Name: Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode dbactérienne détection de lARN petits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez la méthode LNA flow FISH pour détecter l'ARN bactérien au niveau des cellules individuelles. Cette technique haut débit utilise des sondes LNA et la cytométrie en flux pour quantifier l'expression de l'ARN.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Office of Naval Research des États-Unis via des fonds de recherche navale coeur de laboratoire.

1. Sondes LNA &amp; design expérimental <ol><li> Conception des sondes LNA qui sont le complément inverse de votre petit ARN transcrits / ARNm ou les ont conçus sur mesure au <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Si vous utilisez l&#39;option design personnalisé, vous connaîtrez la séquence, mais pas le modèle de dopage LNA. L&#39;ajout de chaque résidu de LNA dans un ADN ou d&#39;ARN oligonucléotides résultats par une augmentation de T m comprise entre deux et 10 ° C pour l&#39;hybridation d&#39;un duplex ARN LNA-14. Idéalement, les sondes LNA conçu devrait être entre 20-25 nucléotides de long (plus de sondes sont plus difficiles à synthétiser) et ont un Tm comprise entre 85-90 ° C pour l&#39;ARN hybridation. </li><li> Après la conception de la séquence, l&#39;utilisation de BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ou comparer la séquence de sonde à votre base de données locale pour assurer la sonde est spécifique à votre petit ARN / ARNm d&#39;intérêt. </li><li>Lors de la commande de la sonde LNA, ajouter une modification à la biotine TEG à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;oligonucléotide LNA. La biotinylation est nécessaire pour la post-hybridation coloration avec un conjugué streptavidine-colorant. Il est possible d&#39;ajouter cette modification de l&#39;extrémité 3 &#39;si nécessaire, mais l&#39;addition à l&#39;extrémité 5&#39; est moins cher et devrait se traduire par des rendements plus élevés. </li><li> Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode: (i) un contrôle &quot;non LNA» dans lequel une sonde LNA n&#39;est pas ajouté au cours de l&#39;étape d&#39;hybridation, (ii) un «sans colorant» de contrôle dans lequel la sonde LNA est hybride à la cibles petit ARN, mais l&#39;événement d&#39;hybridation n&#39;est pas détectée en raison de l&#39;absence du colorant fluorescent, et de contrôle (iii) &#39;ARNm non exprimé petit ARN /&#39; une qui utilise une sonde LNA qui cible un petit ARN inexistantes ou non exprimées dans l&#39;ordre de surveiller une hybridation non spécifique. </li><li> La sonde spécifique LNA ici est complémentaire à l&#39;CsrB SRNA et a la séquence 5&#39;-biotine-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(monomères LNA dansmajuscules). </li><li> Après réception du lyophilisé LNA, resuspendre avec une eau sans nucléase à 50 pg / mL et de stocker en 10-20 aliquotes à -20 ° C. </li></ol> Solutions <ul><li> 8% (PFA) paraformaldehye, 10% d&#39;acide acétique dans du PBS: Mélanger 1 ml 32% PFA, 400 ul d&#39;acide acétique, 400 ul PBS 10X, pH = 7,4, et 2,2 ml d&#39;eau sans nucléase. Pour aliquotes congelés, en aliquots à usage unique à -20 ° C sans acide acétique. </li><li> 60% solution de sulfate de dextrane: ajouter 6,0 g de sulfate de dextrane à un tube conique de 50 ml et ajouter l&#39;eau pour un volume final de 10 ml. Chauffer ce mélange à 65 ° C dans un bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que le sulfate de dextran est dissoute (peut prendre 1-2 heures). D&#39;eau supplémentaire peut être nécessaire d&#39;ajouter tout au long du procédé de solubilisation de maintenir un volume de 10 mL. Aliquoter la solution 60% de sulfate de dextran et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ul> 2. Fixation <ol><li> Récolte 1x10 8 cellules de bioluminescents <em&gt; Vibrio campbellii ou votre bactéries d&#39;intérêt et de les transférer dans un tube de 1,5 ml. Cette quantité de cellules fournit suffisamment de matériel de départ pour quatre flux POISSONS échantillons (un échantillon spécifique de sonde LNA et trois