Name: Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Découvrez la culture d'explants de ganglion statoacoustique et de moelle épinière de poussin dans des gels de collagène 3D. Cette méthode permet d'évaluer la croissance des neurites en réponse aux facteurs de croissance.

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Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de la Subvention RO1DC002756 Purdue Research Foundation. Nous tenons à remercier Doris Chang Wu et Wiese pour des conseils avec des expériences et McPhail Rodney à l&#39;aide de chiffres.

Recettes Ringers Chick <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Eau (grade de culture de tissus) </td></tr></tbody></table> Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez un volume final de 1000 ml avec de l&#39;eau. PBS 10X <table border="1"><tbody><tr><td> 40 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 7 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,2 g </td><td> KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 450 ml </td><td> Eau DEPC </td></tr></tbody></table> Remarque: Ajuster le pH à 7,4. Apportez finalesvolume à 500 ml avec de l&#39;eau. La concentration de travail (1X) est obtenue en diluant une partie des stocks 10X à 9 parties d&#39;eau de qualité culture tissulaire, telle que celle obtenue avec un système d&#39;irradiation UV Millipore pour générer de l&#39;eau avec 18 MQ cm conductivité. SAG moyennes explant tenant <ul><li> DMEM/F12 avec L-glutamine, 10 mM Hepes </li><li> L&#39;insuline de 10%, Transfert, Sélénium (STI 1) </li><li> 1% stylo-strep </li></ul> Milieu de culture des explants <ul><li> SAG moyennes explant tenant </li><li> 10 ng / ml neurotrophine-3 (NT-3) </li><li> 10 ng / ml de facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) </li></ul> Dissection de la moelle épinière et moyennes tenant <ul><li> L-15 </li><li> 10% sérum de veau foetal </li><li> 1% stylo-strep </li></ul> Incuber les œufs à 37-38 ° C. Stériliser les outils et les disséquer plat Sylgard dissection de l&#39;éthanol à 70%. Disséquer la vaisselle et les outils peuvent également être stérilisée aux UV pendant la nuit. <ol><li> Placez des perles dans un microtube avec 1 ml de PBS stérile, mélanger et attendre que les perles de s&#39;installer au fond du tube. </li><li> Laver les billes plusieurs fois en enlevant le surnageant après les perles se sont installés et remettre en suspension dans du PBS. </li><li> Incuber les billes en protéine purifiée (dilué dans du PBS) ou du PBS seul (contrôle) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincez les perles dans du PBS et de stocker dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS avant d&#39;être placée dans le collagène. </li></ol> 2. La dissection ganglionnaire Statoacoustic <ol><li> Sur E4 retirer l&#39;embryon de l&#39;oeuf et le placer dans un plat avec une solution de Ringer chiches pour enlever les membranes embryonnaires humaines. </li><li> Placez l&#39;embryon dans un plat Sylgard © bordée de Pétri remplie de HBSS froid et la position de l&#39;embryon sur le côté avec la vésicule otique vers le haut. Pin de l&#39;embryon à l&#39;antenne utilisant des goupilles de dissection. </li><li> En utilisant deux broches de dissection, faire une coupe horizontale à travers la peau immédiatement à l&#39;ventralesachets canal, à peu près où il rencontre le conduit cochléaire. Faire une coupe verticale antérieure et postérieure à la SAG. Utilisez une pince ou une épingle à dissection pour soulever et retirer le lambeau de peau bordée par les trois coupes. Remarque: Le SAG est situé au bord de l&#39;antéroventral otocyste, à mi-chemin entre la poche dorsale, qui est facilement visible avec un éclairage de base clair, et le conduit cochléaire ventrale qui projette ventromedially et est obscurci par les arcs branchiaux. Le s&#39;allonge cochléaire conduit donc sa dimension dorsoventral augmentera progressivement sur E4 entre Hamburger-Hamilton phases 23 à 25 septembre. </li><li> Tirez le otocyste dans une direction postérieure à le séparer de la SAG. Déplacer les tissus environnants le SAG avec des épingles de dissection et retirer délicatement le SAG de l&#39;embryon en utilisant # 55 forceps. Retirer de grands morceaux de tissu mésenchymateux et de faisceaux de nerfs sortant de la SAG. </li><li> En utilisant une pointe à large embouchure pipette, transférer l&#39;explant à un24 puits, la plaque avec 0,5 ml explant SAG la tenue moyenne. Gardez explants sur la glace ou à température ambiante pendant 4 heures. </li></ol> 3. Dissection de la moelle épinière <ol><li> Retirez l&#39;embryon E6 de l&#39;œuf et le placer dans un plat contenant une solution de Ringer chiches. Retirer la tête et les membranes embryonnaires humaines. </li><li> Placer le corps dans un plat de Sylgard © dissection froide contenant moyenne vertébrale de dissection du cordon. Position et la broche de l&#39;embryon &quot;bas ventre&quot; et caudale face à l&#39;expérimentateur. Placez broches dissection travers chaque membre et par l&#39;extrémité antérieure. </li><li> En utilisant des pinces et / ou dissection broches, retirez délicatement la peau et des tissus, se déplaçant dans une direction ventrale, jusqu&#39;à ce que la surface dorsale de la moelle épinière est visible. </li><li> Couper la ligne médiane dorsale de la moelle épinière avec une épingle de dissection, dans un postérieur à la direction antérieure, sur toute la longueur de la moelle épinière. Cela crée un «livre ouvert», comme les côtés gauche et droit de la moelle épinière séparée. </li><li&gt; Enlever les tissus environnants, latéralement, à isoler la moelle épinière et d&#39;exposer les ganglions de la racine dorsale (DRG). Retirez le DRG et les méninges en frottant une épingle ou une pince à disséquer entre la moelle épinière et les DRG. </li><li> Retirer la moelle épinière du corps en tenant l&#39;extrémité caudale le plus de la moelle épinière avec une pince de levage et de haut et loin de l&#39;expérimentateur. Retirer DRG restantes et les méninges. </li><li> Tenir une extrémité de la corde spinale l&#39;aide