Microscopie intravitale de la rate: Analyse quantitative de la mobilité des parasites et la circulation sanguine

Dans cette procédure, nous montrons une approche de microscopie intravitale quantitative pour évaluer la dynamique du passage du parasite à travers la rate. Dans un modèle de paludisme chez les rongeurs, des souris infectées par des parasites transgéniques GFP sont préparées pour une microscopie intravitale de la canulation veineuse de la rate qui permettra l’injection de colorants intravitaux. Au cours de l’expérience, les cellules fluorescentes se déplacent dans différentes zones de la rate.

Nous fournissons la mythologie pour décrire la mobilité du parasite dans le compartiment lent tridimensionnel de la pulpe rouge et calculons le débit sanguin des vaisseaux. Ces paramètres ont été utilisés pour comparer la dynamique de la rate de deux souches ULE. Bonjour à tous.

Je m’appelle Nando El Portillo et l’une des principales questions de recherche dans mon laboratoire est d’essayer de comprendre le rôle de la rate dans le paludisme. La splénomégalie S est l’un des repères de cette maladie, mais en raison de problèmes techniques et éthiques, il est très difficile d’essayer d’étudier cet organe. Pour ce faire, nous avons mis en place des technologies qui nous permettent de voir le passage dynamique de ce parasite et de quantifier ce phénomène.

C’est ce que Lorena et MI vont expliquer dans ces protocoles. Cette recherche est en partie menée en collaboration avec les groupes du Dr Ler de l’Université de Hambourg en Allemagne et du Dr Maria Kbo ici à la clinique de l’hôpital et a reçu le financement général de l’infection par le donneur M infecté par des parasites GFP létaux ou non létaux à 10 % de parasites. Pour contrôler le parasite, prélevez une petite goutte de sang dans la veine de la queue de souris et étendez-la au microscope.

Glisser une coloration métrique chole avec des GIMs. Une solution permettra de visualiser les globules rouges infectés une fois séchés, de fixer le frottis sanguin avec du méthanol pendant deux minutes, d’appliquer une solution GIM et d’incuber pendant 20 minutes. Lavez la lame avec l’eau du robinet actuelle et énumérez à sec le pourcentage de PBC sur le total des globules rouges à l’aide d’un microscope optique avec cent fois d’huile. Objectif.

Infectez les souris avec des parasites létaux ou non létaux obtenus à partir du sang de queue de souris donneuses dilué dans du PBS. Ajustez la dose pour injecter un demi-million de parasites par souris afin d’atteindre un parasite périphérique de 1 % au troisième jour après l’infection et injectez Intrapéritonéal. Alternativement, les GR étiquetés FITC peuvent être utilisés pour le contrôle.

Les animaux prélèvent un millilitre de sang artériel sur une souris et lavent la pastille par centrifugation dans du PBS contenant de l’EDTA, puis l’incuberont pendant deux heures dans l’obscurité avec une légère agitation. Après cette période, retirez le surnageant par centrifugation et lavez-le abondamment. Injecter dans une souris témoin en moyenne 1 % en circulation périphérique et procéder à des expériences in vivo.

Bonjour, je m’appelle mija. Pour imager la rate in vivo, il faut réaliser une petite synergie de l’animal pour exposer la rate sur une technique évidente. Je l’ai appris de Stephanie GR dans le laboratoire de l’ouvrier Heisler, à qui je tiens à remercier et maintenant je vais vous montrer comment procéder.

Imagerie de la myose infectée Réalisée au troisième jour post-infection lorsque le parat est de 1 % dans les deux souches. Gardez la souris anesthésiée et à une température régulée tout au long de la procédure. Protégez les yeux de l’hydratation et vérifiez que la souris est complètement anesthésiée par le ping du coussinet plantaire avant de procéder afin de faciliter l’administration intraveineuse de substances.

Au cours de l’expérience, canulez la veine de la queue de souris pour construire la canule. Insérez une petite aiguille à l’une des extrémités d’un tube et son applicateur à l’autre. Chargez la canule avec une solution saline physiologique éliminant les bulles et vérifiez que la solution s’écoule correctement à travers la canule.

