à être utilisée avec du gel à ultrasons sur le plan acoustique. Coupler un transducteur acoustique piézoélectrique en fluorure de polyvinylidène au-dessus du trajet d'écoulement directement sur la chambre d'écoulement. À l'aide d'un câble bayonet neo cons ou BNC, relier le transducteur à l'entrée d'un récepteur large bande.Reliez la sortie du filtre à l'oscilloscope pour déclencher ce dernier. Placez une photodiode près du transducteur et utilisez un câble B NNC pour la brancher à l'oscilloscope. Extrayez le petit tube de la chambre d'écoulement jusqu'à ce qu'une petite poche d'air se forme, puis couplez-le au transducteur.Insérez ensuite la fibre optique et remplissez la poche d'eau afin de réduire les signaux d'interface et d'augmenter la quantité de lumière laser appliquée au trajet d'écoulement. En raison de l'ouverture numérique de la fibre optique et de la courte distance qui la sépare du trajet d'écoulement, le laser n'irradiera qu'un seul bouchon d'échantillon à la fois, garantissant ainsi que l'échantillon directement en face du laser soit bien celui qui génère les signaux photoacoustiques.Ensuite, fixez un raccord en T à un bras de la chambre d'écoulement et deux pompes à seringue aux autres branches du raccord. Une seringue contient de l'air, tandis que l'autre contiendra la suspension cellulaire préparée précédemment. Démarrez ensuite les deux pompes à seringue.Lorsque les deux fluides admissibles atteignent la jonction en T, ils sont divisés en bouchons homogènes et s'écoulent devant le transducteur. Illuminez l'échantillon en écoulement avec un laser à impulsions nanosecondes pour générer des ondes photoacoustiques dans les cellules de mélanome. Étant donné que la mélanine est un absorbeur optique large bande, n'importe quelle longueur d'onde laser visible peut être utilisée.Un signal apparaissant sur l'oscilloscope lorsqu'un caillot se trouve au-dessus du transducteur indique que ce caillot contient un mélanome. Suivez-le à travers le système avant de le déposer dans un flacon de collecte. Pour préparer les échantillons en vue d'une cytochimie immunocytochimique, placez des lames de verre dans des entonnoirs cyto et insérez-les dans le cytofuge pour une centrifugation permettant aux cellules capturées d'adhérer aux lames de verre.Mettre 100 microlitres de BSA à 1 % dans du PBS dans chaque entonnoir. Puis centrifuger à 600 tr/min pendant trois minutes. Après la centrifugation, ajouter les échantillons cellulaires dans les entonnoirs CyTOF, puis centrifuger à 600 tr/min pendant trois minutes.Pulvériser les lames avec un fixateur à base d'éthanol. Rincer ensuite les lames dans du PBS pendant 10 minutes, deux fois, afin de bloquer la liaison non spécifique. Incuber chaque lame avec un mélange de 10 microlitres de sérum de chèvre et de 90 microlitres de PBS pendant une heure à température ambiante.Après l'incubation, versez délicatement le liquide des lames et ajoutez la solution d'anticorps primaire. Chaque lame doit contenir 1 % de sérum de lapin, 1 % d'anticorps anti-CD45 de souris et 10 % de sérum de chèvre dans du PBS ; incubez pendant une heure dans une chambre humide à température ambiante. Ensuite, lavez les lames dans du PBS pendant 10 minutes, trois fois.Incubez ensuite les lames avec les anticorps secondaires fluorescents appropriés, à l'abri de la lumière, pendant une heure à température ambiante, puis videz les lames. Lavez-les ensuite dans du PBS pendant cinq minutes, trois fois, afin de colorer les noyaux ; incubez les cellules avec 0,1 microgramme par millilitre de DPI pendant une minute. Puis videz les lames et rincez à l’aide de PBS.Enfin, à l’aide d’un milieu de montage à base de résine, placez une lamelle au-dessus de l’échantillon cellulaire, scellez la lamelle avec du vernis incolore et observez au microscope fluorescent. Les formes d’onde photoacoustiques provenant des globules blancs et des cellules de mélanome sont présentées ici à gauche. Les globules blancs, ne possédant aucune pigmentation intrinsèque, ne produisent aucune onde photoacoustique et apparaissent comme une ligne plate de bruit électronique à droite.Cependant, les cellules de mélanome pigmentées produisent une onde photoacoustique intense. Après l'immunocytochimie et la coloration chimique, les cellules de mélanome cultivées présentent des signaux tachetés en bleu ; une cellule marquée est mise en évidence en vert par superposition d'images pour DPI et mart1 avec CD45 comme indicateur des leucocytes. Cette figure montre des cellules de mélanome parmi plusieurs globules blancs après leur développement.Notre technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la détection du cancer pour explorer le phénomène de métastase, afin d'améliorer à la fois la détection du cancer et, ultimement, de guérir sa propagation mortelle.

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