Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes
26 janvier 2012
13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d'étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.
L'objectif de ce protocole est d'étudier le métabolisme bactérien à l'aide d'une analyse du métabolisme assistée par le carbone 13. Pour commencer, les micro-organismes sont cultivés en présence de substrats carbonés marqués, qui s'incorporent aux protéines microbiennes. Les micro-organismes sont ensuite récoltés, et les acides aminés sont extraits, hydrolysés et dérivatisés.
Les échantillons sont appliqués à un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse, ou GCMS. En traçant les parcours de transition des atomes entre les métabolites dans le réseau biochimique, les voies métaboliques fonctionnelles utilisées par le micro-organisme peuvent être déterminées. Je suis Bert Burla.
La méthode que nous présentons ici peut être utilisée comme complément de la transcriptomique et de la protéomique pour déterminer les voies métaboliques chez les micro-organismes. Nous avons utilisé cette technique pour étudier des micro-organismes photosynthétiques tels que les cyanobactéries en ce qui concerne l'utilisation du carbone myotrophique ou hétérotrophique. Dans cette vidéo, nous utiliserons la souche modèle ANOTHE 5 1 1 42 afin de démontrer l'utilisation de substrats carbonés marqués pour découvrir de nouvelles fonctions enzymatiques.
La démonstration de la procédure sera réalisée par mes soins, Li Yu et Chu Yang Fang. Commencez cette procédure en cultivant des bactéries *Cyanathece* dans un milieu non marqué. Lorsque les bactéries atteignent la phase de croissance exponentielle moyenne, ensemencez 3 % en volume dans un milieu marqué au carbone 13.
Ensuite, afin d'éviter l'introduction de carbone non marqué provenant de la sous-culture initiale de l'inoculum dans le même milieu marqué au stade de croissance logarithmique intermédiaire. Lorsque les bactéries Cy Thesei marquées au carbone 13 atteignent la phase de croissance logarithmique intermédiaire, récoltez 10 millilitres par centrifugation. Resuspendez le culot dans 1,5 millilitre d'acide chlorhydrique six molaire et transférez-le dans un flacon en verre transparent à vis pour chromatographie en phase gazeuse ou GC.
Fermez hermétiquement les vials et placez-les dans une étuve à 100 degrés Celsius pendant 24 heures afin d'hydrolyser les protéines de la biomasse en acides aminés. L'hydrolyse des pastilles de biomasse permet d'obtenir 16 des 20 acides aminés courants. Transférez la solution d'acides aminés dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres, puis centrifugez à 20 000 Gs pendant cinq minutes. Après hydrolyse, transférez la solution d'acides aminés dans des tubes microcentrifugeurs de deux millilitres, puis centrifugez à 20 000 Gs pendant cinq minutes afin de faire déposer les particules solides.
Après la centrifugation, transférez les surnageants dans de nouveaux flacons de chromatographie en phase gazeuse (CPG) afin d'éliminer les particules solides présentes dans la solution d'hydrolyse, pour éviter qu'elles n'entrent dans la colonne de CPG. Ensuite, les acides aminés sont dérivés afin de les rendre volatils pour leur séparation par chromatographie en phase gazeuse : dissolvez les échantillons séchés avec 150 microlitres de tétrahydrofuranne (THF) et 150 microlitres de tert-butyl diméthylsiloxy et de méthyltrifluoro.
Acétamide, réactif de dérivation T-B-D-M-S : incuber tous les échantillons dans une étuve entre 65 et 80 degrés Celsius pendant une heure. Vortexer les échantillons occasionnellement afin de s'assurer que les métabolites dans le flacon sont bien dissous. Centrifuger les échantillons à 20 000 ×g pendant 10 minutes, puis transférer le surnageant dans de nouveaux flacons pour GC.
Le surnageant doit être une solution limpide de couleur jaunâtre. Les températures de la CG sont les suivantes : maintenir à 150 degrés Celsius pendant deux minutes. Augmenter de trois degrés Celsius par minute jusqu'à 280 degrés Celsius.
Augmenter de 20 degrés Celsius par minute jusqu'à 300 degrés Celsius, puis maintenir pendant cinq minutes. Ensuite, pour une colonne de chromatographie en phase gazeuse (CPG) de 30 mètres, régler le délai de solvant à environ cinq minutes et la plage du rapport masse sur charge entre 60 et 500. Analyser les échantillons par CPG-SM en utilisant un volume d'injection avec un rapport de partage de un à cinq ou de un à 10, d'un microlitre, et un gaz vecteur, l'hélium, à 1,2 millilitre par minute, après l'analyse.
