Écrans à haut débit et faible avec Les nématodes à galles Meloidogyne spp.

L'objectif général de cette procédure est de dépister des plantes infestées par des nématodes à galles. Premièrement, faire pousser des semis sains dans un sol sablonneux ou dans des pochettes de culture. Ensuite, produire un inoculum composé de jeunes juvéniles fortement infectés au deuxième stade, du nématode à galles.

Ensuite, inoculer et infecter correctement les semis. Enfin, évaluer le développement des masses d'œufs de nématodes sur le système racinaire de l'hôte. Nous allons démontrer des tests à haut et faible débit de plantes avec des racines, et non des nématodes.

Et les principaux avantages du système à haut débit résident dans la faible surface nécessaire à la croissance des plantes et la facilité d'évaluation de l'infection. Ces approches permettent ainsi d'obtenir une infection reproductible et uniforme, ainsi qu'une infection des racines des plantes par les nématodes, et par conséquent une meilleure évaluation du statut d'hôte de la plante. En général, les personnes novices dans l'évaluation des plantes avec des nématodes racinaires risquent de rencontrer des difficultés en raison de l'utilisation d'un stade de développement inapproprié pour infecter les racines avec les nématodes.

Ainsi qu’en utilisant des juvéniles de stade infectieux âgés de plusieurs jours, qui présentent généralement une faible infectivité. La procédure sera démontrée par Hug Up Atian, étudiant diplômé. Dans mon laboratoire, je vais démontrer la procédure de criblage dans les poches de croissance pour les essais en pot. Planter des graines de tomate dans un seul pot rempli d’un sol riche en matière organique, comme le mélange Sunshine, en maintenant une serre à une température de 22 à 28 degrés Celsius après la germination.

Arrosez une fois par semaine avec du Miracle-Gro environ deux semaines après la germination. Au stade des deux feuilles vraies, transplantez individuellement les jeunes plants dans des pots remplis de terre stérile sablonneuse, composée à 90 % de sable et à 10 % de matière organique. Ajoutez un engrais à libération lente Osmocote et maintenez les plants en serre à une température de 22 à 28 degrés Celsius pendant deux semaines. Poursuivez la fertilisation une fois par semaine avec du Miracle-Gro.

Pour les criblages à haut débit, enfoncez directement les graines de plantes dans des plaques contenant un sol sableux. Recouvrez d'un film plastique jusqu'à la germination et maintenez comme décrit précédemment. Après la germination, ajoutez de l'engrais à libération lente Osmocote et fertilisez une fois par semaine avec Miracle-Gro. Faites germer les graines dans une boîte de Pétri tapissée de plusieurs couches de papier Kimwipe, maintenue dans un incubateur à 25 à 28 degrés Celsius, puis transférez les jeunes plants dans des pochettes individuelles.

En alternative, placez les graines dans la rainure du papier pour qu'elles germent directement dans des pochettes individuelles. Placez les pochettes dans un classeur suspendu en plastique, un par classeur, et disposez les classeurs sur un présentoir, en position verticale.

Placer la grille dans une enceinte à environnement contrôlé maintenue à une température de 25 à 28 degrés Celsius et à 16 heures de lumière. Arroser les pochettes une à deux fois par jour, en cycle d'obscurité de 8 heures, avec de l'eau osmosée, environ 10 à 14 jours après le semis. Lorsqu'un système racinaire suffisant, doté de pointes de racines tertiaires, s'est développé, les semis sont prêts pour l'inoculation. Avant de commencer l'extraction des œufs, nettoyer soigneusement la zone de travail et tous les outils avec de l'eau chaude afin d'éviter toute contamination.

Placez un seau dans un évier pour recueillir la solution qui s'écoule, puis positionnez un support en treillis métallique par-dessus. Empilez trois tamis de haut en bas par ordre décroissant de taille d'ouverture, de sorte que les œufs s'accumulent dans le tamis de 25 microns. Coupez les sommités des plantes infectées et jetez-les soigneusement.

Retirez la plante du pot et lavez les racines en les trempant dans un seau en plastique rempli d'eau. Rincez davantage les racines sous l'eau courante jusqu'à ce que les particules de sol soient éliminées. Ensuite, extrayez les œufs de nématodes à galles des racines de tomate infectées.

Commencez par couper les racines en petits morceaux à l’aide de ciseaux, en éliminant la racine pivot. Placez les racines hachées d'une seule plante dans un grand bocal en plastique avec couvercle et ajoutez suffisamment de solution d'eau de javel à 10 % pour recouvrir les racines. Fermez le couvercle et agitez le bocal pendant deux minutes.

Ouvrez le bocal et versez les racines sur le tamis supérieur, puis rincez-les à l’aide d’un tuyau équipé d’un embout pulvérisateur. Rincez soigneusement jusqu’à disparition complète de l’odeur d’eau de Javel. Utilisez un maillet pour taper doucement sur les côtés des tamis afin d’éviter que ceux-ci ne s’obstruent.

Faites une pause, retirez le tamis supérieur et rincez les débris. Puis le deuxième tamis. Retirez le deuxième tamis et récupérez les débris fins, qui incluent les œufs, à l’aide d’un filet d’eau douce provenant d’une bouteille d’eau, depuis le dernier tamis.

Déplacez les débris sur un côté du tamis. Rassemblez les débris et les œufs dans un bécher propre avec un minimum d'eau. Faites passer l'eau recueillie dans le seau à travers le tamis de 25 microns pour récupérer les œufs éventuels qui auraient pu s'échapper.