La veine latérale de la queue sera canulée propre. Améliorez sa visibilité en effectuant une constriction douce à la base de la queue. Introduisez l’extrémité de la canule à l’intérieur de la veine.

L’apparition de sang indiquera que l’aiguille est bien positionnée. Si ce n’est pas le cas, répétez la canulation en amont de la veine, puis fixez la canule à la queue à l’aide de colle et de ruban adhésif. Exposez la partie inférieure de la rate par une petite incision dans la peau et la musculature du côté dorsal gauche de l’animal.

Placez une rate où moins de mouvement de respiration est observé et appliquez PBS sur la surface exposée pour la garder propre des poils de souris et hydratée. Scellez la rate avec une couverture pour permettre la visualisation. Bonjour, je m’appelle Lorena.

Le protocole montré nous permettra de visualiser le mouvement des parasites PULI à travers la rate. Cela a été possible grâce aux parasites transgéniques GFP. Veuillez faire un don par James Burnes de l’Université Drexel.

L’imagerie du mouvement des parasites fluorescents nous permettra de savoir s’il existe une différence de comportement entre les souches létales et non létales. Des expériences de microscopie vidal ont été réalisées dans un microscope multiphotonique Leica, équipé d’un système d’incubation avec contrôle de la température et d’un objectif glycérol 63 x. Placez l’animal sur la platine du microscope avec une rate, le sommeil de couverture, face à l’objectif. Initialement.

La visualisation de la rate à des grossissements plus faibles fournira une vue générale de la structure microcirculatoire de l’organe. Focaliser la rate à l’aide de tissus autofluorescents Des parasites GFP sont observés traversant les différentes zones de la rate. Bonjour, je m’appelle Maria Albo des Centres Scientifiques et Technologiques de l’Université de Barcelone, et nous ferons de l’imagerie intravitale de la rate.

Afin d’étudier le flux sanguin et la mobilité des globules rouges infectés, nous utiliserons un microscope confocal équipé d’un balayage résonant qui permet une imagerie à grande vitesse très utile pour éviter le mouvement de l’organe. Il s’agit d’un microscope spectral qui permet de sélectionner la plage de vision. Afin d’imager très rapidement, nous allons faire l’acquisition simultanée des deux fluorescéine, le marquage et la réflexion.

Sélectionnez différentes zones à imager à l’aide de globules rouges, de réflexion, de contraste et de colorants Vidal pour mettre en évidence la microvascularisation de la rate. Nous allons maintenant expliquer comment mesurer la mobilité du parasite dans le flux sanguin des vaisseaux à l’aide de la microscopie Vidal et du logiciel image J pour suivre le mouvement du parasite dans le maillage tridimensionnel de la pulpe rouge. Acquérez des images à travers cinq profondeurs Z à l’aide d’un mode de balayage à grande vitesse.

Convertissez les piles d’images en films couleur codés Z pour faciliter le suivi d’une seule cellule fluorescente. Des informations détaillées sont fournies dans le texte, suivre différentes particules au fil du temps sur la profondeur sur chaque vidéo à l’aide des coordonnées X, Y, Z et T, les paramètres de mobilité tels que la directionnalité, la vitesse moyenne et le temps de séjour peuvent être calculés et représentés sous forme de cartes de distribution pour permettre une analyse comparative entre les populations de déformation. Le flux vasculaire dans la rate peut être imagé par injection systémique de plusieurs molécules fluorescentes décrites dans le tableau de soutien comme la dextrine.

Et à l’aide d’un contraste de réflexion érythrocytaire endogène, balayez le flux sanguin de la ligne centrale en plaçant les vaisseaux horizontalement dans la direction du balayage laser et en utilisant la moyenne de ligne améliorée. Dans ces images, les traînées résultant du mouvement des cellules seront utilisées pour calculer le débit sanguin, prendre des images de vaisseaux de différents diamètres et sur le cycle cardiaque pour compenser les fluctuations. La rate a longtemps été considérée comme une boîte noire dans la recherche sur le paludisme et nous avons développé une approche de microscopie intravitale quantitative pour mieux comprendre la dynamique de l’infection parasitaire et du flux sanguin dans cet organe, ce qui nous a permis d’aborder d’importantes questions biologiques telles que l’adhésion in vivo des globules rouges infectés à la rate.

Merci et.