Construction d'un hydrogel de collagène pour la prestation de souches microsphères Cell-chargé Chitosan

Ce protocole propose une stratégie in vitro pour délivrer des cellules souches à partir de microsphères de chitosane dans un échafaudage de gel de collagène, une récolte et une culture. Les cellules souches adipocytaires primaires émulsionnent ensuite et récupèrent une préparation de microsphères de chitosane. Ensuite, ensemencez les cellules souches sur les microsphères de chitosane et cultivez-les dans une plaque de culture à membrane de huit microns pour produire un CSM chargé de CSM, mélangez enfin le système de distribution de microsphères avec un échafaudage de gel de collagène tridimensionnel.

En fin de compte, ce système CSM offre un potentiel d’utilisation en médecine régénérative et en administration de médicaments. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’injection cellulaire ou la microencapsulation est la capacité des cellules à se fixer à un matériau porteur et à persister après l’application initiale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les microsphères esan ont une charge statique inhérente.

Et le chargement de cellules sur un lit de microsphères sera un défi sans les déranger. Excise et lavage, le tissu adipeux périnéal et épidermique d’une enveloppe, hache le tissu, puis transfère un à deux grammes dans 25 millilitres de HBSS contenant 1 % de FBS. Après la centrifugation, recueillir la couche de tissu adipeux flottant librement dans un erlenmeyer de 125 millilitres.

Ajoutez 25 millilitres de collagénase de type deux et incubez la réaction sur un agitateur orbital. Maintenant, retirez soigneusement la fraction liquide sous la couche d’huile et adipeuse et filtrez séquentiellement à travers des filtres à mailles en nylon de 170 microns. Récoltez les cellules par centrifugation après deux lavages avec 25 millilitres.

HBSS Resus, suspendre la pastille dans 30 millilitres de milieu de croissance meen pro supplémenté. Divisez les cellules souches dérivées du tissu adipeux purifié dans deux flacons de culture T 75 et amplifiez la préparation de A SC dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Ce protocole CSM est un procédé d’émulsification de l’eau dans l’huile qui utilise une technique de coer ionique.

Émulsionnez six millilitres d’une solution aqueuse de chitosane dans 100 millilitres d’un mélange de phase huileuse en utilisant simultanément une agitation aérienne et magnétique dans des directions opposées pendant une heure à l’émulsion stable d’eau et d’huile, ajoutez 1,5 millilitres d’hydroxyde de potassium à 1 % dans n octal toutes les 15 minutes pendant quatre heures. Une fois la réaction de réticulation ionique terminée, décantez lentement la phase huileuse et ajoutez immédiatement les sphères à 100 millilitres d’acétone. Lavez les sphères avec de l’acétone jusqu’à ce que la phase huileuse soit complètement éliminée.

Séchez ensuite les sphères récupérées sous vide. Déterminez la surface moyenne des particules CSM par milligramme et l’unité de volume cubique à l’aide de l’analyseur de taille de particules. Procéder trois fois au lavage du CSM avec de l’eau stérile pour éliminer les sels résiduels.

Stérilisez maintenant la préparation CSM avec de l’alcool absolu pour l’utilisation dans des expériences cellulaires dans un tube en verre de 50 millilitres, mélangez cinq milligrammes de microsphères avec un millilitre de solution TNBS à 0,5 % incubez pendant quatre heures à 40 degrés Celsius. Ajoutez ensuite trois millilitres de six acides chlorhydriques normaux et incubez à 60 degrés Celsius pendant deux heures. Après avoir refroidi les échantillons à température ambiante, ajoutez cinq millilitres d’eau déminéralisée et 10 millilitres d’éther Ethel.

Pour extraire le TNBS libre, prélevez une aliquote de cinq millilitres de la phase aqueuse et réchauffez-la à 40 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 15 minutes pour évaporer tout éther résiduel après refroidissement à température ambiante. Diluer avec 15 millilitres d’eau à l’aide d’un spectrophotomètre. Mesurer l’absorbance des microsphères de chitosane préparées à 345 nanomètres en utilisant TNBS comme blanc.

Mesurez également le chitosane utilisé pour la préparation du CSM. Maintenant, calculez le nombre de groupes aminés libres du CSM par rapport au nombre total de groupes aminés dans le chitosane. Équilibrez cinq milligrammes de CSM stérilisé dans du HBSS stérile pendant la nuit.

Transférez le CSM dans un insert à membrane de huit microns pour des plaques de culture à 24 puits. Une fois que le CSM s’est installé, aspirez soigneusement le HBSS. Ajoutez maintenant 300 microlitres de milieu de croissance à l’intérieur de l’insert et 700 microlitres de milieu de croissance à l’extérieur de l’insert. Resus.

Suspendez les cellules souches dérivées du tissu adipeux dans 200 microlitres de croissance, de milieu et de graine sur le CSM à l’intérieur de la plaque de culture. Incuber pendant 24 heures dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Transférez le CSM chargé de SC dans un microtube de centrifugation stérile sans perturber les cellules qui ont migré dans la membrane de l’insert.

Retirez maintenant le milieu résiduel et ajoutez 250 microlitres de milieu de croissance frais dans chaque tube. Ajoutez 25 microlitres de cinq milligrammes par millilitre de solution MTT et incubez pendant quatre heures. Retirer le média et ajouter 250 microlitres de vortex d’oxyde de diméthylsulf pour solubiliser la forme d’une centrifugeuse complexe, le CSM à 2, 700 G pendant cinq minutes.

Mesurer l’absorbance surnageante à 570 nanomètres en utilisant 630 nanomètres comme référence. Procédez à la détermination du nombre de cellules associé au CSM par rapport à la valeur d’absorbance obtenue à partir de nombres connus de A SC viables. Mélangez cinq milligrammes d’un CSM chargé SC avec 7,5 milligrammes par millilitre. Collagène de type un extrait de rat.

Tendon de la queue, ajustez le pH à 6,8 à l’aide de deux hydroxydes de sodium normaux et versez dans une plaque de culture. Insérez dans la fibrillation, transférez maintenant dans une plaque à 12 puits et incubez pendant 30 minutes. Continuez à rafraîchir le milieu pour les gels de collagène A-S-C-C-S-M tous les deux jours de la période d’incubation.

Surveillez également, libérez et migrez les cellules du CSM dans le gel à l’aide de techniques de microscopie standard. L’exemple suivant décrit la stratégie in vitro consistant à délivrer des cellules souches dérivées de l’adipeux à partir de microsphères de chitosane dans un échafaudage de gel de collagène. Les images MEB et MET indiquent une préparation de MCS poreux de taille uniforme.

L’incubation des microsphères avec des cellules souches primaires dérivées du tissu adipeux indique 4 000 cellules par milligramme de calcium CSM am. La coloration d’un SC montre une propagation sur le CSM avec une extension des filopodes dans les crevasses poreuses de la microsphère. Lorsque les CSM chargés de cellules ont été mélangés avec le gel de collagène, les cellules migrent dans le gel et peuvent être suivies au fil du temps.

Les implications de cette technique s’étendent immédiatement au traitement de la perte massive et chronique de tissus. Cependant, ce régime de traitement a beaucoup plus de potentiel en raison de sa polyvalence à s’intégrer à une variété de cellules et/ou de biomatériaux utilisés pour traiter différents niveaux de pertes de tissus mous et cardiaques. Je doute que cette méthode puisse donner un aperçu de l’administration de la cellule hôte.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les injectables, l’administration de médicaments thérapeutiques, le développement de systèmes hybrides pour administrer à la fois des cellules et des médicaments thérapeutiques.