Name: Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Découvrez la microscopie intravitale quantitative pour analyser la mobilité des parasites du paludisme et la circulation sanguine dans la rate de souris infectées par des parasites transgéniques GFP.

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Nous sommes particulièrement reconnaissants à S. et V. Graewe Heussler pour la formation initiale et continue en entrée microscopie intravitale des parasites du paludisme, de J. Burns pour le don de la GFP parasites transgéniques, à A. Bosch (Unité confocale, CCIT-UB, IDIBAPS) d&#39;assistance dans l&#39;analyse d&#39;image et de la quantification et à P. Astola d&#39;assistance technique. Nous remercions Tous R. et I. Caralt pour la production vidéo. MF est un bénéficiaire d&#39;une bourse d&#39;études supérieures de la Généralité de Catalogne. HAP est un professeur de recherche ICREA. Le travail dans le laboratoire de HAP est financé par le Programme de la Communauté européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° 242095, par le privé CELLEX Foundation (Catalogne, Espagne), et par le ministère espagnol de la science et l&#39;innovation ( SAF2009-07760).

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La mise en œuvre de la microscopie intravitale de la rate dans ce modèle du paludisme des rongeurs a ouvert la possibilité d&#39;enquêter sur le passage dynamique des parasites par cet organe qui a été jusqu&#39;à présent considéré comme une «boîte noire» en raison de considérations techniques. Ici, un effort majeur a été mis à adapter une méthode quantitative qui permet une analyse comparative des lignes parasites différents niveaux unique et de la population. Contrairement à d&#39;autres tissus et cellules qui avaient...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Leica TCS SP5-microscope confocal </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Allemagne </td><td> TCS-SP5 N ° de série. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Le midazolam 15 mg / 3 ml </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70000 MW Dextran, conjugué au Texas Red </td><td> Molecular Probes </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Isothiocyanate de fluorescéine, l&#39;isomère I (FITC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Solution de travail est à 10% dans de l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> Super Glue-3 Loctite </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie intravitale de la rate: analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

L&#39;avènement de la microscopie intravitale dans des modèles expérimentaux de paludisme des rongeurs a permis des avancées majeures à la connaissance de parasite-hôte 1,2 interactions. Ainsi, l&#39;imagerie in vivo des parasites du paludisme au cours stades pré-érythrocytaires ont révélé l&#39;entrée active de parasites dans les ganglions lymphatiques peau 3, le développement complet du parasite dans la peau 4, et la formation d&#39;un merosome hépatocytes dérivés pour assurer la migration et libération de mérozoïtes dans la circulation sanguine 5. Par ailleurs, le développement de parasites individuels dans les érythrocytes a été récemment documenté en utilisant l&#39;imagerie 4D et a contesté notre point de vue actuel sur l&#39;exportation de protéines dans le paludisme 6. Ainsi, l&#39;imagerie intravitale a radicalement changé notre vision sur les événements clés dans le développement de Plasmodium. Malheureusement, les études sur le passage dynamique des parasites du paludisme à travers la rate, un organe majeur lymphoïdes délicieusement adapté à claire rouge infecté bcellules lood manquent en raison de contraintes techniques. En utilisant le modèle murin de paludisme à Plasmodium yoelii de souris Balb / c, nous avons mis en imagerie intravitale de la rate et rapporté un remodelage différentiel de lui et l&#39;adhérence des globules rouges parasités (culot globulaire) à des cellules d&#39;origine fibroblastique barrière dans la pulpe rouge pendant l&#39;infection par le parasite du non-létales ligne 17X P.yoelii par opposition aux infections à la ligne P.yoelii 17XL mortelle du parasite 7. Pour arriver à ces conclusions, une méthodologie spécifique en utilisant le logiciel libre ImageJ a été développé pour permettre la caractérisation de la vitesse en trois dimensions des mouvements mono-culot globulaire. Les résultats obtenus avec ce protocole permettra de déterminer le temps de vitesse, la directivité et de séjour des parasites dans la rate, tous les paramètres d&#39;adressage adhésion in vivo. En outre, nous présentons la méthodologie pour la quantification du flux sanguin en utilisant la microscopie intravitale et l&#39;utilisation de DIFdifférents agents colorants pour mieux comprendre la structure complexe de la microcirculation de la rate. Déclaration d&#39;éthique Toutes les études animales ont été effectuées dans les installations animales de l&#39;Université de Barcelone, en conformité avec les directives et protocoles approuvés par le comité d&#39;éthique pour l&#39;expérimentation animale de l&#39;Université de Barcelone CEEA-UB (Protocole n ° DMAH: 5429). Femme souris Balb / c de 6-8 semaines d&#39;âge ont été obtenues de Charles River Laboratories.