contrôles négatifs). Additionnel de 1,5 ml aliquotes microcentrifugeuse tube doit être collectées que si d&#39;autres petit ARN / ARNm espèces ont besoin d&#39;être testé. </li><li> Pellet, les cellules bactériennes par centrifugation à 2300 xg pendant cinq minutes. Jeter le surnageant par pipetage et remettre en suspension les cellules dans 400 ul de PBS 1X. </li><li> A ce mélange, ajouter 400 ul d&#39;une paraformaldehye 8% (PFA) et 10% d&#39;acide acétique dans une solution saline tamponnée de phosphate 1X (1X PBS), bien mélanger, et laisser incuber pendant 10 minutes à 25 ° C le mélange une fois après cinq minutes. Toutes les incubations, sauf indication contraire, sont effectuées dans un porte-tube chauffé. La solution PFA doivent être préparés frais ou d&#39;occasion à partir aliquotes congelées après l&#39;addition d&#39;acide acétique. Paraformaldéhyde est un fixateur de réticulation que hPEL afin de préserver la morphologie cellulaire et de conserver l&#39;ARN intracellulaire. </li><li> Pellet les cellules de ce mélange par centrifugation à 4500 xg pendant deux minutes et retirer le surnageant par pipetage. Toutes les étapes à venir qui nécessitent une centrifugation devrait utiliser les mêmes paramètres (7K, 2 min). Il est important de noter que les surnageants après centrifugation doit être retiré par pipetage et pas de décantation. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X et resuspendre le culot cellulaire final dans 400 ul de PBS 1X. Les cellules sont désormais fixes et peuvent être conservés à 4 ° C dans 400 ul de PBS 1X pour un maximum de sept jours. </li></ol> 3. Traitement de pyrocarbonate de diéthyle <ol><li> Préparer 400 ul d&#39;une solution à 0,1% du diéthyl pyrocarbonate (DEPC) dans du PBS 1X (400 pl de cette solution est nécessaire pour chaque échantillon à tester afin d&#39;échelle en conséquence). La solution DEPC doit être préparé à partir d&#39;un stock de DEPC. Le traitement DEPC inactive RNases par carbethoxylation et diminue lasignal de fond. </li><li> Ajouter 400 ul de la solution de 0,1% DEPC à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées et bien mélanger par pipetage. Incuber ce mélange à 25 ° C pendant 12 minutes. Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 4. Perméabilisation <ol><li> Ajouter 1,0 mg de lysozyme à 1 mL de tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) pour un 1,0 mg / ml solution. Cette solution doit être préparé. Ajouter 800 ul de 1 mg / ml solution de lysozyme dans les cellules, bien mélanger par pipetage et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Le lysozyme agit comme un réactif de perméabilisation en hydrolysant le présent peptidoglycane dans les parois des cellules bactériennes. </li><li> Préparer un 3,0 mg / ml solution de protéinase K dans du tampon TE. Cette solution doit être préparé à partir d&#39;un stock de 20 mg / ml de protéinase K qui est stocké à -20 ° C.Protéinase K est une sérine protéase qui digère une variété de protéines et contribue à l&#39;accessibilité des sondes et des réactifs à l&#39;ARN. </li><li> Ajouter 800 uL de la g 3.0 / ml protéinase K solution au culot cellulaire et bien mélanger par pipetage. Incuber à 25 ° C pendant 15 minutes avec vortex à mi-parcours de l&#39;incubation. </li><li> Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver les cellules une fois avec 400 ul de PBS 1X. Après avoir retiré le surnageant du lavage, remettre les cellules dans 400 ul de PBS 1X et ajouter 100 ml de la remise en suspension dans quatre nouveaux microtubes 1,5 ml. