Étiquetage immunohistologique des microtubules dans dendrites des neurones sensoriels, trachées et les muscles dans la Drosophile Mur Corps Larve

L'objectif général de cette procédure est de marquer les microtubules présents dans les dendrites des neurones sensoriels des larves de drosophile au stade précoce. Cette opération est réalisée en fixant d'abord une larve dans une chambre de dissection magnétique, puis en la disséquant rapidement pour obtenir un filet de larve. Ensuite, toujours dans la chambre magnétique, le filet est immédiatement fixé et soumis à une immunomarquage.

La dernière étape consiste à monter le tissu ; la microscopie à fluorescence confocale peut alors révéler la distribution des microtubules dans les dendrites du neurone sensoriel dopaminergique. Bonjour, je m'appelle Ol Kareem. Aujourd'hui, je vais démontrer un protocole d'étiquetage immunohistologique des microtubules dans les dendrites des neurones sensoriels, la trachée et les muscles de la paroi corporelle larvaire.

Cette méthode est conçue pour fournir des informations sur l'organisation des Myco TL dans les neurones sensoriels périphériques. En outre, elle peut être appliquée à l'étude des réseaux de Myco TL ainsi que d'autres types cellulaires et tissus de la paroi corporelle larvaire. Avant de commencer, il est essentiel, pour la réussite de ce protocole, que le fixateur soit préparé frais immédiatement avant le début de celui-ci.

Le fond génétique de la souche est également essentiel. Par exemple, pour examiner les neurones de l'arborisation dendritique, sélectionnez des animaux exprimant un marqueur dans les membranes de ces neurones, comme MCDA cherry ou MCDA, RA orange. À l’aide d’une boucle en cheveu, rincez rapidement une larve de premier stade dans l’eau, puis transférez-la dans la chambre de dissection.

Maintenant, pour examiner les neurones du groupe ventral, orientez les larves avec le côté dorsal vers le haut et le côté ventral contre le verre. Pour examiner les neurones du groupe dorsal, inversez l'orientation à l'aide d'une épingle à insecte, en fixant l'extrémité antérieure près des crochets buccaux. Placez l'épingle près de l'extrémité pour obtenir les meilleurs résultats.

Les micro-réseaux, les réseaux triples, et en particulier ceux présents dans le DDR sensoriel, se dégradent rapidement après le début de la dissection. Réaliser rapidement la première dissection et une fixation immédiate constituent des facteurs clés de réussite de ce protocole. Coupez l'extrémité postérieure très distale de la larve à l'aide de micro-ciseaux en utilisant une pince.

Saisissez le tissu intestinal qui dépasse de la nouvelle ouverture et tirez délicatement pour extraire tout l'intestin. Ensuite, avec des ciseaux microchirurgicaux, insérez une lame dans la même ouverture et coupez le long de la ligne médiane ventrale en direction de l'extrémité antérieure. Épinglez maintenant les coins postérieurs désormais libres et étirez doucement le filet de larve si nécessaire.

Nettoyer rapidement les organes internes restants. Puis procéder immédiatement à la fixation afin de préserver les microtubules fragiles.

Commencez par aspirer le tampon HL 3.1 sans calcium à l’aide d’une pipette tout en remplissant immédiatement la chambre avec du fixateur fraîchement préparé. À l’aide d’une pipette différente, remplacez aussitôt ce fixateur dilué. À l’aide de fixateur frais, toutes les étapes de fixation et de pause sont effectuées dans la chambre de dissection.

Au cours de cette étape, faites attention à ne pas heurter les épingles à insectes qui maintiennent la larve, car cela pourrait endommager les tissus. Laissez maintenant la fixation se poursuivre sans perturbation pendant 20 minutes à température ambiante afin de terminer la fixation. Rincez le filet de larve six fois avec du PBST pendant 10 minutes par rinçage.

Ainsi, les larves sont rincées pour éliminer complètement le fixateur, pendant une heure au total à température ambiante. L'agitation pendant les incubations n'est pas nécessaire et pourrait provoquer des dommages tissulaires involontaires. Pour préparer la coloration, retirez le dernier lavage de PBST et bloquez le filet fixé en remplissant la chambre avec du sérum de chèvre à 5 % dans du PBST, puis remplacez la solution de blocage par les anticorps primaires dilués dans du sérum de chèvre à 5 % dans du PBST.

Les anticorps primaires utilisés sont la souris anti-FA, la tubuline et le rat anti-CD8, dilués tous deux au 1/1000 afin d'éviter que l'expérience ne s'assèche. Placer la chambre dans un récipient en plastique contenant un tissu humide. Incuber le filet dans les anticorps pendant au moins 16 heures à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, éliminer les anticorps primaires non liés par six lavages au PBST, chaque lavage durant 10 minutes, comme effectué précédemment pour retirer l'agent de fixation. Après une heure de lavages au PBST, ajouter la solution d'anticorps secondaire diluée dans 5 % de sérum de chèvre dans le PBST. Dans cet exemple, les anticorps utilisés sont LOR 4 88, anti-IgG de souris et P SI trois anti-IgG de rat ; couvrir la chambre à partir de ce stade afin d'éviter le photoblanchiment de Fluor quatre, puis incuber le filet avec l'anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius, suivies d'une heure à température ambiante.

Après l'incubation avec l'anticorps secondaire, éliminer les anticorps non liés selon le même protocole rigoureux comprenant six lavages dans du PBST, chaque lavage durant 10 minutes. Le filet est maintenant prêt à être monté : pour un montage rapide, plonger le tissu dans une petite goutte de glycérol à 80 % à l’aide de pinces. Saisir délicatement l’extrémité antérieure près des crochets buccaux et transférer le tissu sur une lame, côté cuticule vers le bas, puis sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles afin d’améliorer la transparence du tissu et d’obtenir un échantillon stable et permanent.

Le DPX montagne comme décrit précédemment, la coloration fluorescente a révélé que différentes branches au sein d'un arborisation dendritique présentent une organisation cytosquelettique différente : dans l'arborisation d'un neurone DA de classe quatre provenant d'une larve de premier stade, les branches principales sont positives pour la tubuline, tandis que certaines fines branches latérales ne le sont pas. Un assemblage de coupes sérielles à travers une coloration similaire d'un neurone DA de classe un, transformé en film, est plus révélateur, surtout lorsque la coloration immuno de la tubuline dans les tissus environnants rend l'analyse de l'organisation microtubulaire et des neurones difficile. L'anticorps primaire murin anti-tubuline peut être remplacé par un anticorps murin spécifique aux neurones dilué au 1/1000.

Les branches principales des neurones de classe quatre sont positives pour fch. Alors que certaines fines branches latérales sont négatives pour fch. Un ensemble de sections sérielles de muscles de la paroi corporelle a révélé les réseaux de microtubules dans ce tissu.

Une projection de plusieurs sections confocales traversant les muscles de la paroi corporelle et la trachée a révélé les réseaux complexes de microtubules présents dans ces tissus. Un agrandissement sur un ensemble de sections sérielles traversant une extrémité trachéenne dans la paroi corporelle musculaire a mis en évidence les détails de l'organisation microtubulaire. Ainsi, la combinaison de cette procédure avec d'autres méthodes, comme la génération de larves, de neurones sensoriels périphériques ou de croisements génétiques, permet de répondre à des questions supplémentaires, telles que les mécanismes contrôlant l'organisation des microtubules dans les dendrites.