Détermination de l'activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer l'activité des lymphocytes T cytotoxiques en comparant une approche basée sur l'impédance utilisant le système EXOGEN avec le test de libération de chrome. La première étape consiste à isoler les cellules mononucléées du sang périphérique à partir de sang total à l'aide de fial. Ensuite, les PBMC sont ajoutés dans des puits contenant un antigène peptidique, de l'IL deux humaine recombinante et des PBMC irradiés afin de générer des lymphocytes T CD huit spécifiques de l'antigène.

Les lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène sont ensuite cultivés en co-culture avec des cellules tumorales dans les deux tests afin d'induire la mort des cellules tumorales. Les résultats obtenus montrent le pourcentage de lyse des cellules tumorales, mesuré à l'aide de la méthode d'impédance et du test de libération de chrome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de libération de chrome, est que le système basé sur l'impédance permet de recueillir des données en temps réel et nécessite moins de cellules, qui n'ont pas besoin d'être marquées. Pour ce protocole, le sang provenant de donneurs sains et positifs pour l'HLA-A2 fournit une source de PBMC, ou cellules mononucléées du sang périphérique, conformément au protocole du fabricant.

Utilisez F call PA plus pour séparer les P BMCs du sang. Ensuite, répartissez environ 4 millions de P BMCs dans des plaques à six puits, avec deux millilitres de milieu par puits. Ajoutez à chaque puits le peptide se liant à HLAA deux à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre de culture.

Les cellules tous les deux jours afin de stimuler et d'élargir les lymphocytes T. Ajouter du milieu frais supplémenté avec de l'IL-2 humaine recombinante à une concentration finale de 50 unités par millilitre. Après une semaine, préparer une culture de PBMC autologues, irradier les cellules et les exposer pendant deux heures à la même HLA.

Un peptide à deux sites de liaison à 10 microgrammes par millilitre permet de restimuler la culture en ajoutant un millilitre des PBMC autologues irradiés à chaque puits. Continuer à ajouter du milieu frais supplémenté avec l'IL-2 tous les deux jours ; après une autre semaine, restimuler les cultures de la même manière une deuxième fois. Après six jours supplémentaires en culture, les cellules seront prêtes à être utilisées.

Préparer la station de mesure d'impédance en l'équilibrant à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure. Récolter les cellules tumorales humaines à 75 % de confluence en utilisant de la trypsine 0,25 % et une centrifugation. Compter les cellules tumorales à l'aide d'un hémocytomètre et les reconstituer dans du RPMI.

Milieu tumoral à une concentration de 7 500 cellules par microlitre. Lors du prochain programme, le logiciel de l'agent Excel configure la page de disposition avec la disposition des puits. Configurez la page de programmation pour effectuer des mesures d'impédance toutes les cinq minutes pendant une période de 40 heures ; durant les 18 premières heures, le système Xceligent ne prendra que des mesures d'impédance des cellules tumorales.

Ensuite, ajouter 100 microlitres de milieu tumoral RPMI par puits. Effectuer une mesure de fond sur les EPL en mesurant l'impédance en l'absence de cellules. Après l'ajout des cellules tumorales, charger les plaques dans la station EPL et commencer les mesures.

Les cellules tumorales commenceront immédiatement à adhérer aux EPL. Après environ 18 heures d'incubation, les cellules tumorales seront attachées aux EPL et auront doublé pour atteindre 15 000 cellules tumorales par puits. À ce moment, récoltez les lymphocytes T préparés par détachement doux et centrifugation avec agitation.

Les cellules T, les reconstituer dans un milieu RPMI contenant 10 % de FBS et les compter à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois la densité cellulaire connue, préparer une série de dilutions au double de cellules T de sorte que, lorsqu’on ajoute 200 microlitres de cellules T aux cellules tumorales, la concentration la plus élevée soit de 40 cellules T par cellule tumorale. La dernière dilution de la série doit fournir 1,25 cellule T par cellule tumorale.

Mettons en pause la station EXOGEN et retirons l'EPL à l'aide d'une pipette. Enlevons le milieu des puits, puis ajoutons 200 microlitres de lymphocytes T en utilisant toutes les concentrations provenant de la série de dilutions comme contrôle négatif. Utilisons du milieu pur, replaçons l'EPL dans la station et poursuivons le programme à la fin du dosage.

Normalisez les résultats. Suivez toujours les procédures de sécurité institutionnelles relatives aux rayonnements lors de l'utilisation du chrome 51 et des cellules cibles marquées au chrome 51, et utilisez un blindage pour réduire l'exposition aux rayonnements. Commencez par pulser les cellules tumorales pendant deux heures à raison d'un million de cellules par millilitre avec 10 microlitres par millilitre de chrome 51 frais.