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 5. Hybridation <ol><li> Préparer 100 uL de tampon d&#39;hybridation (HB) pour chaque échantillon. Le HB est constituée de formamide à 50% en volume, 10% de sulfate de dextrane en masse (ajouter 16,7 ul de la solution de sulfate de dextran 60% pour chaque uL 100), solution 1X Denhardt, 50 phosphate de sodium pH 7,0,Citrate de sodium 2X (SSC), 20 pg d&#39;ADN de sperme de saumon cisaillé (SSSD) et 20 mg ARNt de levure. </li><li> Chacune des composantes de l&#39;HB a un but différent. Le formamide abaisse la température de fusion du duplex d&#39;acides nucléiques permettant ainsi aux dénaturation de l&#39;ARN et en minimisant les dommages cellulaires. Sulfate de dextran est utilisé comme un volume hors de polymère pour concentrer la sonde et d&#39;augmenter le taux d&#39;hybridation. Solution Denhardts, la levure et les ARNt SSSD servir des agents bloquants pour réduire la liaison non spécifique. </li><li> Dans chacune des cellules remise en suspension contenant 1,5 ml microtubes, ajouter 95 uL HB et uL 5.0 du petit ARN / ARNm spécifiques de LNA [20 pmol de LNA concentration spécifique finale] ou de l&#39;eau (pour le contrôle LNA pas de négatif). Par exemple: <ol class="lalpha"><li> Tube de 1 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN / ARNm sonde spécifique </li><li> Tube de 2 à 95 uL HB 5,0 + uL petit ARN / ARNm sonde spécifique (contrôle négatif &quot;sans colorant&quot;) </li><li> Tube de 3 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN/ ARNm de la sonde («non-exprimé petit ARN / ARNm« témoin négatif) </li><li> Tube de 4 à 95 uL HB + 5,0 uL d&#39;eau (contrôle négatif &quot;non LNA») </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Incuber tous les quatre échantillons à 60 ° C pendant 60 minutes. La température d&#39;hybridation dépend de la sonde LNA m (s) T et devrait être fixé à environ 30 ° C en dessous de la Tm prédit pour le recuit ARN. Tant la température d&#39;hybridation élevée et le formamide dans les HB assure la dénaturation de la structure secondaire de la SRNA ou ARNm d&#39;intérêt. </li></ol> 6. Post-hybridation lave <ol><li> Après l&#39;hybridation, ajoutez 1,0 ml à 0,1 X SSC avec 0,1% de Tween-20 (SSCT) pour le mélange d&#39;hybridation. Cela est nécessaire pour permettre aux cellules d&#39;être retiré de la solution d&#39;hybridation visqueux. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 200 ul de 50% de formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 à l&#39;culots cellulaires, mélanger soigneusement et Incubmangé pendant 30 minutes à 65 ° C dans un bloc de chauffage. </li><li> Ajouter 1 mL 0,1 X SSCT au mélange, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter 500 uL SSCT 0,1 X pour remettre les cellules et incuber pendant 40 minutes à 65 ° C dans un bloc thermique. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li></ol> 7. Blocage et coloration <ol><li> Préparer le tampon de blocage (BB) et la solution de coloration streptavidine-colorant. Préparer une solution 1X BB à partir d&#39;un stock de 5X (disponible dans le commerce, voir réactifs). Pour chaque ensemble de quatre tubes, préparer 1,2 ml 1X BB. </li><li> Ajouter 200 ul 1X BB au culots cellulaires, resuspendre et incuber pendant 30 minutes à 25 ° C. </li><li> Un colorant streptavidine conjuguée est utilisé pour détecter les sondes LNA biotinylé. Alors que le blocage, préparer une solution de 2 pg / ml DyLight 488 streptavidine ou votre désirée colorant streptavidine conjugué 1X BB pendant 30 min (pour trois échantillons, faire 300 uL). </li><li> Après Incubtion avec 1X BB, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 50 uL de la solution de streptavidine-teinture pour les culots cellulaires, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. Pour le reste du protocole, de protéger les tubes de lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium. </li><li> Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 ul de PBS 1X avec 0,1% de Tween-20 (PBST). Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. </li><li> Après les premières conjugué streptavidine-coloration, le signal est amplifié par l&#39;introduction d&#39;un anti-streptavidine biotinylé anticorps au conjugué streptavidine-dye et coloration une seconde fois avec la streptavidine-dye augmentant ainsi le signal de sortie par hybridation de sonde LNA (figure 2) . </li><li> Ajouter 100 ul de 1 pg / mL biotinylé anti-streptavidine anticorps dans du PBS 1X, resuspend les cellules et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver deux fois avec 400 uL PBST 1X. </li><li> Ajouter 50 uL de la 2 mg / ml