Analyser les données de GCMS à l'aide de Microsoft Excel. Le temps de rétention en chromatographie gazeuse et les pics uniques de rapport masse/charge pour chaque acide aminé sont illustrés dans cette figure. T-B-D-M-S. Les dérivés d'acides aminés sont généralement clairement divisés par spectrométrie de masse en deux fragments chargés : le fragment M moins 57, qui contient l'acide aminé entier, et le fragment M moins 159, qui ne possède pas le groupe carboxyle alpha de l'acide aminé, pour la leucine et l'isoleucine.
Le pic M moins 57 était superposé à d'autres fragments de pics de masse. Le groupe N moins 15 peut être utilisé pour analyser l'étiquetage complet des acides aminés. De plus, le groupe F 3 0 2 est souvent détecté dans la plupart des acides aminés, et il contient uniquement le premier groupe carboxyle alpha et les deuxièmes carbones du squelette d'un acide aminé.
Cependant, comme ce pic Ms. présente souvent des rapports bruit/signal élevés, il n'est pas recommandé d'utiliser F 3 0 2 pour analyser quantitativement les flux métaboliques. La dérivation des acides aminés ou des métabolites centraux introduit des quantités importantes d'isotopes naturellement marqués, notamment du carbone 13, de l'oxygène 18, du silicium 29 et du silicium 30. Le bruit de mesure dû aux isotopes naturels dans la masse brute ou le spectre isotopique peut être corrigé à l'aide de logiciels publiés.
Les données finales de marquage isotopique sont exprimées en fractions massiques. Par exemple, M zéro, M1, M deux, M trois et M quatre, représentant des fragments contenant de zéro à quatre atomes de carbone marqués au carbone 13. Ce 5 1 1 2 ne contient pas l'enzyme thréonine ammonia-lyase, qui catalyse la conversion de la thréonine en acide 2-céto-butyrique dans la voie typique de synthèse de l'isoleucine.
Par conséquent, afin de déterminer la voie métabolique de l'isoleucine chez cet organisme, Cyana THESEI 5 1 1 42 a été cultivé dans un milieu ASP deux contenant du glycérol à 54 millimolaire et analysé par GCMS comme décrit dans cette vidéo et illustré ici. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utilise du glycérol marqué en position secondaire comme principale source de carbone, et nous avons observé que la thréonine et l'alanine, dont le précurseur est le pyruvate, possèdent un carbone marqué, tandis que l'isoleucine est marquée avec trois carbones. Ainsi, la synthèse de l'isoleucine chez Cyana Thesei 5 1 1 4 2 ne peut pas provenir de la voie thréonine utilisée par la plupart des organismes. En revanche, la leucine et l'isoleucine présentent des profils de marquage identiques, basés sur les fragments M moins 15 et M moins 1 59.
Par exemple, l'isotope ou les données provenant d'acides aminés non fragmentés contenant de l'azote 15 ont montré un marquage identique pour la leucine et l'isoleucine. Ainsi, la leucine et l'isoleucine doivent être synthétisées à partir des mêmes précurseurs, à savoir le pyruvate et l'acétyl-CoA. Cette observation est compatible avec le passage des carbones marqués dans la voie du citramalate pour la synthèse de l'isoleucine.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier le métabolisme d'une grande diversité de micro-organismes, et une fois maîtrisée, elle peut être réalisée du début à la fin en environ une semaine.
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Aperçu
Ce protocole s'attache à l'étude du métabolisme bactérien par analyse du métabolisme assistée par le carbone-13. En cultivant des micro-organismes avec des substrats carbonés marqués, les chercheurs peuvent suivre les voies métaboliques en fonction de l'incorporation de ces substrats dans les protéines microbiennes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Métabolisme microbien
- Techniques de marquage isotopique
- Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)
Contexte
- Le marquage isotopique au carbone-13 permet de comprendre les processus métaboliques.
- Les micro-organismes utilisent des substrats spécifiques pour la croissance et le métabolisme.
- La GC-MS est un outil puissant pour analyser les voies métaboliques.
- Le traçage des transitions d'atomes peut fournir des informations sur les réseaux biochimiques.
Objectif de l'étude
- Analyser les voies métaboliques des bactéries.
- Utiliser des substrats marqués au carbone-13 pour tracer le métabolisme.