d&#39;une pince (ou la broche à l&#39;antenne) et utiliser des ciseaux pour couper le long Vannas la ligne médiane ventrale, pour bissectrice la moelle épinière. </li><li> Tenir une extrémité de l&#39;explant avec des pinces pour immobiliser le tissu et utiliser des ciseaux pour couper Vannas explants petite (100-500 um de longueur) sur toute la longueur du tissu. La plaque de sol peut être reconnu comme un épaississement des tissus clairs long d&#39;un bord explant. </li><li> Utiliser une pipette à large embouchure de transfert des explants sur une plaque de 24 puits avec 0,5 ml de dissection moyennes froid. Gardez explants sur la glace pour maintenir la viabilité des tissus, fou jusqu&#39;à 4 heures. </li></ol> 4. Explantation de la culture avec des protéines purifiées afin de tester la réactivité des neurites <ol><li> Préparer une solution de collagène 1,5 mg / ml dans un tube de 15 ml conique, sur la glace, selon les instructions du fabricant. </li><li> Vérifier la solution de collagène a un pH de 7 à 7,4 sur le papier indicateur de pH à l&#39;aide. Ajuster le pH en ajoutant du NaOH en volumes de 1 pl. </li><li> Transfert des explants à une plaque de 24 puits en utilisant une pointe large bouche pipette et aspirer le liquide en excès. Explants multiples peuvent être cultivées dans un puits, mais doit être placé à au moins 500 um uns des autres. </li><li> Ajouter 0,5 ml de collagène pour le puits contenant l&#39;explant. Position de l&#39;explant sur la surface du fond du puits. Veillez à régler chaque culture complètement avant de procéder à la même suivant car le collagène commence à polymériser à température ambiante. </li><li> Placer la plaque de culture sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Lorsque le collagène a polymerized qu&#39;il ressemble à un gel. </li><li> Ajouter 0,5 ml de milieu de culture chaleureuse explant soit complétée par des protéines purifiées (dilué dans du PBS) ou de PBS (contrôle) et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Effets sur la croissance des neurites doit être visible par les 24 heures. NOTE: Nous avons utilisé le même protocole pour la culture des explants SAG jusqu&#39;à 42 heures. </li></ol> 5. Explantation de co-culture avec des billes recouvertes de protéines pour tester neurites directionnels <ol><li> Commencez avec des étapes de la culture des explants 04/01 au 04/04. </li><li> Aide d&#39;une pipette, transférer les billes de 1-5 PBS pour le puits contenant la solution de collagène et d&#39;explantation. </li><li> Utilisez une pince à la position des billes de 50 à 500 um à partir du bord de l&#39;explant. </li><li> Placer la plaque sur un 37 ° C plus chaude glisser pendant 30-45 min à polymériser le collagène. Le tissu ou une bille peut devenir déplacées comme le collagène se polymérise. Vérifiez les cultures et les re-positionner le tissu et perles au cours des 5 premières minutes. </li><li> Ajouter 0,5 mL SAG médias à chaque puits et incuber pendant 24 heures. </li></ol> 6. Visualisation des neurites par immunohistochimie <ol><li> Rincez les cultures dans le PBS et fixer pendant 1 heure à température ambiante dans du paraformaldéhyde 4% dans le PBS. </li><li> Communiqué de gels sur les murs des puits en traçant autour du bord des gels avec l&#39;extrémité arrondie d&#39;une spatule en téflon micro. Effectuez la immunocoloration avec les gels dans les puits. Rincez plusieurs fois dans du PBS. </li><li> Incuber dans 0,5 ml de solution de blocage (10% de sérum de veau, 0,1% de Triton X-100, l&#39;azoture de sodium à 0,1% dans PBS) pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Incuber dans 0,5 ml d&#39;anticorps primaire (anticorps anti-β-tubuline anticorps dilué 1:500 dans une solution de blocage) nuit à 4 ° C. </li><li> Rincez plusieurs fois dans du PBS. Incuber dans 0,5 ml d&#39;anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris 2b anticorps dilué 1:500) nuit à 4 ° C. De ce pas en avant, garder les plaques dans l&#39;obscurité ou envelopper dans du papier, en raison de sensibilité à la lumière desAnticorps secondaires. </li><li> Rincez plusieurs fois dans du PBS et conserver à 4 ° C dans du PBS pendant une semaine au maximum. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig1.jpg" /> Figure 1. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion des purifiée NT-3 et NT-3-billes recouvertes sur des explants E4 SAG poussin. SAG corps cellulaires des neurones et les neurites étaient immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un objectif 10x sur un microscope confocal. Après 24 heures in vitro, d&#39;explants SAG affiché excroissance des neurites plus grande en présence de 100 ng / ml humaine purifiée NT-3 ajoutés au milieu de culture cellulaire (1B), comparé aux contrôles (1A). Neurones SAG ont été co-cultivées avec des perles trempés dans 100 ng / ml de NT-3 à démontrer que d&#39;une source ponctuelle de NT-3 peut localement favoriser la croissance des neurites. Les explants affiché plus longtemps et plus dense excroissance des neurites sur le côté de laexplant face du talon par rapport au côté opposé (1D) et par rapport aux cultures témoins avec des perles trempée dans du PBS (1C). Barre d&#39;échelle = 200 pm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3600/3600fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs des effets des neurites de promotion de la purifier et la Wnt5a Wnt5a enduit de perles sur cordon E6 chiches épinière. Explants de la moelle épinière ont été immunocolorées avec β-tubuline et imagé avec un microscope confocal. Après 24 heures de croissance, en présence de la souris purifiée Wnt5a (400ng/ml), la croissance des neurites à partir d&#39;explants de poussins de la moelle épinière a été augmenté (2B) par rapport aux témoins cultivés sans Wnt5a (2A). Perles trempée dans 500 ng / ml Wnt5a, placé 300-500 um à partir du bord des explants de la moelle épinière, a également favorisé la croissance des neurites (2D) par rapport aux cultures témoins (2C). Similaires de co-culture des résultats ont déjà été publiés avec des cellules exprimant Wnt5a 8. Barre d&#39;échelle = 200um.