de streptavidine-dye solution pour les cellules, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. </li><li> Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 uL PBST 1X. </li><li> Resuspendre les cellules dans 200 uL PBST 1X et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse par cytométrie de flux. Pour les plus petites cellules bactériennes régler le débit de ralentir pour diminuer la taille du cœur. En outre, pour les cytomètres de flux avec l&#39;attaquant seuils seuil de dispersion, la coupure doit être aussi basse que possible pour assurer les petites cellules bactériennes sont détectées. </li><li> Pour DyLight 488 de détection, le cytomètre de flux doit être équipé d&#39;un laser à 488 nm et d&#39;émission standardfiltres pour FITC. Au moins 2x10 4 événements devraient être collectées. Pour la compatibilité avec cytomètres équipés de lasers différents, d&#39;autres streptavidine conjuguée à des fluorophores peut être utilisé pour ce protocole. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Un exemple de cellules qui sont fixées et perméabilisées efficace est indiqué dans le dot plot de cytométrie en flux sur la figure 3A. Lorsque les conditions décrites ci-dessus pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène indiquant agrégats de cellules rares. Lorsque supérieur (5 mg / ml) des concentrations de lysozyme sont utilisés, les cellules sont plus susceptibles d&#39;agréger et de présenter des valeurs de dispersion accrue de l&#39;avant, indicatifs de particules plus grosses (figure 3B). Un exemple de données de cytométrie en flux à partir d&#39;un flux de succès LNA-FISH expérience est montré dans la figure 4. L&#39;histogramme montre la détection spécifique d&#39;un petit ARN cible avec trois contrôles négatifs.Le «sans colorant» contrôle négatif produit le moins de fluorescence, suivie par le «non LNA» et «non-exprimé petit ARN &#39;contrôles négatifs. Enfin, l&#39;échantillon avec la sonde petit ARN spécifiques de LNA qui produit le plus de fluorescence. Une fois la méthode et les sondes LNA sont validés de cette manière, des expériences complémentaires peuvent être conçus pour surveiller les changements dans le signal petit ARN au cours du temps, en réponse à des mutations ou des conditions de culture variées, etc <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation du schéma d&#39;ensemble d&#39;un flux de LNA-FISH expérimentation pour la détection de la SRNA bactérienne. <img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figure 2. Coloration et l&#39;amplification des flux de LNA-FISH signal. a) L&#39;hybridation de la sonde biotinylée LNA. b) Coloration avec les fluorescents DyLight 488 conjugué streptavidine. c) La liaison de l&#39;biotinylé anti-sd&#39;anticorps à l&#39;treptavidin DyLight 488 streptavidine. L&#39;anticorps peut se lier streptavidine grâce à son site de liaison antigénique ou peut être lié par la streptavidine à travers ses résidus de biotine. d) L&#39;amplification du signal par une coloration plus loin avec l&#39;fluorescentes DyLight 488 conjugué streptavidine. <img alt="Figure 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figure 3. Parcelles de cytométrie en flux de point montrant l&#39;avant par rapport aux résultats d&#39;une diffusion latérale) 1 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation et b) 5 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation. <img alt="Figure 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse de l&#39;histogramme de l&#39;écoulement LNA POISSONS résultats. Le signal fluorescent généré à partir de chaque échantillon est représenté par les quatre traces: noir - petit ARN spécifiques LNA sonde; rouge - contrôle négatif &quot;non-exprimée petit ARN; bleu - contrôle négatif&quot; non LNA; violet -Contrôle négatif &quot;sans colorant&quot;.