Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode d'bactérienne détection de l'ARN petits

L'objectif général de cette procédure est de détecter l'expression d'ARN bactérien dans des cellules bactériennes individuelles. Cela est réalisé tout d'abord en concevant une sonde en acide nucléique verrouillé, ou LNA, modifiée par un groupement biotine-TEG à l'extrémité cinq prime. Si les cellules bactériennes sont ensuite fixées, traitées au dathyl, au percarbonate ou au dsy, puis rendues perméables, l'ARN est dénaturé et la sonde LNA s'hybride.

Troisièmement, les cellules sont lavées, bloquées et marquées. Enfin, la fluorescence cellulaire est mesurée par cytométrie en flux. En définitive, les variations de l'expression des ARN dans le temps et au sein des populations peuvent être évaluées.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la présence relative et l'abondance d'espèces d'ARN au sein d'une cellule unique, ainsi que le degré de variation de cette expression au sein de populations homogènes ou hétérogènes. Bien que cette méthode soit actuellement utilisée pour surveiller l'expression des petits ARN bactériens, en théorie, elle peut être utilisée pour détecter l'ARN dans pratiquement n'importe quel type cellulaire. Après avoir conçu la séquence de la sonde LNA, utilisez blast pour vous assurer que la sonde est spécifique uniquement à l'ARNs ou à l'ARNm d'intérêt.

Lors de la commande de la sonde, ajouter une modification biotine TEG à l'extrémité cinq prime de l'oligonucléotide LNA. La liaison biotine est nécessaire pour la coloration après hybridation avec un conjugué streptavidine et di. Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode : un contrôle A sans LNA, dans lequel aucune sonde LNA n'est ajoutée durant l'hybridation.

Deuxième étape, un témoin sans colorant dans lequel la sonde LNA s'hybride à l'ARNs cible, mais l'événement d'hybridation n'est pas détecté en raison de l'absence du colorant fluorescent. Et troisième étape, un témoin d'ARNs ou d'ARNm non exprimé qui utilise une sonde LNA ciblant un ARNs inexistant ou non exprimé afin de surveiller l'hybridation non spécifique : commencez par récolter 1 × 10⁸ cellules de la bactérie d'intérêt et transférez-les dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tomber en sédiment les cellules bactériennes à 2300 × g pendant cinq minutes après centrifugation.

Éliminer le surnageant par pipetage et non par décantation. Ensuite, resuspendre le culot dans 400 microlitres de PBS, ajouter 400 microlitres de solution fixatrice de PFA acétique dans du PBS et mélanger soigneusement les cellules. Incuber ensuite la suspension pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius.

Vortexer une fois après cinq minutes, après avoir recentrifugé les cellules. Cette fois, à 4 500 ×g pendant deux minutes. Laver le culot deux fois avec 400 µL de PBS.

Enfin, resuspendre le culot dans 400 microlitres de PBS et conserver les cellules fixées à quatre degrés pendant jusqu'à sept jours. Commencer par ajouter 400 microlitres d'une solution fraîchement préparée de point, 1 % dsy à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées, puis bien mélanger les solutions cellulaires par pipetage.

Incuber ce mélange pendant 12 minutes à 25 degrés Celsius, puis après avoir lavé les cellules deux fois avec 400 microlitres de PBS, ajouter 800 microlitres d'une solution fraîchement préparée de lysozyme aux cellules. Mélanger soigneusement la solution de cellules et de lysozyme par vortexage et incuber les cellules pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange occasionnel. Après avoir centrifugé les cellules, ajouter 800 microlitres d'une solution fraîchement préparée de protéinase K au culot et mélanger soigneusement la solution de cellules remises en suspension à l'aide d'une pipette.

Incubez les cellules pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius, en effectuant une vortexation à mi-parcours de la période d'incubation, après avoir centrifugé et lavé les cellules avec 400 microlitres de PBS. Resuspendez les cellules dans 400 microlitres supplémentaires de PBS, puis ajoutez 100 microlitres de la suspension dans quatre tubes microcentrifugeurs séparés de 1,5 millilitre. Centrifugez ensuite les cellules et jetez les surnageants. Incubez maintenant les quatre échantillons dans 100 microlitres chacun de tampon d'hybridation à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes. Après l'hybridation, ajoutez un millilitre de SSC contenant du tween 20 (SSCT) au mélange d'hybridation afin de permettre la récupération des cellules à partir de la solution d'hybridation visqueuse.

