Enquêter inflammation intestinale induite par DSS modèle des MICI

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la réponse immunitaire intestinale induite par le sulfate de sodium de dextron en déterminant les quantités d’activité de la myélo peroxydase et de cytokines pro-inflammatoires produites en réponse à l’inflammation. Tout d’abord, la colite DSS est induite chez la souris par l’introduction d’une solution de DSS SALT dans l’eau potable. Ensuite, la gravité de la colite est évaluée par un score macroscopique et le côlon est retiré pour une analyse plus approfondie.

Le côlon disséqué est ensuite sectionné en trois morceaux pour l’histologie, la quantification des cytokines et l’activité NPO. Enfin, le tissu du côlon est homogénéisé et le surnageant est utilisé pour déterminer l’activité du MPO. En fin de compte, les changements dans l’activité MPO peuvent être déterminés à partir des données d’absorbance collectées à l’aide d’un spectrophotomètre.

Cette méthode peut donner un aperçu des informations chroniques de divers modèles de maladies inflammatoires de l’intestin, telles que la colite induite par le DSS et le TNBS. De plus, vous pouvez utiliser cette méthode dans d’autres organes tels que le poumon et le foie avant de commencer la procédure. Remplacez l’eau potable dans chaque cage de souris par une solution DSS pour induire l’inflammation.

Donnez de l’eau potable en autoclave aux souris témoins sans DSS. Ensuite, le jour de l’expérience, disséquez le côlon comme précédemment démontré dans l’article JoVE de Whitham Williams et Williams. Pressez soigneusement les matières fécales dans tout le côlon à l’aide d’une pince à épiler pliée, en les recueillant dans un papier de pesée en rinçant le tissu avec du PBS stérile.

Évaluez les selles à l’aide d’une paire de pinces pour appuyer sur les matières fécales afin de déterminer leur consistance afin de déterminer un score pour le sang dans les selles. Notez la couleur des matières fécales et validez davantage l’évaluation à l’aide d’un test d’hémorganisme, qui consiste à étaler des selles sur du papier hémamasque, à ajouter du révélateur, puis à noter que la couleur bleue indique un test de selles positif pour le sang. Utilisez ensuite ce tableau pour déterminer une valeur pour chacune des conditions.

Ensuite, tout en maintenant l’orientation proximale à distale du côlon, coupez le côlon en trois sections égales. Ensuite, prélevez des fragments d’échantillons dans les sections proximale et médiane du côlon du côlon et placez les échantillons dans des tubes d’eph individuels de 1,5 millilitre. Pour évaluer les dommages histologiques de la gravité de la colite, utilisez la section de tissu la plus distale du côlon et coupez un petit fragment d’un demi-centimètre à un centimètre.

Placez le fragment dans une cassette de tissu et immergez-la dans une solution tamponnée de formol à 10 %. Ensuite, après avoir préparé des coupes transversales des fragments de tissu incrustées de paraffine, colorez les sections avec de l’éoïne à l’hématine pour qu’elles soient marquées par un observateur aveugle. Enfin, congelez les échantillons des sections proximale et moyenne dans de l’azote liquide et conservez-les jusqu’à ce qu’ils soient utilisés à moins 70 degrés Celsius.

Après avoir retiré les échantillons de côlon de l’entreposage à moins 70 degrés Celsius, placez-les sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pince pliée, vous pouvez retirer les matières fécales ou la graisse visibles, et placez-les dans des tubes individuels de deux millilitres adaptés à une utilisation dans un homogénéisateur. Ensuite, déterminez et enregistrez le poids de chaque échantillon.

Ensuite, ajoutez des billes d’homogénéisateur dans chaque tube d’échantillon, puis ajoutez la quantité appropriée de tampon à languette H dans le tube en fonction du poids du tissu tel que déterminé ci-dessus, dissociez les fragments avec un homogénéisateur de tissu pendant quatre minutes à 30 hertz. Enfin, centrifugez la solution cellulaire pendant six minutes à 13, 400 fois G et quatre degrés Celsius. Recueillez le surnageant dans un tube frais, puis en veillant à conserver le cordon d’homogénéisation, jetez la pastille résultante.

Le surnageant peut ensuite être stocké à moins 70 jusqu’à son utilisation. Commencez cette étape en ajoutant sept microlitres de l’homogénat de tissu préalablement préparé en trois exemplaires dans une plaque à 96 puits. Ajoutez ensuite 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène dilué à de l’iode OD Dion fraîchement préparé.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 200 microlitres du mélange de peroxyde d’hydrogène dans chacun des puits. Maintenant, mesurez l’absorbance de 550 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre, en prenant trois lectures à 32e intervalle. Ensuite, à l’aide des données d’absorbance, du poids des tissus et du volume tampon, calculez l’activité NPO dans les homogénats, comme démontré dans ce calcul d’échantillon.

Pendant la durée du traitement par le DSS, l’indice d’activité de la maladie peut être utilisé pour évaluer et évaluer la progression clinique de la maladie. Les animaux traités par le DSS présentent une perte de poids significative par rapport à leur poids initial, des selles molles et des saignements fécaux. Plus les systèmes macroscopiques sont substantiels, plus l’indice d’activité de la maladie est élevé.

Lors du sacrifice et de l’examen des côlons de souris ayant reçu 5 % de DSS dans l’eau potable pendant cinq jours, la gravité de la colite basée sur l’évaluation macroscopique du raccourcissement de la longueur du côlon, de l’hémorragie colique, de l’hémorragie fécale, de l’amaigrement de la consistance des selles et des signes de saignement rectal pour cette expérience représentative a été déterminée comme étant environ cinq fois pire que chez les témoins traités avec de l’eau uniquement, comme le démontrent ces données transversales Les échantillons de tissu colique, comme pour H et E, ont des scores histologiques plus élevés que les témoins traités à l’eau. Ici, l’architecture normale et l’absence d’infiltration cellulaire ont pu être notées dans la zone indiquée par l’astérisque dans cette coupe transversale colorée h et e prélevée sur un animal témoin qui n’a reçu que de l’eau. Comparez maintenant cette coloration h et e d’un échantillon d’un animal traité au DSS à la figure précédente.

Le côlon de cet animal présente plus de dommages histologiques, comme en témoigne une plus grande infiltration cellulaire, comme l’indique le signe dièse, et une plus grande appauvrissement des cellules caliciformes et une plus grande distorsion. Dommages à l’architecture de la crypte K indiqués par l’astérisque. Pour caractériser davantage l’étendue de la gravité de la maladie chez les souris traitées au DSS, l’activité NPO, un marqueur de substitution de l’inflammation, peut être évaluée à partir d’échantillons de tissu du côlon homogénéisés.

Comme prévu, les côlons traités au DSS ont une activité NPO plus élevée que les témoins. De plus, la gravité de la colite induite par le SSD est associée à des niveaux accrus de cytokines pro-inflammatoires, telles que IL un bêta, IL six et TNF alpha. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’activité MPO peut diminuer avec le temps.

Par conséquent, le test MPO devrait être l’un des premiers tests effectués pour déterminer la gravité de l’inflammation intestinale.