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le flux de LNA-FISH méthode présentée ici a été utilisé pour détecter l&#39;expression d&#39;un petit ARN de la Gram-négatif bactérie marine Vibrio campbellii dont l&#39;expression a déjà été confirmée par le profil d&#39;expression basé sur un microréseau et inverser la réaction en chaîne par polymérase après transcription 16. À ce jour, nous avons utilisé cette méthode pour contrôler l&#39;expression d&#39;une variété d&#39;ARN (par exemple trans-encodé Srna, petit ARN qui modulent l&#39;activité des protéines, riboswitches et ARNm). En tant que tel, nous sommes convaincus que la méthode est adaptable et peut être utilisé pour détecter une cible petit ARN ou ARNm et peut être modifié pour être utilisé dans toutes les espèces bactériennes ou type de cellule. Si la modification de ce protocole est nécessaire pour d&#39;autres types cellulaires, la variable la plus importante à considérer la manipulation est l&#39;étape de perméabilisation. Par exemple, lors de la modification des conditions de perméabilisation décrit ici, les changements dans les concentrations de lysozyme et la protéinase K doit être testé. Nous avons constaté que doubler outripler la quantité de lysozyme et la protéinase K ont entraîné des changements majeurs dans les flux de LNA-FISH résultats. Par ailleurs, lors du test des conditions de perméabilisation supplémentaires, les cellules doivent être analysés pour l&#39;agglutination, la perte de cellules, et le meilleur signal obtenu au ratio de fond de fluorescence. L&#39;étendue de l&#39;agglutination de cellules peuvent être testés pour la microscopie et / ou la cytométrie de flux. Par cytométrie en flux, amas cellulaires sont présents que dans une queue avant vs dot plot côté de dispersion et la méthode de perméabilisation correct de minimiser cet effet de résidus. Cette méthode est également prête à la détection de petit ARN multiplex, sans modifications majeures au protocole décrit comme complémentaires des sondes LNA étiquetés avec des haptènes tels que la digoxigénine pourrait être ajouté lors de l&#39;étape d&#39;hybridation puis détecté avec un anticorps anti-digoxigénine et secondaires d&#39;anticorps fluorophore conjugué. Actuellement, la seule limitation que nous avons rencontrés avec cette méthode est son incapacité à générer un signal suffisamment de faiblement exespèces petit ARN pressées et des efforts sont en cours pour déterminer le seuil de détection (en nombre de copies par cellule absolue). Globalement, les flux de LNA-FISH méthode fournit l&#39;occasion de mesurer petit ARN bactérien ou l&#39;expression des ARNm au niveau des cellules simples de façon à haut débit pour fournir des indications sur la présence et l&#39;abondance relative d&#39;une espèce SRNA et la mesure dans laquelle son expression varie dans une population.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Phosphate 10X solution saline tamponnée (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Non traitée DEPC) </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 32% </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> RT 15714 </td><td> Éthanol gratuitement </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diéthyle pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Gardez desséchée </td></tr><tr><td> Le lysozyme </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K (20 mg / ml) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Le formamide </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Déminéralisée, aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Sulfate de dextran PM&gt; 500000 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Solution Aliquoter 60% et le gel </td></tr><tr><td> Solution de Denhardt 50X concentrent </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Tampon citrate de sodium 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; ADN de sperme de saumon (cisaillé) 10 mg / ml </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Levure ARNt (10 mg / mL) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5X dans une solution d&#39;hybridation in situ le blocage </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidine </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-streptavidine </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquoter et congeler </td></tr></tbody></table>