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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li>
<li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li>
<li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li>
<li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous présentons une méthode de disséquer et de la culture E4 SAG et E6 explants de la moelle épinière, de poussins, sous des conditions sans sérum. Cette procédure est actuellement utilisée dans notre laboratoire pour étudier les effets des différents ligands sécrétés sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. De nouveaux aspects de ce protocole comprennent l&#39;utilisation d&#39;un système sans sérum pour les explants en culture et l&#39;utilisation de billes trempées dans les facteurs de croissance...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Équipement </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td> Nous utilisons un Leica M80 stéréomicroscope avec éclairage fond clair de base </td></tr><tr><td> Glissez chauds </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collagène de polymérisation </td></tr><tr><td> Oeuf de poule couveuse </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% de CO 2 humidifié incubateur de culture cellulaire </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matériaux Dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;copie; revêtement boîte de Pétri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 puits, plaque de culture cellulaire </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Pince Dumont </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Goupilles en acier inoxydable dissection </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Embryon épinglage, la dissection fines </td></tr><tr><td> Moria cuillère perforée </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10370-17 </td><td> La récolte des embryons / transfert </td></tr><tr><td> 200 pi larges embouts de pipettes bouche </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Le transfert des explants </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 et E6 des oeufs de poule </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Chick solution de Ringer </td><td></td><td></td><td> La récolte des embryons </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissection </td></tr><tr><td> Milieu L15 </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Spinal moyenne de dissection du cordon </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Spinal moyenne de dissection du cordon </td></tr><tr><td> Ciseaux Vannas </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501778 </td><td> Dissection de la moelle épinière </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Préparation de collagène </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagène de type I de queue de rat </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> La culture des explants </td></tr><tr><td> PBS 10X (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutralize collagène </td></tr><tr><td> NaOH 1N (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutraliser le collagène </td></tr><tr><td> L&#39;eau distillée (stérile) </td><td></td><td></td><td> Pour neutraliser le collagène </td></tr><tr><td> papiers indicateurs de pH (de 6.0 à 8.1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Pour vérifier le pH de collagène </td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 ul larges embouts de pipettes bouche </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Pour collagène pipette </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La culture des explants </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Milieu de culture des explants </td></tr><tr><td> SES 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Supplément de milieu </td&gt; </tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> CNTF (rat) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> NT-3 (humain) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Supplément de milieu </td></tr><tr><td> Purifiée de souris Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel perles de gel bleu </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;immunohistochimie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixation </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Rinçages </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> Sodiumazoture </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> De sérum de veau </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solution de blocage </td></tr><tr><td> Monoclonaux de souris anti-IgG2b β tubuline 1 + anticorps II </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Les étiquettes des organismes cellulaires et neurites </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG2 anticorps b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> La tubuline β détecte les anticorps </td></tr><tr><td> Téflon micro spatule </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Des gels de collagène Libération de bien </td></tr></tbody></table>

