Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d'ischémie / reperfusion modèle

Les cellules cardiaques sont placées dans des plaques de culture cellulaire pour une ischémie simulée. Le modèle de reperfusion est obtenu par 150 minutes en milieu sans glucose, tandis que le taux d'oxygène est inférieur à 0,5 %. Cette période ischémique entraîne le rétrécissement et le bourgeonnement de la majorité des cellules. Ensuite, des milieux normaux et des niveaux d'oxygène sont réintroduits pour simuler la reperfusion.

Des cellules souches mésenchymateuses sont ajoutées et cultivées conjointement avec les cellules endommagées. Après 24 heures de co-culture, les cellules sont marquées au calcium et à l'éthidium homodimère afin de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. La microscopie confocale montre clairement les deux populations cellulaires et leurs interactions. L'analyse par cytométrie en flux révèle trois groupes de cellules endommagées, qui peuvent être représentés sur un graphique et analysés statistiquement. La transplantation de cellules souches fait l'objet de protocoles qui s'intègrent progressivement à la pratique clinique. L'amélioration des résultats, le renforcement de la robustesse des protocoles et la recherche de nouvelles sources de cellules implantables constituent les axes principaux des travaux récents.

Étudier l'efficacité des thérapies cellulaires n'est pas une tâche facile et de nouveaux outils sont nécessaires pour examiner les mécanismes impliqués dans le processus thérapeutique. Nous avons conçu un protocole expérimental permettant d'observer les connexions cellulaires et même les mécanismes subcellulaires durant l'ischémie, la lésion de perfusion et après la transplantation de cellules souches. Selon nos critères de conception, notre système entièrement in vitro ne contient que les cellules hôtes et les cellules donneuses.

Il est donc isolé du tissu environnant. Mesure continue de la viabilité cellulaire avant, pendant et après la lésion, pendant jusqu'à 24 heures. Et identification claire des deux populations cellulaires afin de pouvoir suivre le devenir des cellules greffées.

Afin d'atteindre cet objectif, nous avons mis en place un protocole de privation d'oxygène et de glucose, couramment abrégé en OGD, suivi d'une période de réoxygénation. Notre choix de cellules hôtes s'est porté sur des cellules C2C12, une lignée cellulaire connue de myoblastes cardiaques rouges. Après l'OGD, les cellules endommagées ont été soutenues par la transplantation de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse, ajoutées à la culture.

Ce dispositif nous a permis d'étudier les connexions intercellulaires à l'aide de la forêt confocale et de la microscopie, et de quantifier le taux de survie des cellules endommagées par cytométrie en flux. Mettons-nous au travail et voyons comment nous procédons. Retirez le milieu de culture des cellules H nine C two.

Laver les cellules deux fois avec du PBS et les digérer avec de la trypsine-EDTA à 0,05 % en plaçant les boîtes de Pétri pendant cinq minutes. Dans un incubateur à 37 degrés, inhiber la trypsine avec du milieu de culture DMEM. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant huit minutes.

Après avoir retiré le surnageant, resuspendre les cellules dans un millimètre de milieu de culture DMEM, compter les cellules à l’aide d’un cytomètre en utilisant la coloration au bleu de trypan : 30 000 cellules H9c2 par puits. Dans une plaque de 12 puits, placer la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et à base de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Retirer le milieu par aspiration, laver les cellules deux fois avec du PBS.

Ajouter trois millimètres de milieu sans glucose. Placer la plaque dans le système d'incubation des cellules. Commencer l'apport de gaz azote pour chasser l'oxygène du système d'incubation.

Attendre que le taux d'oxygène atteigne 0,5 %. Ensuite, démarrer le chronomètre. Un taux d'oxygène de 0,5 % correspond à une pression partielle d'environ trois millimètres de mercure ; soumettre les cellules à 150 minutes d'ischémie simulée. Pendant l'ischémie, les cellules se détachent de la surface et leur membrane commence à présenter des bulles. Nous avons constaté que chaque population nécessite des durées légèrement différentes pour atteindre un taux de détachement cellulaire de 60 à 80 %.

