Segmentation et évaluation des volumes FAT dans les modèles murins d'obésité Utilisation de X-ray Computed Tomography

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une imagerie non invasive, une quantification et une visualisation de la teneur en graisse de souris vivantes. Cela est réalisé en effectuant d'abord une scanographie par rayons X du souris. La deuxième étape de la procédure consiste à segmenter et quantifier les volumes de graisse dans le souris en fonction de la densité radiologique.

La troisième étape consiste à visualiser les données de tomodensitométrie en trois dimensions, avec les volumes de graisse mis en évidence en rouge. En fin de compte, ces résultats permettent la quantification et la visualisation de la teneur en graisse au cours d'études longitudinales in vivo à l'aide d'une tomodensitométrie à rayons X albia, associée aux logiciels PMOD et vol view. L'un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'analyse ex vivo, est qu'elle permet une évaluation non invasive et longitudinale de la graisse chez des modèles animaux de petite taille présentant des maladies.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car le protocole de segmentation et de visualisation comprend plusieurs étapes qui doivent être réalisées successivement. De plus, les paramètres optimaux de rayons X doivent être utilisés pendant l'acquisition. Pour obtenir le meilleur contraste à partir du tissu adipeux, commencez par anesthésier les souris obèses d'intérêt à l'aide d'une chambre d'induction, puis transférez-les vers un embout nasal.

Procédez à l’anesthésie pendant l’imagerie en plaçant les souris sur un lit standard pour rat, avec les membres latéraux par rapport au tronc. Cela permet une acquisition TDM uniforme. Réglez le système de tomodensitométrie pour balayer un lit de 115 millimètres de longueur en utilisant 600 projections.

Régler la source de rayons X sur 200 microampères et 45 kilovolts crête, et utiliser un filtre en aluminium de 0,5 millimètre pour durcir le faisceau. La dose profonde équivalente de rayonnement que la souris recevra avec ce réglage est d'environ 220 milli sieverts, tandis que la dose équivalente superficielle est de 357,4 milli sieverts sur l'ordinateur. Sélectionner l'algorithme FBP en utilisant les paramètres standards pour la reconstruction d'image.

En fin de compte, l'image finale est constituée de voxels isotropes de 125 microns et peut être utilisée pour l'analyse d'images de l'animal entier. L'analyse d'image est effectuée à l'aide du logiciel d'analyse PMOD : tout d'abord, PMOD segmente les images selon la densité tissulaire, puis quantifie le volume de graisse. Après avoir chargé l'image, réduisez sa taille afin de minimiser les exigences informatiques.

Accédez à l'onglet de la vue principale, sélectionnez outils, puis réduction. Réglez les valeurs de réduction à deux pour X, deux pour Y et deux pour Z, cochez remplacer et exécutez le processus. Une boîte de message apparaît lorsque le processus est terminé.

Pour éliminer les éléments du lit et du cône nasal des images, masquez-les avant l'analyse des volumes d'intérêt (VOI). Accédez aux dispositions des plans, rotations, marqueurs 3D miroirs et sélectionnez les plans et les dispositions. Sélectionnez afficher le plan Z. Ensuite, faites défiler jusqu'au cône nasal dans le plan Z.

Ensuite, sélectionnez l'onglet principal VOI et choisissez de dessiner les sommets. Dessinez une ROI autour du nez, en excluant le lit et le cône nasal, puis sélectionnez copier la ROI réelle vers chacune des autres. Coupez avec l'élément du cône nasal.

Collez la ROI depuis le tampon sur le museau selon les besoins. Utilisez la commande de modification du groupe de sommets pour ajuster les ROI. Lorsque les cônes nasaux ne sont plus visibles, supprimez la ROI et générez une VOI afin d'englober la circonférence de l'animal.

Accédez aux outils VOI, puis au masquage et à l'algèbre. Saisissez moins 1000 dans la boîte de dialogue fournie. Ensuite, sélectionnez le bouton intitulé Masquer les voxels en dehors des VOI sélectionnés.