dissection et la culture de cellules de ganglions et de chick statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Les organes sensoriels de l&#39;oreille interne de poulet sont innervés par le processus périphériques du ganglion statoacoustic (SAG) des neurones. Innervation organe sensoriel repose sur une combinaison de signaux de guidage axonal 1 et 2 facteurs de survie situé le long de la trajectoire des axones en croissance et / ou au sein de leurs objectifs organe sensoriel. Par exemple, les interférences fonctionnelles avec une voie de guidage des axones classiques de signalisation, sémaphorine-neuropiline, a généré l&#39;erreur d&#39;acheminement des axones otique 3. En outre, plusieurs facteurs de croissance exprimés dans les objectifs sensorielles de l&#39;oreille interne, y compris la neurotrophine-3 (NT-3) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), ont été manipulées dans des animaux transgéniques, conduisant de nouveau à l&#39;erreur d&#39;acheminement de 4 axones SAG. Ces mêmes molécules promouvoir à la fois la survie et la croissance des neurites de neurones in vitro de la SAG chiches 5,6. Ici, nous décrire et démontrer la méthode in vitro nous sommes actuellement uchantent pour tester la réactivité des neurites SAG chiches aux protéines solubles, y compris morphogènes connus tels que les Wnts, ainsi que les facteurs de croissance qui sont importants pour la promotion de la croissance des neurites SAG et la survie des neurones. L&#39;utilisation de ce système modèle, nous espérons pouvoir tirer des conclusions sur les effets que les ligands sécrétés peuvent exercer sur la survie des neurones SAG et la croissance des neurites. Explants SAG sont disséqués au jour embryonnaire 4 (E4) et cultivées dans des gels de collagène en trois dimensions dans un milieu sans sérum pendant 24 heures. Tout d&#39;abord, la réactivité des neurites est testé par des explants de culture avec des protéines complétés moyenne. Puis, de se demander si les sources ponctuelles de ligands sécrétés peuvent avoir des effets directionnels sur l&#39;excroissance des neurites, les explants sont co-cultivées avec des billes recouvertes de protéines et analysés pour la capacité de la perle localement promouvoir ou inhiber le développement. Nous incluons également une démonstration de la dissection (modifié le protocole 7) et la culture des explants E6 moelle épinière. Nousutilisent couramment des explants de moelle épinière pour confirmer la bioactivité des protéines et protéines-trempés perles, et de vérifier les espèces réactivité croisée avec des tissus de poussins, dans les conditions même culture que les explants SAG. Ces tests in vitro sont pratique pour rapidement criblage de molécules qui exercent trophiques (survie) ou Tropic (directionnelle) effets sur les neurones du SAG, surtout avant d&#39;effectuer des études in vivo. Par ailleurs, cette méthode permet de tester des molécules individuelles dans un milieu sans sérum, avec des neurones de survie élevé 8.