- Approfondir la compréhension de la synthèse microbienne des protéines.
Méthodes utilisées
- Cultiver des micro-organismes en présence de substrats carbonés marqués.
- Récolter les micro-organismes et extraire les acides aminés.
- Hydrolyser et dériver les acides aminés en vue de leur analyse.
- Appliquer les échantillons à la GC-MS pour l'analyse des voies métaboliques.
Résultats principaux
- Identification de motifs uniques de marquage dans les acides aminés.
- Reconstruction de voies métaboliques fonctionnelles.
- Connaissances approfondies sur les mécanismes métaboliques des micro-organismes étudiés.
Conclusions
- Le marquage isotopique au carbone-13 est efficace pour l'étude du métabolisme microbien.
- La GC-MS fournit des informations détaillées sur les voies métaboliques.
- Cette méthode peut être appliquée à divers types de micro-organismes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La confirmation des voies métaboliques à l'aide du marquage isotopique au 13C des acides aminés protéinogènes permet une caractérisation fonctionnelle du métabolisme microbien, soutenant ainsi la validation des cibles en phase précoce de découverte. Cette approche fournit des données sur les isotopomères qui précisent les flux de carbone centraux et identifient de nouvelles fonctions enzymatiques, réduisant l'ambiguïté mécanistique dans l'élucidation des voies métaboliques. En fournissant des profils de marquage quantitatifs issus de métabolites précurseurs clés, elle renforce la fiabilité prédictive pour le choix des souches et les décisions d'ingénierie en biotechnologie industrielle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses thérapeutiques en confirmant les voies métaboliques actives par le traçage des isotopomères.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle des cibles en reliant les substrats marqués à des réactions enzymatiques spécifiques.
- Valeur prédictive : Aide au tri du portefeuille en révélant si les voies prédites sont fonctionnellement utilisées in vivo.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés par hydrolyse de la biomasse afin d'extraire les acides aminés destinés à une analyse en GC-MS en aval.
- Résultats quantitatifs : Génère des profils d'isotopomères (M0–M4) permettant des mesures de flux reproductibles dans différentes conditions.
- Utilité de la plateforme : Met en place un protocole standardisé pour le criblage de souches microbiennes utilisant diverses sources de carbone.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la confirmation du chemin métabolique au stade de la découverte à la validation préclinique par l'intermédiaire de nœuds métaboliques pertinents pour la maladie.
- Alignement des biomarqueurs : Suit le marquage de huit précurseurs centraux des métabolites qui corrélatent avec l'activité du chemin métabolique et les variations de flux.
- Avancement ajusté au risque : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant en confirmant si les voies métaboliques conçues produisent les signatures isotopomériques attendues.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, allant du test d'hypothèses à l'identification de composés d'intérêt, en fournissant des données métaboliques fonctionnelles qui complètent les approches omiques.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies métaboliques et la réduction des risques biologiques en confirmant les itinéraires de transition du carbone dans le métabolisme central.
- Criblage : Fournit des extraits d'acides aminés prêts à l'essai, accompagnés de protocoles de dérivation adaptés à une détection par GC-MS à haute sensibilité.
- Analytique : Fournit des données d'isotopomères de masse permettant la comparaison des flux métaboliques entre souches sauvages et souches modifiées.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en validant le marquage des métabolites précurseurs liés aux voies de production du rendement du produit.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour la caractérisation du métabolisme microbien dans plusieurs projets et sources de carbone.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la fonctionnalité des voies métaboliques et réduit les faux positifs issus uniquement des données transcriptomiques ou protéomiques.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des paramètres standardisés de l'hydrolyse, de la dérivation et de la GC-MS.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en réduisant les risques associés aux cibles d'ingénierie de souches avant le passage à l'échelle.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des souches microbiennes en fonction de l'utilisation confirmée des voies métaboliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture microbienne, marquage isotopique et utilisation du GC-MS.
- Dépend de l'accès à un équipement de GC-MS doté d'une plage de masse adéquate (60–500 m/z) et d'une programmation thermique appropriée.
- Implique une standardisation inter-équipes de la préparation des milieux minimaux et du choix des substrats marqués.
- Suppose des adaptations lors de l'application à des organismes non modèles présentant des voies de biosynthèse des acides aminés différentes.
- Comprend des limites pratiques telles que le bruit induit par la dérivation provenant des isotopes naturels, corrigeable à l'aide d'outils logiciels publiés.
