Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

L’objectif global de cette procédure est de créer des nanopores dans des membranes artificielles pour les utiliser dans les études d’absorption des protéines. Ceci est accompli en perçant des nanopores dans une membrane de nitrure à l’aide d’une tige. Ensuite, le nanopore est chargé dans une chambre et il est mouillé avec une solution ionique.

Ainsi, le fluide forme un pont d’un côté à l’autre du nanopore pour rendre le nanopore prêt pour les expériences. Une tension est appliquée à travers elle et on peut observer un courant d’ions la traverser. La dernière étape consiste à ajouter des protéines dans la chambre Nanopore.

En fin de compte, l’observation de blocages à longue durée de vie dans le courant ionique à travers le nanopore révèle l’absorption des protéines sur les côtés du nanopore. Bonjour, je m’appelle Dave Wicki. Je suis étudiant diplômé au Département de physique de l’Université de Syracuse.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’absorption des protéines sur les surfaces inorganiques. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les protéines, les interactions entre les acides nucléiques, la molécule unique pour la spectroscopie et l’étude des molécules dans des espaces confinés. Commencez par amener la tige à une tension d’accélération.

Ensuite, chargez une grille de fenêtre en nitrure de silicium SPI dans le support d’échantillon MET. Nettoyez la grille avec du plasma d’oxygène pendant 30 secondes pour éliminer les débris. Avant de charger l’échantillon, chargez le porte-échantillon dans le TEM et laissez le vide descendre vers le bas.

À l’aide du mode TEM en fond clair, recherchez la fenêtre nitrure, un carré brillant sur le programme brut. Assurez-vous que le GDT est correctement aligné. Ensuite, alignez et concentrez l’échantillon.

Mettez maintenant le système en mode STEM et utilisez un détecteur de mise hors tension pour imager l’échantillon et vérifier son alignement. Réglez le monochromateur s’il est présent sur une valeur faible, ce qui permet d’obtenir un courant plus élevé d’électrons disponibles pour le forage. Sélectionnez la taille de spot appropriée pour percer le Nanopore en fonction du diamètre de la sonde électronique.

Avec la tige alignée. Utilisez le BROGRAM pour faire la mise au point parfaite sur la membrane de nitrure au grossissement requis. S’il y a un mouvement de l’échantillon, blanc, le faisceau d’électrons et attendez que l’échantillon se stabilise.

Cela peut prendre jusqu’à une heure. Une fois stabilisé, placez la sonde électronique sur l’échantillon et commencez à percer le nanopore. Le forage d’un nanopore avec une MT nécessite l’infidélité du patient.

Il s’agit d’un processus dans lequel le nitrure est progressivement dissipé sous une sonde à faisceau d’électrons. Il est important de garder la sonde électronique directement au-dessus du site de forage et de confirmer que le nanopore est complètement percé. Avant de retirer l’échantillon du TEM, vérifiez périodiquement l’échantillon en le balayant à l’aide du détecteur de mise hors tension.

Si l’échantillon dérive légèrement, ajustez la position de la sonde électronique pour qu’elle soit au-dessus du nanopore. Avec le gramme de retour sur investissement en ligne, le film nitrure scintillant disparaîtra. Lorsque le nanopore se forme avec le gramme flou, la frange de l’ongle effiloché est visible.

Imagez le nanopore avec le chaud éteint et faites un profil d’intensité de l’image. Le diamètre du nanopore peut être estimé par la région la plus sombre du profil. La sonde électronique peut être utilisée pour agrandir le nanopore si nécessaire.

Lorsqu’il a le diamètre requis. Passez en mode TEM avec le monochromateur dans le réglage standard. Utilisez la MET en fond clair pour confirmer la taille des pores.

Commencez par préparer des degas di saline. Mettre la solution sous vide et dans un bain de sonicate pendant 20 minutes Délicatement, placer le fragile Nanopore contenant du nitrure de silicium dans un bec en Pyrex de 10 millilitres. Ensuite, dans une hotte, placez le bécher sur une plaque chauffante.