Lorsque le message « opération de données irréversible, voulez-vous continuer ? » s'affiche, sélectionnez oui. Accédez maintenant à plans, agencements, rotations, marqueurs 3D miroir, puis enfin à plans et agencements. Sélectionnez afficher tous les plans.

Examinez l'intégrité du volume d'intérêt (VOI). Lorsque le VOI est satisfaisant, enregistrez-le sous forme de fichier analyze et modifiez le préfixe du nom de fichier. Poursuivez ensuite avec la segmentation de l'image pour obtenir le volume total de l'animal.

Commencez par sélectionner les outils et les éléments externes. Ensuite, cochez la case de segmentation. Saisissez une plage allant de moins 300 à plus 3 500 et lancez la segmentation.

Ensuite, sélectionnez les statistiques de la région d'intérêt (VOI), qui indiquent les statistiques représentant le volume total. Notez ce volume. Maintenant, segmentez l'image pour le volume de graisse en revenant d'abord à l'image des masses non segmentée.

Deuxièmement, chargez le fichier de données de masse enregistré et cochez la case analyser dans la fenêtre de chargement. Ensuite, sélectionnez outils et externe. Puis activez la case à cocher segmentation.

Entrez une plage allant de moins 200 à moins 50 et lancez la segmentation. Après avoir approuvé les résultats, sélectionnez VOI.Statistics. Notez que les statistiques indiquées représentent le volume de graisse.

Enregistrez les résultats dans le format analysé et attribuez un préfixe de nom de fichier unique. Toutefois, si la densité cutanée ou périphérique persiste, utilisez le protocole d'érosion et de dilatation pour éliminer ces régions lors de l'analyse du volume d'intérêt (VOI). Avant d'enregistrer, accédez à outils externes et cochez la case morphologique dans la nouvelle boîte.

Sélectionnez l'érosion suivie de. Ensuite, revenez à la case à cocher morphologique, sélectionnez la dilatation et confirmez. Vérifiez que le problème de densité périphérique ou cutanée a été résolu, puis enregistrez les résultats. Utilisez le logiciel Volvo View version 3.2 pour créer des visualisations 3D rendues des images segmentées.

Commencez par ouvrir le jeu de données de CT enregistré au format analyze. Utilisez les paramètres par défaut dans la fenêtre contextuelle, puis ouvrez le menu des plugins et sélectionnez, dans utilitaires, la fonction de fusion de volumes. Désactivez l'option de recalibrage des composantes.

Cliquez sur attribuer une deuxième entrée. Choisissez les données de graisse segmentée comme deuxième entrée et utilisez les paramètres par défaut dans la fenêtre contextuelle. Appliquez ensuite le plugin pour obtenir une vue agrandie de la souris sujet.

Double-cliquez sur la fenêtre de visualisation du volume. Revenez à l'onglet couleur/opacité. La zone de liste déroulante « composant » indique quel jeu de données est actuellement modifié.

Deux curseurs se trouvent au bas de l'onglet. Ils déterminent la luminosité relative de chaque jeu de données composant la superposition, à l'aide de valeurs comprises entre zéro et un. Pour modifier la couleur en nuances de gris, par exemple, rendez-vous à la section de correspondance des couleurs du scalogramme.

Double-cliquez sur l'un des curseurs et faites-le glisser hors de la boîte. Ajoutez un deuxième curseur en cliquant n'importe où dans la zone des curseurs. Rendez le curseur de couleur de gauche noir et le curseur de couleur de droite blanc.

Ensuite, accédez à la zone de mappage de l'opacité scalaire et créez un nouveau point en cliquant à l'intérieur de la zone. Cela donnera un total de trois points dans la fenêtre pour le point central. Modifiez la valeur scalaire à environ moins 3000 et réglez la valeur d'opacité à zéro.

À droite de la fenêtre, sélectionnez le troisième point et modifiez sa valeur de scalabilité à environ 32 000 et son opacité à 0,25. Le premier point peut se situer n'importe où à gauche, pourvu que sa valeur d'opacité soit réglée à zéro. Une fois la valeur scalaire définie, passez au composant deux, qui doit modifier l'apparence de la graisse, puis réglez chacun des curseurs de couleur sur rouge en double-cliquant et en déplaçant le curseur de teinte H jusqu'à l'extrémité.

