Application de la MassSQUIRM pour des mesures quantitatives de l'activité Déméthylase Lysine

Le protocole de squirm de masse vise à quantifier l’activité de la lysine déméthylase à l’aide de la méthylation isotopique et la spectrométrie de masse maldi effectue d’abord des réactions de déméthylation catalysées par des enzymes sur des peptides contenant de la lysine méthylée. Les résidus méthylent ensuite chimiquement les produits peptidiques de la réaction de déméthylase avec le formaldéhyde deutéré pour produire des peptides uniformément méthylés qui s’ionisent de la même manière par maldi, procèdent à la quantification de chaque espèce de peptide avec la spectrométrie multi à masse et tiennent compte du chevauchement isotopique. Afin d’identifier les quantités relatives de peptides méthylés un mono colorant et trimm, les résultats de la pression massique déterminent les quantités relatives de chaque produit de réaction de la déméthylase en fonction des changements de masse.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la spectrométrie de masse moisie de routine est que le score de masse tient compte des différences d’ionisation entre des peptides méthylés différemment. Nous avons eu l’idée de cette approche pour la première fois lorsque nous avons développé une méthode pour mesurer les niveaux d’acétylation des histones à l’aide d’anhydride acétique isotopiquement lourd. Le défi de cette technique est d’extraire des données sur la surface des pics, ce qui peut être compliqué par le chevauchement des enveloppes isotopiques des peptides.

Pour la réaction de déméthylase, combinez 125 nanogrammes de lysine recombinante, une enzyme déméthylase avec 0,25 microgramme de diméthylhisone B biotinylée, un peptide dans un volume final de 20 microlitres de tampon de déméthylase. Préparez également un échantillon de contrôle contenant 0,25 microgramme de peptide sans l’enzyme LSD, incubez la réaction et contrôlez les tubes pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, pour préparer R, deux billes poreuses de 20 microns mélangent des volumes égaux de billes et de méthanol.

Ajoutez ensuite 10 volumes d’acide formique TFA, ajoutez huit microlitres de billes poreuses à chaque échantillon et agitez pendant 15 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, conditionnez deux pointes de fermeture éclair C 18. Pipetage deux fois avec 20 microlitres de 0,1 % TFA quatre fois avec 70 % de nitrile acéto 0,1 % TFA, et quatre fois à nouveau avec 0,1 % TFA.

Ensuite, chargez les deux échantillons sur les pointes de fermeture éclair conditionnées. À l’aide d’une pipette, poussez le volume à travers la résine C 18. Répétez l’opération jusqu’à ce que le volume total des deux échantillons ait été poussé à travers les pointes de la fermeture éclair.

Ensuite, lavez deux fois les pointes de la fermeture éclair avec 20 microlitres d’échantillons d’élute TFA à 0,1 % dans un tampon d’illusion de 40 microlitres, procédez au séchage complet avec un concentrateur d’aspiration rapide. Tout d’abord, remettez l’échantillon en suspension dans 100 microlitres de tampon phosphate 50 millimolaires pH 7,4. Ajoutez ensuite huit microlitres de diméthylamine d’alésage et 16 microlitres de formaldéhyde déclassé.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Répétez la méthylation réductrice en ajoutant de la diméthyllamine forante et du formaldéhyde deutéré et incubez pendant deux heures. La troisième fois, ajoutez de la diméthyllamine forante et incubez à quatre degrés Celsius pendant 15 heures.

Trempez la réaction avec 12,5 microlitres d’une molaire de pH 7,4 et séchez complètement avec un concentrateur d’aspirateur rapide. Tout d’abord, suspendez les échantillons de contrôle et de réaction de déméthylase dans 100 microlitres de tampon de phosphate de 50 millimolaires pH 7,4.

Ajoutez maintenant huit microlitres de billes poreuses aux échantillons de réaction de contrôle et de déméthylase et collectez-les sur les pointes de la fermeture éclair comme indiqué précédemment. S’infiltrer dans des volumes de deux microlitres sur une plaque d’échantillonnage MALDI et laisser sécher à température ambiante jusqu’à la cristallisation. Procéder à l’analyse des échantillons par spectrométrie de masse.

Ouvrez les fichiers spectro dans le logiciel de travail et exportez-les vers le logiciel M sur Z. Vérifier davantage les produits de réaction par spectrométrie de masse en tandem. Tout d’abord, déterminez le rapport de surface des pics des isotopes du carbone 13 C deux et du carbone 13 C quatre par rapport au pic isotopique mono-isotopique de l’échantillon témoin.

Utilisez ces ratios calculés pour quantifier la quantité relative de peptide existant dans chaque modification. État de l’échantillon de réaction de déméthylase. L’enzyme LSD peut être utilisée efficacement dans la quantification de la déméthylation de la lysine.

Étant donné que la réaction de contrôle ne subit pas de méthylation réductrice, elle indique l’enveloppe isotopique typique de ce peptide. Les zones de pics résultantes déterminent les rapports de fond du peptide existant dans le carbone 13 C deux et le carbone 13 C quatre. Les états isotopiques, les zones de pics du spectre de masse pour la réaction de contrôle permettent de quantifier la quantité relative de peptide existant dans chaque état de modification. Dans la réaction de déméthylase, les zones de pic de ces réactions de contrôle et de déméthylase déterminent 33,7 % de diméthyllysine 4, 42 0,3 % de monométhyllysine quatre et 24 % de lysine quatre non méthylée.

Cette approche de squam de masse offre des informations clés dans le domaine de l’épigénétique des histones, comme la façon dont la déméthylation des résidus de lysine d’histones contribue à diverses maladies. Bien que ce test de méthylation ait été appliqué à l’étude des déméthylases, il peut également être utilisé pour étudier les méthyltransférases.