Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l'aide d'une imprimante jet d'encre standard

L’objectif global de cette procédure est de créer des pores transitoires dans les membranes cellulaires à l’aide de l’impression à jet d’encre. Pour ce faire, il suffit de modifier d’abord une imprimante à jet d’encre standard. La deuxième étape consiste à vider et à nettoyer une cartouche d’encre d’imprimante pour permettre l’insertion de l’encre biologique.

Ensuite, les cellules d’intérêt sont suspendues dans une solution de monomères d’acton marqués par fluorescence et de PBS pour créer la solution de bio-encre. La dernière étape consiste à imprimer l’encre biologique sur des lames de microscope à l’aide de l’imprimante et de la cartouche modifiées. En fin de compte, la microscopie fluorescente peut être utilisée pour montrer que les quatre monomères d’actine G conjugués au fluor ont été internalisés par les cellules imprimées à travers des pores membranaires transitoires.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques standard de transfection et de micro-injection cellulaire est qu’elle est facile à utiliser et permet d’obtenir une viabilité cellulaire élevée. Bien que cette technique puisse donner un aperçu de la génétique, elle peut également être appliquée à d’autres domaines d’étude tels que la biophysique cellulaire et l’ingénierie tissulaire en biophysique cellulaire. Cette technique peut être utilisée pour observer facilement le cytosquelette d’une cellule pendant la migration cellulaire.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons voulu être en mesure de visualiser les changements dans l’arrangement du cytosquelette dus aux forces appliquées sur les cellules. Commencez par déverrouiller les clips en plastique de la base inférieure de l’imprimante, puis soulevez lentement le boîtier en plastique supérieur. Détachez ensuite le panneau lumineux de l’écran des boutons du haut de l’imprimante, en le laissant connecté à la carte mère de l’imprimante.

À l’aide de lingettes Kim et d’éthanol. Nettoyez l’intérieur de l’imprimante, en particulier les zones où la cartouche d’encre repose et où l’impression a lieu. Ensuite, localisez le câble qui alimente les mécanismes d’alimentation papier du bureau HP Jet 500.

Ils se trouvent juste en dessous du bac à papier à gauche de l’avant et débranchez les câbles de la carte mère. Localisez maintenant le mécanisme de détection du papier et fixez une boucle de fil au levier en plastique gris situé au-dessus et derrière le mécanisme d’alimentation en papier d’impression pour servir de poignée manuelle, placez une platine ici. Le support d’expédition en mousse pour 15 tubes à centrifuger est utilisé avec plusieurs lames de microscope collées en place dans la zone d’impression devant le mécanisme d’alimentation en papier pour amener les lames d’impression souhaitées à un niveau juste en dessous de la tête d’impression de la cartouche.

Enfin, pour maintenir la technique aseptique, placez l’imprimante à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Commencez par retirer la cartouche de son emballage, en laissant le ruban de protection recouvrir les contacts de l’imprimante et la tête d’impression. Stabilisez le corps de la cartouche à l’aide d’une pince en laissant le dessus vert dégagé de tout obstacle à l’aide d’un outil de coupe rotatif portatif.

Coupez le haut vert de la cartouche, videz l’encre restante du réservoir, puis retirez le ruban de protection en plastique recouvrant les contacts de l’imprimante et la tête d’impression. L’eau s’échappera probablement de la tête d’impression pendant ce processus, mais cela n’endommagera pas la cartouche. Lorsque l’eau est claire, laissez la cartouche sécher.

Pour maintenir un environnement d’impression propre, commencez par immerger complètement la cartouche dans un bécher rempli d’eau déminéralisée, puis sonicez la cartouche pendant 15 minutes. Après la sonication, retirez la cartouche et secouez l’excès d’eau. Vaporisez 70 % d’éthanol dans la cartouche pour créer un environnement plus aseptique.

Après avoir récolté les cellules d’intérêt, centrifugez les cellules dans cinq millilitres de milieu frais dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres pendant cinq minutes à 250 fois G à température ambiante. Ensuite, aspirez le milieu, puis remettez les cellules en suspension à une fois 10 à cinq cellules par millilitre dans une solution mère d’actine G fluorescente fraîchement préparée Pour créer de l’encre bio, notez que 250 microlitres d’encre biologique impriment trois lamelles de couverture avec le motif de ligne illustré ici. Une fois l’imprimante allumée et réchauffée, placez la surface d’impression souhaitée ici, des lamelles de recouvrement de 22 millimètres sur 22 millimètres sont utilisées au centre de la platine précédemment assemblée.

Ensuite, ouvrez un logiciel de dessin et sélectionnez le motif souhaité. Maintenant, pipetez environ 100 à 120 microlitres de la suspension cellulaire dans le petit puits circulaire au fond du compartiment de la cartouche. Imprimez le fichier au fur et à mesure que l’imprimante se réchauffe, la cartouche se met en position prête.

Lorsque la cartouche se déplace légèrement vers la gauche de l’encre, l’encre coule bien et y reste. Tirez sur le mécanisme d’alimentation du papier, le fil et l’impression commenceront. L’imprimante imprimera sur la lamelle placée au centre de la scène d’impression à l’aide d’une imprimante de bureau HP jet 500 avec une bio-encre composée d’une suspension de cellules fibroblastes dans une solution de monomère d’actine G.

À l’intérieur d’un HP série 26, les cellules de la cartouche d’encre ont été imprimées sur des lamelles de microscope en verre. Cette figure illustre un résultat représentatif de cellules de fibroblastes imprimées qui montrent des monomères d’actine fluorescents incorporés. Ce motif a été utilisé dans la figure précédente pour créer une ligne continue de la solution d’impression sur la majorité de la lame de microscope.

Sur cette figure, la ligne droite dans laquelle le biolien et les cellules se sont mutuellement déposés est représentée. Notez qu’immédiatement après l’impression, il y a une augmentation de la fluorescence de fond car la solution Biolink dans laquelle les cellules sont suspendues contient des monomères d’actine fluorescents en excès libres, l’incubation des cellules pendant environ 10 minutes après l’impression facilite l’adhérence à la lame, permettant à la solution monomère en excès d’être lavée du substrat avec un milieu de croissance frais, réduisant considérablement la fluorescence de fond. Ici, une image représentative de trois fibroblastes T imprimés dans une zone d’impression localisée, comme le montre cette photomicrographie de microscopie fluorescente d’une cellule prise 15 minutes après l’impression montre giin en vert, le noyau en bleu et la superposition de l’actine GI et du colorant nucléaire.

Les deux images suivantes montrent la microscopie fluorescente de deux fibroblastes en ligne trois heures après l’impression. Cette première image montre des monomères d’actine marqués par fluorescence à l’intérieur des cellules. Cette deuxième image est une superposition du canal fluorescent avec l’image d’arrière-plan pour montrer que bien qu’il puisse y avoir des débris sur la diapositive dans le coin inférieur gauche, elle n’est pas fluorescente.

Enfin, un groupe témoin de cellules non imprimées incubées pendant trois heures avec des monomères marqués par fluorescence est présenté ici pour démontrer que les monomères ne peuvent pas pénétrer la membrane cellulaire sans perméation de la membrane par impression cellulaire. Lors de cette procédure, il est important d’avoir plusieurs cartouches nettoyées et prêtes à l’emploi, car le colmatage de l’imprimante est l’un des problèmes qui ralentit cette technique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conversion d’une imprimante de bureau standard pour imprimer des cellules vivantes, ce qui permet de créer une force membranaire transitoire.