verrouillé flux nucleic acid cytométrie de fluorescence in situ</emhybridation> (lna flux fish): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;arn petits

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

L&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) est une technique puissante qui est utilisée pour détecter et localiser des séquences spécifiques d&#39;acide nucléique dans l&#39;environnement cellulaire. Afin d&#39;augmenter le débit, le poisson peut être combinée avec la cytométrie de flux (flow-FISH) pour permettre la détection de séquences d&#39;acide nucléique cible dans des milliers de cellules individuelles. En conséquence, le débit-FISH propose un net avantage sur lysat / ensemble basée sur des méthodes de détection des acides nucléiques, car chaque cellule est traitée comme une observation indépendante, permettant ainsi des analyses statistiques plus fort et la variance. Ces attributs ont incité l&#39;utilisation de méthodes de FISH et de débit-FISH dans un certain nombre de différentes applications et l&#39;utilité de ces méthodes a été démontrée avec succès dans la détermination de la longueur des télomères 1,2, l&#39;identification cellulaire et l&#39;expression du gène 3,4, suivi de la multiplication virale 5 cellules infectées, et l&#39;analyse des communautés bactériennes et le dénombrement6. Traditionnellement, la spécificité des méthodes de FISH et écoulement du poisson a été communiquée par les sondes d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN. Récemment toutefois, le remplacement des sondes oligonucléotidiques d&#39;ADN avec des analogues d&#39;acides nucléiques comme sondes FISH et flux de poissons a augmenté à la fois la sensibilité et la spécificité de chaque technique en raison de la température de fusion élevée (T m) de ces analogues pour les acides nucléiques naturels 7,8 . D&#39;acides nucléiques verrouillés (LNA) sondes sont un type de analogiques acide nucléique qui contiennent les nucléotides LNA pointes à travers une séquence d&#39;ADN ou d&#39;ARN 9,10. Couplé avec un débit-FISH, sondes LNA ont été précédemment montré à surperformer les sondes d&#39;ADN conventionnelles 7,11 et ont été utilisés avec succès pour détecter l&#39;ARNm eucaryotes 12 et l&#39;ARN viral dans les cellules de mammifères 5. Ici nous étendre cette capacité et décrire un LNA flux POISSONS méthode qui permet la détection spécifique de l&#39;ARN dans la cellule bactériennes (figure 1). Plus précisément, nous nous intéressons à la détection de petits non-codant l&#39;ARN de régulation (SRNA) qui ont remporté un intérêt considérable dans les dernières années car ils ont été trouvés pour servir les principaux éléments de la réglementation dans de nombreux processus cellulaires critiques 13. Cependant, il existe des outils limités pour étudier les défis et les petits ARN de détecter petit ARN dans les cellules bactériennes est due en partie à la taille relativement faible (typiquement 50 à 300 nucléotides de long) et la faible abondance de molécules d&#39;ARNs ainsi que la difficulté générale à travailler avec de plus petites cellules biologiques avec plus ou moins les membranes cellulaires. Dans cette méthode, nous décrivons les conditions de fixation et permeabilzation qui préservent la structure des cellules bactériennes et permettre la pénétration des sondes LNA ainsi que les étapes d&#39;amplification du signal qui permettent la détection spécifique de faible abondance Srna (figure 2).

Un roman à haut débit méthode est décrite qui permet la détection et la quantification relative de petit ARN et d&#39;expression d&#39;ARNm à partir des cellules bactériennes simples en utilisant des sondes d&#39;acides nucléiques verrouillés et cytométrie en flux par fluorescence-<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt;.

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

L'hybridation in situ en fluorescence (FISH) est une technique puissante utilisée pour détecter et localiser des séquences d'acides nucléiques spécifiques au sein du compartiment cellulaire...