Cela colore artificiellement la graisse en rouge. Pour créer un film de rotation en trois volets affichant la graisse en tomodensitométrie et la superposition, placez d'abord la souris sujette en position verticale, le dos tourné vers le haut, en cliquant et en la faisant glisser. Ensuite, sous « Poids des composantes », réglez la valeur de la composante deux sur zéro afin que seule la scanographie CT soit affichée. Troisièmement, cliquez sur « Revoir », puis sur « Appareil photo » et sélectionnez un nombre d'images pour le film de rotation. Quatrièmement, modifiez la valeur de rotation X à 360 degrés.

Ensuite, sélectionnez « create » dans la boîte de dialogue contextuelle. Créez un nouveau dossier nommé CT et enregistrez le fichier au format TIF, ce qui produira une série d'images de rotation. Répétez ces étapes pour l'image de graisse ainsi que pour l'image CT de graisse superposée, en enregistrant leurs images de rotation dans des dossiers distincts. Pour générer un film de rotation à partir des images obtenues, ouvrez ImageJ et importez les séquences d'images.

Sélectionnez la première image dans le dossier CT et les autres seront automatiquement sélectionnées. Répétez ce processus pour les séquences de graisse et de superposition avec l'un des empilements. Toujours ouvert.

Ouvrez le gestionnaire de régions d'intérêt (ROI). Il se trouve dans les outils d'analyse, puis dans le gestionnaire de ROI. Dessinez une région d'intérêt autour de la souris étudiée en excluant les pixels inutiles du fond. Une fois terminé, cliquez sur « Ajouter » dans le gestionnaire de ROI.

Ensuite, appliquez la même région d'intérêt (ROI) à chaque séquence d'images. Lorsque la ROI est présente sur toutes les coupes, cliquez avec le bouton droit. Dans la ROI sélectionnée, dupliquez et sélectionnez. Vérifiez la pile dupliquée.

Cela permet de séparer la région d'intérêt (ROI) du reste de l'image. Fermez maintenant les piles d'images plus grandes et répétez cette procédure pour les trois séquences d'images. Pour combiner les piles, utilisez la commande « combine », située dans le menu « stacks », puis « tools ».

Sélectionnez la pile de tomodensitométrie pour la pile un et la pile de tissu adipeux pour la pile deux. Répétez ensuite le processus. Sélectionnez les piles nouvellement combinées pour la pile un et la pile de superposition pour la pile deux.

Ceci termine la création d'une pile de rotation d'image à trois volets. Prévisualisez la pile en sélectionnant lecture dans le coin inférieur gauche de la fenêtre d'image. Ensuite, enregistrez-la sous forme de film A VI.

Des souris obèses B six V LE OB J ont été utilisées pour illustrer la faisabilité du système de tomodensitométrie Alber. Pour les mesures de teneur en graisse par tomodensitométrie, elles ont été comparées à des types sauvages C 57 black six. À gauche figure le volume total en tomodensitométrie d'une souris obèse.

Au centre se trouve le volume de graisse en rouge, et à droite, la superposition. Une analyse similaire d'animaux de type sauvage montre la différence importante de teneur en graisse par rapport à la souris obèse. Le volume total, le volume de graisse et les rapports de volume ont été calculés pour chaque animal.

Le rapport moyen entre le volume de graisse et le volume total pour le groupe de type sauvage et le groupe obèse était respectivement de 0,09 et de 0,42. Ces valeurs différaient de manière significative avec une valeur P de 0,001. Après avoir visionné cette vidéo, on devrait avoir une compréhension solide de la manière de segmenter les volumes de graisse dans un jeu de données de tomodensitométrie d'une souris vivante, une fois maîtrisé.

Cette technique doit prendre moins de 30 minutes à réaliser. Merci d'avoir regardé, et nous vous retrouverons la prochaine fois.