Ensuite, lavez les cellules tumorales dans 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de FCS, centrifugez les cellules et resuspendez-les dans le même milieu à une concentration d'un million de cellules par millilitre. Puis, dans une plaque de 96 puits à fond rond, ajoutez 100 000 cellules tumorales par puits pour calculer la libération spontanée.

Ne rien ajouter à six de ces puits. Ajouter 100 microlitres de Triton X-100 à six autres puits pour lyser les cellules et ainsi calculer la libération maximale dans tous les puits restants. Ajouter les lymphocytes T à la plaque en utilisant la série de dilutions préparée précédemment.

Incubez maintenant les plaques pendant cinq heures et prélèvez des échantillons de 50 microlitres de surnageant à partir de chaque puits. Chargez les échantillons sur une plaque luma après avoir séché les plaques toute la nuit dans la hotte à température ambiante. Mesurez leurs CPM à l’aide d’un compteur gamma T-cell et SKBR trois. Les cellules cancéreuses ont été cultivées sur des plaques X intelligence et l’indice cellulaire a été mesuré, ce qui reflète l’impédance de la plaque, car les cellules T n’ont pas besoin d’adhérence pour proliférer.

Leur effet sur l'impédance a été négligeable au cours d'une culture de 40 heures. Les cellules cancéreuses cultivées seules ont montré une mesure d'impédance croissante. Toutefois, l'ajout de cellules T à 18 heures interrompt cette tendance.

Cet événement nécessite une normalisation logicielle après l'ajout de cellules T et est davantage étudié dans l'expérience suivante. Lorsque des cellules SK BR 3 ont été mises en co-culture avec différentes concentrations de cellules T, les réductions de l'impédance étaient très clairement dépendantes de la dose de cellules T ; les données ont été recueillies toutes les cinq minutes au cours de trois essais au moment de l'heure 10. Les indices cellulaires suivaient un polynôme du second ordre sur la gamme des cellules T, indiquant que la station Exogen surveille en temps réel la mort des tumeurs SK B 3 induite par les cellules T CD8+ via une baisse de l'indice cellulaire afin de déterminer si les réductions de l'impédance des cellules SK BR 3 par les cellules T étaient spécifiques à l'antigène.

Les cellules SK KBR trois ont été mises en co-culture avec des cellules T spécifiques de la grippe (FLU) positives pour HLA A deux, qui ne reconnaissent pas HER deux nouveau. Ces cellules présentaient une activité lytique significativement moindre. Afin de déterminer davantage si les cellules T spécifiques d’HER deux nouveau tuaient de manière spécifique à l’antigène, un anticorps dirigé contre le ligand Fas a été ajouté aux co-cultures. L’anticorps n’a pas réduit l’activité lytique des cellules T spécifiques d’HER deux nouveau P 360 9.

Cependant, avec des lymphocytes T activés de manière non spécifique à l’aide de billes anti-CD3, CD28, l’anticorps a inhibé la lyse, indiquant que la destruction se produisait de manière dépendante de la classe I du CMH. Soit un anticorps anti-classe I du CMH, soit un anticorps de contrôle d’isotype ont été ajoutés aux co-cultures. Les résultats ont fortement soutenu cette hypothèse.

Les cellules T ont ensuite été co-cultivées avec d'autres cellules cancéreuses selon un rapport de un à cinq. La lignée cellulaire tumorale négative pour HLA A deux, BT 20, a été utilisée comme témoin négatif. Les résultats montrent que la méthode est utile pour de multiples cellules tumorales adhérentes cibles.

Des cocultures des cellules T spécifiques HER deux nouvelles P 360 9 ont été ajoutées à des cellules cibles marquées au chrome 51, suivies d'une analyse CRA. Le test d'intelligence semble plus sensible pour analyser la cohérence. La variation intra-test a été calculée comme le pourcentage de coefficient de variation à chaque rapport cellulaire entre un à 40 et un à cinq.

Cette mesure était inférieure à 15 % aux rapports cellulaires les plus faibles. Toutefois, le pourcentage de CV était élevé ou imprévisible. En outre, la variabilité de la lyse des cellules T SK BR trois par co-culture avec différentes lignées de cellules T spécifiques de P 360 9 a été examinée.

Les données ont été générées à 30 jours d'intervalle. Les essais ont été réalisés en triplicata et les résultats étaient très similaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer l'activité des lymphocytes T cytotoxiques à l'aide de lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène et de cellules tumorales, en utilisant une approche basée sur l'impédance.