Rincez soigneusement à l'eau et recueillez dans le même bécher. Tapissez un panier métallique propre de plusieurs couches de papier Kim. Essuyez avec du papier et placez sur une boîte de Pétri en verre, en laissant une distance d'un centimètre entre le fond du panier et la boîte.

Verser les œufs de nématodes extraits sur le papier, dans le panier en fil de fer. Ajouter suffisamment de liquide pour que le fond du panier en fil de fer touche la surface de l’eau sans être immergé.

Couvrir le dessus avec un couvercle en plastique chaque jour. Vérifier l'évaporation de l'eau et en ajouter dans la boîte de Pétri afin que le fond du panier touche l'eau. Afin d'empêcher les œufs de se dessécher tous les deux jours pendant six à huit jours, recueillir l'eau contenant les juvéniles du deuxième stade ou J2 depuis la boîte de Pétri dans un bécher.

Si elle n'est pas utilisée immédiatement, aérez sans délai l'inoculum recueilli à température ambiante à l'aide d'une source d'air de laboratoire ou d'air produit par une pompe d'aquarium. Commencez l'étape suivante en agitant l'inoculum sur un agitateur magnétique à faible vitesse. Utilisez trois aliquots des nématodes recueillis.

Pour compter le nombre de J deux dans la comptabilité. Faites glisser ou placez dans la boîte, calculez la moyenne et déterminez le volume souhaité pour l'inoculation. Ce sont des J deux tels qu'observés au microscope.

Typiquement, 3000 J deux sont utilisés par plante en pots et 500 J deux pour les plantes cultivées en godets. Avant d'inoculer les plantes, s'assurer que le sol est humide mais pas trop mouillé. Pour l'inoculation en pot, faire trois trous d'environ la moitié de la profondeur du pot dans le sable autour de chaque système racinaire de tomate.

À l’aide d’un stylet, inoculer chaque plante en délivrant les J twos dans les trois trous à l’aide d’une pipette. Par la suite, recouvrir les trous pour les criblages à haut débit dans des plateaux. Utiliser une aiguille à embout scellé modifiée, munie de trous latéraux collés à une pipette de cinq millilitres.

Inclinez une pipette pour délivrer les J deux dans le sol. Maintenez les plantes dans une serre à une température de 24 à 27 degrés Celsius pendant six à huit semaines. Continuez à fertiliser deux fois par mois avec du miracle grow.

Pour l'évaluation de l'infection. Couper les parties aériennes et retirer soigneusement les plantes des pots, puis laver les racines. Ensuite, colorer en bleu les masses d'œufs en immergeant les racines dans une solution d'un milligramme par litre.

Effectuer un aéroglossage pendant 15 minutes. Rincer les racines à l’eau et évaluer en comptant les masses d’œufs colorées sur chaque système racinaire. Une loupe lumineuse peut être utilisée pour faciliter la visualisation des masses d’œufs, compter le nématode, l’inoculum, et agiter sur une plaque agitatrice magnétique comme décrit précédemment.

Retirer les pochettes des dossiers suspendus et les placer sur une surface horizontale. Inoculer chaque pochette avec 1 500 J2 dans cinq millilitres. Soulever le couvercle en plastique de la pochette et répartir les nématodes uniformément sur la surface des racines.

Garder les sachets en position horizontale pendant 24 heures après l'inoculation, recouverts de papier noir pour exclure la lumière. Par la suite, replacer les sachets dans les dossiers suspendus dans la chambre de croissance avec de l'eau. Arroser les plantes une ou deux fois par jour pendant environ trois jours avec une solution de Hoagland à demi-force jusqu'à l'observation d'une réponse à l'engrais.

Habituellement, une coloration verte plus intense du feuillage et une croissance des pousses plus vigoureuse. Après trois jours, maintenir les poches humides avec de l'eau. Environ 30 jours après l'inoculation, introduire dans chaque poche environ 10 à 20 millilitres de 75 milligrammes par litre.

Application aérographique. Laisser les poches inondées de colorant en position horizontale toute la nuit. Le lendemain, vidanger les poches et évaluer les systèmes racinaires en comptant les masses d'œufs sous un bureau éclairé.

Les racines, montrées ici en grossissement, proviennent d'une plante de tomate fortement infectée, les masses d'œufs répandues étant colorées en bleu. L'utilisation de plateaux permet d'analyser des centaines de plantes dans un espace de culture réduit. Les pochettes de croissance permettent également une évaluation rapide et efficace, non destructive, des racines, pour détecter les infections par des nématodes, sans avoir à laver les racines.

Cette méthode permet également le criblage à haut débit de milliers de plantes dans un espace de croissance réduit. Ici, le système racinaire d'une plante de pois fourrage cultivée dans une pochette montre des masses d'œufs colorées en bleu après inoculation. Le moment de l'infection est très critique pour les tests sur les plantes avec des nématodes.

Ainsi, retarder l'infection ne serait-ce que de quelques jours peut entraîner des niveaux d'infection très élevés. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant bien comprendre comment infecter et évaluer des plantes avec des nématodes à galles racinaires. N'oubliez pas que les racines infectées par des nématodes doivent être manipulées correctement.

Stériliser les racines en autoclave avant de les éliminer permettra de limiter la propagation du nématode. En outre, manipulez avec précaution la glyphosate aérienne en cas de fortes doses. Elle est cancérogène.

Par conséquent, vous devez utiliser des gants lors de la manipulation des racines infectées par ce produit chimique ainsi que lors de la préparation de ce produit chimique.