Nettoyez très soigneusement la puce Nanopore avec une solution de piranha. Tout d’abord, ajoutez trois millilitres d’acide sulfurique dans le récipient à l’aide d’une pipette en verre. Deuxièmement, ajoutez soigneusement un millilitre de peroxyde d’hydrogène à l’acide sulfurique.

Veuillez prendre toutes les précautions. Laissez tremper la puce nanopore pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, retirez la solution de piranha du bécher et jetez-la correctement.

Ensuite, remplissez le bécher avec l’eau déminéralisée Degas. À l’aide d’une pipette en verre propre, videz le bécher de l’eau et répétez ce lavage au moins cinq fois. Avec une pince à épiler propre, retirez l’éclat nanopore et séchez-le par légère aspiration.

Une fois sec, scellez immédiatement la puce nanopore dans la chambre. La puce peut être fixée dans la chambre par des joints toriques ou un mastic silicone. Remplissez la chambre avec une solution de chlorure de potassium.

Connectez les électrodes d’argent et de chlorure d’argent à la chambre. Les électrodes peuvent être fabriquées en trempant du fil d’argent dans de l’eau de Javel pendant la nuit. Appliquez un potentiel transmembranaire à travers les électrodes et surveillez la réponse du courant à l’aide d’un amplificateur à pince de raccordement.

En mode pince de tension, construisez une courbe de tension de courant à partir des mesures. La courbe doit être très linéaire. Lors de l’utilisation d’une molaire de chlorure de potassium, la conductance du nanopore doit correspondre à son diamètre.

Si le nanopore n’affiche pas une courbe IV linéaire, la conductance est trop faible ou le courant ouvert du nanopore n’est pas stable. Cela indique que le nanopore n’est pas correctement marié et que le lavage du piha doit être répété. Il est essentiel de s’assurer que le liquide se trouve à l’intérieur du nanopore.

Si cette étape n’est pas effectuée correctement, le courant ionique à travers le nanopore présentera un bruit très important et la répartition des protéines dans le nanopore sera considérablement réduite. Commencez par ajouter un échantillon purifié de la protéine d’intérêt dans le bain de mise à la terre de la chambre. Attendez que l’échantillon se diffuse complètement.

Appliquez une polarisation de tension de potentiel transmembranaire avec une polarité opposée à celle de la charge totale de la protéine étudiée. Un potentiel appliqué de 200 millivolts devrait être suffisamment grand pour être observé. La plupart des événements liés aux analytes protéiques se manifestent par des déviations de courant transitoires par rapport à la ligne de base.

Si aucun signal n’est observé, augmentez la concentration de la protéine dans la chambre. Des tensions plus élevées améliorent le rapport signal/bruit et le nitrure. Les nanopores peuvent résister à plusieurs volts.

Les absorptions de protéines apparaîtront sous forme de changements de longue durée dans le courant de base du Nanopore. Les résultats typiques pour les nanopores à l’état solide seront les suivants. Le courant interstitiel ouvert doit être très stable.

Les caractéristiques IV du nanopore doivent être très linéaires. Dans une molaire de chlorure de potassium, 10 molaires de phosphate de potassium pH 7,4, la pente d’un ajustement linéaire à la courbe IV fournira la conductance unitaire du nanopore. La conductance a une relation directe avec le diamètre des nanopores et doit correspondre à l’équation.

Cette valeur doit correspondre à 30 % prèsSi la valeur est trop petite, le pore n’est probablement pas lié à l’ajout de protéines. Des événements rapides devraient s’ensuivre l’absorption des protéines est une baisse de courant de longue durée. Certaines protéines sont très labiles et subissent une transformation structurelle à l’intérieur des pores.

Dans ce cas, la chute de tension à longue durée de vie sera accompagnée de fluctuations rapides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de nanopores à l’état solide à l’aide d’un microscope électronique à transmission à balayage et de l’absorption des protéines SA. N’oubliez pas que travailler avec une solution de piranha peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans une hotte avec des gants, une blouse de laboratoire et un tablier chimique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.