Nous montrons la méthode pour effectuer la microscopie intravitale de la rate à l&#39;aide des parasites du paludisme transgéniques GFP et la quantification de la mobilité et la circulation sanguine du parasite au sein de cet organe.

Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

L'avènement de la microscopie intravitale dans les modèles expérimentaux de paludisme chez le rongeur a permis des progrès majeurs dans la connaissance des interactions parasite-hôte 1,2. ...

Dans cette procédure, nous présentons une approche de microscopie intravitale quantitative permettant d'évaluer la dynamique du passage des parasites à travers la rate. Dans un modèle de paludisme chez le rongeur, des souris infectées par des parasites transgéniques exprimant la GFP sont préparées pour la microscopie intravitale ; la canulation de la veine splénique permettra l'injection de colorants intravitaux. Au cours de l'expérience, les cellules fluorescentes sont observées en mouvement dans différentes régions de la rate.Nous fournissons la modélisation permettant de décrire la mobilité des parasites dans le compartiment lent tridimensionnel de la pulpe rouge et de calculer le débit sanguin dans les vaisseaux. Ces paramètres ont été utilisés pour comparer la dynamique splénique de deux souches PULE. Bonjour à tous.Je m'appelle Nando El Portillo et l'une des principales questions de recherche dans mon laboratoire est de tenter de comprendre le rôle de la rate dans le paludisme. La splénomégalie est l'un des signes caractéristiques de cette maladie, mais en raison de contraintes techniques et éthiques, il est très difficile d'effectuer des études sur cet organe. Pour y parvenir, nous avons mis en œuvre des technologies qui nous permettent d'observer le passage dynamique de ce parasite et de quantifier ce phénomène.Ce que Lorena et MI expliqueront dans ces protocoles. Cette recherche est en partie menée en collaboration avec les équipes du Dr. Ler, de l'Université de Hambourg en Allemagne, et du Dr. Maria Kbo ici à l'hôpital Clinic, et a bénéficié d'un financement général de la fondation Cellex et du ministère CIA. L'infection est initiée à partir d'un donneur M infecté par des parasites GFP, soit létaux soit non létaux, à 10 % de parasitémie. Pour vérifier la présence du parasite, prélevez une petite goutte de sang à partir de la veine de la queue de la souris et étalez-la sur une lame de microscope.Faites glisser une coloration chole métrique avec la solution de GIMs. Une solution permettra la visualisation des globules rouges infectés une fois séchée ; fixez l'empreinte sanguine avec du méthanol pendant deux minutes, appliquez la solution de GIMs et incubez pendant 20 minutes. Rincez la lame avec de l'eau du robinet courante et séchez. Dénombrer le pourcentage de GBIs par rapport au nombre total de GR à l'aide d'un microscope optique avec un objectif à immersion huile 100 x.Infecter des souris avec des parasites létaux ou non létaux obtenus à partir du sang de la queue de souris donneuses, dilués dans du PBS. Ajuster la dose afin d'injecter un demi-million de parasites par souris, de manière à atteindre un taux parasitémique périphérique de 1 % au troisième jour post-infection, et injecter par voie intrapéritonéale. Alternativement, des GR marqués au FITC peuvent être utilisés comme contrôle.Les animaux prélèvent un millilitre de sang artériel sur une souris et lavent le culot par centrifugation dans du PBS contenant du EDTA, puis incubent dans une solution de FITC pendant deux heures à l'abri de la lumière avec une agitation douce. Au terme de cette période, éliminer le surnageant par centrifugation et effectuer des lavages approfondis. Injecter dans une souris témoin afin d'obtenir en moyenne 1 % dans la circulation périphérique, puis procéder aux expériences in vivo.Bonjour, je suis Mija. Pour imager la rate in vivo, nous devons réaliser une petite synergine de l’animal afin d’exposer la rate, bien entendu, avec cette technique. Je l’ai apprise de Stephanie GR dans le laboratoire de Worker Heisler, à qui je tiens à exprimer ma gratitude, et maintenant je vais vous montrer comment procéder.Imagerie des mycoses infectées réalisée au troisième jour post-infection, lorsque le parat est de 1 % chez les deux souches. Maintenir la souris anesthésiée et à température régulée tout au long de la procédure. Protéger les yeux contre la déshydratation et vérifier que la souris est complètement anesthésiée en pinçant la plante du pied avant de procéder, afin de faciliter l'administration intraveineuse des substances.Au cours de l'expérience, canuler la veine caudale de la souris pour mettre en place la canule. Insérer une petite aiguille à une extrémité d'un tube et son applicateur à l'autre extrémité. Remplir la canule avec du sérum