Après la centrifugation, ajouter 200 microlitres de solution de formamide SSCT aux culots et mélanger soigneusement. Incuber ensuite les échantillons pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Ajouter maintenant un millilitre de SSCT au mélange et, après une nouvelle centrifugation, resuspendre les cellules dans 500 microlitres de SSCT et incuber la suspension cellulaire pendant 40 minutes sur le bloc chauffant.

Après la centrifugation, ajouter 200 microlitres de tampon de blocage aux culots cellulaires, puis incuber les cellules pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius. Après une nouvelle centrifugation, ajouter 50 microlitres d'une solution d'avidine dépourvue de colorant aux culots et mélanger soigneusement pour le témoin sans colorant. Ajouter 50 microlitres de tampon de blocage.

Incuber uniquement tous les échantillons pendant encore 12 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange constant dans un agitateur thermorégulé, en protégeant les tubes de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Ensuite, laver les cellules une fois avec 500 microlitres de tampon SSCT et une fois avec 400 microlitres de PBS plus du tween 20 ou PBST. Après avoir éliminé les surnageants, ajouter 100 microlitres d’anticorps biotinylés anti-strippin dans du PBS pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange occasionnel ; cet anticorps se liera au conjugué strippin DI introduit à l’étape précédente.

Ensuite, après avoir centrifugé et lavé les cellules deux fois avec 400 microlitres de PBST, effectuer une seconde coloration en ajoutant 50 microlitres de la solution d'avidine débarrassée du colorant aux cellules et bien mélanger. Cette étape augmente le signal émis par sonde LNA hybridée dans le contrôle sans colorant. Ajouter à nouveau 50 microlitres de tampon de blocage uniquement, puis incuber tous les tubes pendant 12 minutes à 25 degrés Celsius avec un mélange constant dans un thermomélangeur.

Après l'incubation avec la solution de colorant, laver les cellules une fois de plus avec 500 microlitres de tampon SSCT et une fois avec 400 microlitres de PBST après le deuxième lavage. Resuspendre le culot dans 200 microlitres de PBST et conserver les cellules à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient prêtes pour l'analyse en cytométrie en flux. Pour les cellules bactériennes plus petites, régler le débit du cytomètre en flux sur lent afin de réduire la taille du noyau. De plus, pour les cytomètres en flux dotés d'un seuil de coupure de la diffusion avant, régler le seuil aussi bas que possible afin de garantir la détection des cellules bactériennes de petite taille.

Un exemple de cellules fixées et perméabilisées efficacement est montré ici sur ce diagramme de cytométrie en flux en utilisant les conditions précédemment décrites. Pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène, indiquant la présence de peu d'agrégats cellulaires. Toutefois, lorsque des concentrations plus élevées de lysozyme sont utilisées, les cellules ont davantage tendance à s'agréger et présentent des valeurs accrues de diffusion avant, caractéristiques de particules plus grandes, comme observé sur ce diagramme.

Ici, un exemple de données de cytométrie en flux provenant d'une expérience réussie de LNA flow FISH est présenté. L'histogramme illustre la détection spécifique d'un ARns cible ainsi que trois contrôles négatifs. Le contrôle négatif sans colorant, en violet, produit la plus faible fluorescence, suivi respectivement par les contrôles négatifs sans LNA et sans ARns exprimé, en bleu et en rouge.

Enfin, l'échantillon avec la sonde LNA spécifique à l'ARNs produit la plus grande fluorescence en noir. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures si elle est effectuée correctement. De plus, cette technique fournit davantage d'informations et est plus rentable que la R-T-P-C-R.

Après cette procédure, des sondes supplémentaires peuvent être marquées avec d'autres HAPS et ajoutées lors de l'étape d'hybridation afin de permettre la détection multiplexe de l'ARN.I.