Nous démontrons comment disséquer et à la culture chiches E4 et E6 ganglionnaires statoacoustic explants de la moelle épinière. Les explants sont cultivés dans un milieu sans sérum dans des gels de collagène 3D pour 24 heures. Réactivité neurites est testé avec support du facteur de croissance complété et revêtu de protéine avec des perles.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

Les organes sensoriels de l'oreille interne du poulet sont innervés par les prolongements périphériques des neurones du ganglion statoacoustique (SAG). L'innervation des organes sensoriels...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer la croissance des neurites dans les neurones du ganglion stato-acoustique cultivés in vitro en présence de divers facteurs de croissance ajoutés au milieu. Cette évaluation est réalisée en premier lieu en dissociant le ganglion stato-acoustique et les moelles épinières contrôles à partir de l'embryon afin de produire X explants pour culture. Dans un deuxième temps, les X explants sont placés dans du collagène, soit en présence de protéines solubles afin d'évaluer la croissance globale, soit avec des billes revêtues de protéines afin d'évaluer une croissance directionnelle.Les explants X suivants sont marqués avec un anticorps anti-bêta-tubuline et observés au microscope confocal. Afin de visualiser les neurites émergeant du ganglion, des résultats sont obtenus qui montrent les effets que peuvent exercer les ligands sécrétés sur la survie neuronale et la croissance des neurites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche auditive, telles que quelles molécules sont importantes pour la survie des neurones otiques et le guidage des axones lorsque les organes sensoriels deviennent inn

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Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en...

Décrypter Pathways axonale des groupes génétiquement définis de neurones dans le tube neural Chick Utilisant In ovo L&#39;électroporation

Ce test évalue la capacité d'une molécule de signalisation, voici protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7), à réorienter les axones commissuraux. Un explant de la moelle épinière embryonnaire dorsal est cultivée adjacente à un agrégat de cellules COS sécrétant des facteurs de croissance candidat. Réorienté axones commissuraux croissante au sein de l'explant sont visualisées par immunohistochimie.

Dosage de la capacité des molécules de signalisation diffusibles à réorienter embryonnaires épinière axones commissuraux

Explants du système dopaminergique mésencéphale et le striatum sont utilisés dans un essai de matrice de collagène pour...

Dissection et de la culture de la souris dopaminergique et des explants striataux en trois dimensions dosages matrice de collagène

Cette vidéo montre le processus d’isolement des explants de ganglions spiralés de l’oreille interne et de leur co-culture avec l’organe de Corti sur un réseau de multiélectrodes. Les ganglions en spirale sont soigneusement extraits et sectionnés en sections de tissus plus petites ou en explants. Ces explants sont cultivés sur la zone active du réseau de multiélectrodes pour favoriser la croissance des processus neuronaux.

Culture d’explants de neurones du ganglion spiralé murin sur des réseaux de multiélectrodes

Cette vidéo montre la construction d’un système de culture cellulaire à trois compartiments à l’aide de collagène et de graisse non réactive. Ce système est utilisé pour observer les interactions entre les cellules de gliome et les axones en temps réel.

Préparation de boîtes de culture compartimentées enrobées de collagène pour la culture de cellules neuronales

Cette vidéo montre le modèle de coculture d’un explant ganglionnaire de la racine dorsale et de cellules de Schwann. Dans des conditions de coculture, l’acide ascorbique favorise la différenciation des cellules de Schwann en formes myélinisantes. Les cellules de Schwann myélinisantes enveloppent les axones plusieurs fois pour créer une gaine de myéline, essentielle à la fonction nerveuse.

Co-culture d’un explant de ganglion de la racine dorsale avec des cellules de Schwann pour la myélinisation des neurones

Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s'étendent.

Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

modèles de culture cellulaire fournissent un contrôle détaillé sur les conditions environnementales et fournissent ainsi une plate-forme puissante pour élucider de nombreux aspects de la biologie des cellules neuronales. Nous décrivons un procédé rapide, peu coûteux et fiable afin d'isoler, de dissocier et de la culture des neurones sensoriels de l'embryon de poulet. Détails de la préparation des substrats et immunocytochimie sont également fournis.

Isolement et culture de dissocié neurones sensoriels De embryons de poulet

Nous présentons un protocole pour cultiver des explants primaires de neurones murins du ganglion spiralé sur des réseaux multi-électrodes afin d’étudier les profils de réponse neuronale et d’optimiser les paramètres de stimulation. Ces études visent à améliorer l’interface neurone-électrode des implants cochléaires au profit de l’audition des patients ainsi que de la consommation d’énergie du dispositif.

Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique. Les cultures neuronales des neurones de CG de poussin ont été montrées pour être des modèles de cellules efficaces dans l’étude des interactions de muscle nerveux. Nous décrivons un protocole détaillé pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones de CG des embryons de poussin.

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Découvrez la culture d'explants de ganglion statoacoustique et de moelle épinière de poussin dans des gels de collagène 3D. Cette méthode permet d'évaluer la croissance des neurites en réponse aux facteurs de croissance.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites (Vidéo) | JoVE Journal

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

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