C'est pourquoi nous recommandons de commencer par l'incubation deux R. Et si cela ne suffit pas, d'augmenter la durée de la DGO. Dans notre cas, les cellules âgées de neuf C deux nécessitent généralement de 150 à 70 minutes de DGO à la fin de l'ischémie simulée.

Retirer le milieu sans glucose des cellules et ajouter au pipetage le milieu de culture normal dans les puits. Placer une plaque de 12 puits pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 degrés avec du dioxyde de carbone. Cette étape correspond à la période de reperfusion.

Pendant l'ischémie simulée, préparez les cellules de sauvetage pour la transplantation. Diluez le milieu fluorescent, le DID vibrant, au ratio de un à 200 dans le milieu de culture DMEM. Aspirez le milieu des cellules de sauvetage et ajoutez 300 microlitres de DMEM provenant des boîtes de Petri vibrant Brent Place pendant 30 minutes dans l'incubateur à 37 degrés avec du dioxyde de carbone.

Après 30 minutes à la fin de la reperfusion, ajouter mille cellules souches mésenchymateuses par puits aux myoblastes cardiaques post-ischémiques H nine C two. Les étapes initiales sont identiques à celles de la mise en culture des H nine C two : lavage deux fois avec du PBS, trypsination et comptage. Placer la co-culture de cellules dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et à atmosphère de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Après 24 heures, récoltez le milieu de culture ainsi que les cellules adhérentes des puits avec ization. Il est très important de recueillir également le milieu de culture, car certaines cellules mortes peuvent s'être détachées de la surface de la boîte de culture pendant l'incubation de 24 heures.

Suspendre les cellules dans 500 microlitres de solution vivant-mort-mourant, cinq NMO de calcium et 400 NMO d'homodimère d'Ethereum dans du PBS à cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre. En cas de cocultures, les cellules souches mésenchymateuses sont distinguées des cellules H nine C two par marquage fluorescent spécifique des cellules. Ainsi, il est possible de détecter la fusion cellulaire et les sites de contact entre cellules.

Le ratio de cellules mortes peut être évalué dans quatre champs indépendants, en utilisant un objectif de 10 fois pour chaque culture de manière aveugle, ce qui fournit un résultat reproductible du nombre de cellules. Transférez les cellules dans des tubes pour cytométrie en flux. Lancez le logiciel Cell Quest Pro pour configurer le cytomètre en flux en vue de la mesure.

Préparez des échantillons témoins de cellules vivantes et mortes. Les cellules vivantes sont cultivées à la même densité dans des conditions normales et marquées au calcium. Les cellules mortes sont préparées par un traitement d'une heure avec du peroxyde d'hydrogène à 10 micromole, marquées à l'Éthidium homodimère, puis récoltées de la même manière ; les réglages de l'appareil doivent être ajustés de sorte que les cellules vivantes soient positives au calcium et négatives pour l'Éthidium homodimère.

Alors que les cellules mortes sont négatives pour le calcium et positives pour l'homodimère d'éthidium, le pourcentage de ces populations peut être exprimé sous forme de barres sur un graphique et une analyse statistique peut être effectuée sur ces valeurs. Nous avons constaté que l'ajout de cellules souches saines augmente le ratio de cellules survivantes dans la population. Fait intéressant, nous avons également observé que les cellules qui ont été sauvées après la lésion peuvent être sélectionnées par tri, à la fois par rapport à celles qui étaient mortes et à celles qui sont restées vivantes.

Nous pensons que cette population justifie des investigations supplémentaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser des expériences d'ischémie simulée avec une transplantation de cellules souches in vitro de façon standardisée. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Si vous avez des questions techniques, n'hésitez pas à nous contacter. Nous serons là pour vous aider.