L'objectif général de cette procédure est de détecter l'expression d'ARN bactérien dans des cellules bactériennes individuelles. Cela est réalisé tout d'abord en concevant une sonde en acide nucléique verrouillé, ou LNA, modifiée par un groupement biotine-TEG à l'extrémité cinq prime. Si les cellules bactériennes sont ensuite fixées, traitées au dathyl, au percarbonate ou au dsy, puis rendues perméables, l'ARN est dénaturé et la sonde LNA s'hybride. Troisièmement, les cellules sont lavées, bloquées et marquées. Enfin, la fluorescence cellulaire est mesurée par cytométrie en flux. En définitive, les variations de l'expression des ARN dans le temps et au sein des populations peuvent être évaluées.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la présence relative et l'abondance d'espèces d'ARN au sein d'une cellule unique, ainsi que le degré de variation de cette expression au sein de populations homogènes ou hétérogènes. Bien que cette méthode soit actuellement utilisée pour surveiller l'expression des petits ARN bactériens, en théorie, elle peut être utilisée pour détecter l'ARN dans pratiquement n'importe quel type cellulaire. Après avoir conçu la séquence de la sonde LNA, utilisez blast pour vous assurer que la sonde est spécifique uniquement à l'ARNs ou à l'ARNm d'intérêt.Lors de la commande de la sonde, ajouter une modification biotine TEG à l'extrémité cinq prime de l'oligonucléotide LNA. La liaison biotine est nécessaire pour la coloration après hybridation avec un conjugué streptavidine et di. Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode : un contrôle A sans LNA, dans lequel aucune sonde LNA n'est ajoutée durant l'hybridation.Deuxième étape, un témoin sans colorant dans lequel la sonde LNA s'hybride à l'ARNs cible, mais l'événement d'hybridation n'est pas détecté en raison de l'absence du colorant fluorescent. Et troisième étape, un témoin d'ARNs ou d'ARNm non exprimé qui utilise une sonde LNA ciblant un ARNs inexistant ou non exprimé afin de surveiller l'hybridation non spécifique : commencez par récolter 1 × 10⁸ cellules de la bactérie d'intérêt et transférez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tomber en sédiment les cellules bactériennes à 2300 × g pendant cinq minutes après centrifugation.Éliminer le surnageant par pipetage et non par décantation. Ensuite, resuspendre le culot dans 400 microlitres de PBS, ajouter 400 microlitres de solution fixatrice de PFA acétique dans du PBS et mélanger soigneusement les cellules. Incuber ensuite la suspension pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius.Vortexer une fois après cinq minutes, après avoir recentrifugé les cellules. Cette fois, à 4 500 ×g pendant deux minutes. Laver le culot deux fois avec 400 µL de PBS.Enfin, resuspendre le culot dans 400 microlitres de PBS et conserver les cellules fixées à quatre degrés pendant jusqu'à sept jours. Commencer par ajouter 400 microlitres d'une solution fraîchement préparée de point, 1 % dsy à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées, puis bien mélanger les solutions cellulaires par pipetage.Incuber ce mélange pendant 12 minutes à 25 degrés Celsius, puis après avoir lavé les cellules deux fois avec 400 microlitres de PBS, ajouter 800 microlitres d'une solution fraîchement préparée de lysozyme aux cellules. Mélanger soigneusement la solution de cellules et de lysozyme par vortexage et incuber les cellules pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange occasionnel. Après avoir centrifugé les cellules, ajouter 800 microlitres d'une solution fraîchement préparée de protéinase K au culot et mélanger soigneusement la solution de cellules remises en suspension à l'aide d'une pipette.Incubez les cellules pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius, en effectuant une vortexation à mi-parcours de la période d'incubation, après avoir centrifugé et lavé les cellules avec 400 microlitres de PBS. Resuspendez les cellules dans 400 microlitres supplémentaires de PBS, puis ajoutez 100 microlitres de la suspension dans quatre tubes microcentrifugeurs séparés de 1,5 millilitre. Centrifugez ensuite les cellules et jetez les surnageants. Incubez maintenant les quatre échantillons dans 100 microlitres chacun de tampon d'hybridation à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après l'hybridation, ajoutez un millilitre de SSC contenant du tween 20 (SSCT) au mélange d'hybridation afin de permettre la récupération des cellules à partir de la solution d'hybridation visqueuse.Après la centrifugation, ajouter 200 microlitres de solution de formamide SSCT aux culots et mélanger soigneusement. Incuber ensuite les échantillons pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Ajouter maintenant un millilitre de SSCT au mélange et, après une nouvelle centrifugation, resuspendre les cellules dans 500 microlitres de SSCT et incuber la suspension cellulaire pendant 40 minutes sur le bloc chauffant.Après la centrifugation, ajouter 200 microlitres de tampon de blocage aux culots cellulaires, puis incuber les cellules pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius. Après une nouvelle centrifugation, ajouter 50 microlitres d'une solution d'avidine dépourvue de colorant aux culots et mélanger soigneusement pour le témoin sans colorant. Ajouter 50 microlitres de tampon de blocage.Incuber uniquement tous les échantillons pendant encore 12 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange constant dans un agitateur thermorégulé, en protégeant les tubes de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Ensuite, laver les cellules une fois avec 500 microlitres de tampon SSCT et une fois avec 400 microlitres de PBS plus du tween 20 ou PBST. Après avoir éliminé les surnageants, ajouter 100 microlitres d’anticorps biotinylés anti-strippin dans du PBS pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange occasionnel ; cet anticorps se liera au conjugué strippin DI introduit à l’étape précédente.Ensuite, après avoir centrifugé et lavé les cellules deux fois avec 400 microlitres de PBST, effectuer une seconde coloration en ajoutant 50 microlitres de la solution d'avidine débarrassée du colorant aux cellules et bien mélanger. Cette étape augmente le signal émis par sonde LNA hybridée dans le contrôle sans colorant. Ajouter à nouveau 50 microlitres de tampon de blocage uniquement, puis incuber tous les tubes pendant 12 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange constant dans un thermomélangeur.Après l'incubation avec la solution de colorant, laver les cellules une fois de plus avec 500 microlitres de tampon SSCT et une fois avec 400 microlitres de PBST après le deuxième lavage. Resuspendre le culot dans 200 microlitres de PBST et conserver les cellules à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour l'analyse en cytométrie en flux. Pour les cellules bactériennes plus petites, régler le débit du cytomètre en flux sur lent afin de réduire la taille du noyau. De plus, pour les cytomètres en flux dotés d'un seuil de coupure de la diffusion avant, régler le seuil aussi bas que possible afin de garantir la détection des cellules bactériennes de petite taille.Un exemple de cellules fixées et perméabilisées efficacement est montré ici sur ce diagramme de cytométrie en flux en utilisant les conditions précédemment décrites. Pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène, indiquant la présence de peu d'agrégats cellulaires. Toutefois, lorsque des concentrations plus élevées de lysozyme sont utilisées, les cellules ont davantage tendance à s'agréger et présentent des valeurs accrues de diffusion avant, caractéristiques de particules plus grandes, comme observé sur ce diagramme. Ici, un exemple de données de cytométrie en flux provenant d'une expérience réussie de LNA flow FISH est présenté. L'histogramme illustre la détection spécifique d'un ARns cible ainsi que trois contrôles négatifs. Le contrôle négatif sans colorant, en violet, produit la plus faible fluorescence, suivi respectivement par les contrôles négatifs sans LNA et sans ARns exprimé, en bleu et en rouge.Enfin, l'échantillon avec la sonde LNA spécifique à l'ARNs produit la plus grande fluorescence en noir. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures si elle est effectuée correctement. De plus, cette technique fournit davantage d'informations et est plus rentable que la R-T-P-C-R.Après cette procédure, des sondes supplémentaires peuvent être marquées avec d'autres HAPS et ajoutées lors de l'étape d'hybridation afin de permettre la détection multiplexe de l'ARN.I.

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Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode d'bactérienne détection de l'ARN petits

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