physiologique en éliminant les bulles, et vérifier que la solution s'écoule correctement à travers la canule.La veine latérale de la queue sera canulée proprement. Améliorez sa visibilité en effectuant une légère constriction à la base de la queue. Introduisez la pointe de la canule dans la veine.L'apparition de sang indiquera que l'aiguille est bien positionnée. Dans le cas contraire, répétez la canulation en amont de la veine, puis fixez la canule à la queue à l'aide de colle et de ruban adhésif. Exposez la partie inférieure de la rate par une petite incision dans la peau et la musculature du côté dorsal gauche de l'animal.Placez une rate là où l'on observe le moins de mouvement respiratoire et appliquez du PBS sur la surface exposée afin de la maintenir propre des poils de souris et hydratée. Scellez la rate avec un coverslip pour permettre la visualisation. Bonjour, je m'appelle Lorena.Le protocole présenté nous permettra de visualiser le déplacement des parasites PULI à travers la rate. Ceci a été rendu possible grâce à des parasites transgéniques exprimant la GFP. Don aimable de James Burnes de l'Université Drexel.L'imagerie du mouvement de parasites fluorescents nous permettra de déterminer s'il existe des différences de comportement entre les souches létales et non létales. Les expériences de microscopie Vidal ont été réalisées sur un microscope multiphoton Leica, équipé d'un système d'incubation avec contrôle de température et d'un objectif à immersion dans le glycérol de 63 x. Placer l'animal sur la platine du microscope avec une couverture en verre, la rate orientée vers le bas, face à l'objectif. Initialement.La visualisation de la rate à faible grossissement fournira une vue d'ensemble de la structure microcirculatoire de l'organe. Mettez la rate au point en utilisant la fluorescence naturelle des tissus ; les parasites GFP sont observés traversant les différentes zones de la rate. Bonjour, je m'appelle Maria Albo des Centres scientifiques et technologiques de l'Université de Barcelone, et nous allons réaliser une imagerie intravitale de la rate.Afin d'étudier l'écoulement sanguin et la mobilité des globules rouges infectés, nous utiliserons un microscope confocal équipé d'un balayage résonant permettant une imagerie à grande vitesse, très utile pour éviter les mouvements de l'organe. Il s'agit d'un microscope spectral qui permet de sélectionner la plage de vision. Pour réaliser des acquisitions très rapides, nous effectuerons une acquisition simultanée des deux fluorochromes, des marquages et de la réflexion.Sélectionnez différentes zones à imager à l’aide des colorants RBC, de réflexion, de contraste et de Vidal afin de mettre en évidence le microvasculaire splénique. Nous allons maintenant expliquer comment mesurer la mobilité des parasites dans le flux sanguin des vaisseaux en utilisant la microscopie de Vidal et le logiciel ImageJ pour suivre le déplacement des parasites dans le réseau tridimensionnel de la pulpe rouge. Acquérez des images à travers cinq profondeurs Z en utilisant un mode de balayage à haute vitesse.Convertir les séries d'images en films colorés codés en Z afin de faciliter le suivi de cellules fluorescentes individuelles. Des informations détaillées sont fournies dans le texte pour suivre différents éléments au fil du temps selon la profondeur sur chaque vidéo ; à l'aide des coordonnées X, Y, Z et T, des paramètres de mobilité tels que la directionnalité, la vitesse moyenne et le temps de résidence peuvent être calculés et représentés sous forme de cartes de distribution, permettant une analyse comparative entre les populations de souches. Le flux vasculaire dans la rate peut être visualisé par injection systémique de plusieurs molécules fluorescentes décrites dans le tableau complémentaire, comme la dextrine.Et en utilisant le contraste de réflexion des érythrocytes endogènes, analyser l'écoulement sanguin au centre du vaisseau en orientant horizontalement les vaisseaux dans le sens du balayage laser et en utilisant la fonction améliorée de moyenne par ligne. Sur ces images, les traînées résultant des cellules en mouvement seront utilisées pour calculer le débit sanguin ; acquérir des images de vaisseaux de différents diamètres et sur l'ensemble du cycle cardiaque afin de compenser les fluctuations. La rate a longtemps été considérée comme une boîte noire dans la recherche sur le paludisme, et nous avons ici mis au point une approche quantitative de microscopie intravitale pour mieux comprendre la dynamique de l'infection parasitaire et de l'écoulement sanguin dans cet organe, ce qui nous permet d'aborder des questions biologiques importantes, telles que l'adhérence in vivo des globules rouges infectés à la rate.Merci et.

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