Détermination de l'activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer l’activité des lymphocytes T cytotoxiques en comparant une approche basée sur l’impédance utilisant le système EXOGEN à l’essai de libération de chrome. La première étape est réalisée en séparant les cellules mononucléées du sang périphérique du sang total à l’aide de fial. Ensuite, les PBMC sont ajoutés aux puits avec l’antigène peptidique, l’IL recombinant humain deux et le PBMC irradié pour créer des cellules T CD huit spécifiques de l’antigène.

Les huit lymphocytes T CD spécifiques de l’antigène sont ensuite co-cultivés avec des cellules tumorales dans les deux tests afin de provoquer la mort des cellules tumorales. On obtient des résultats qui montrent le pourcentage de lyse des cellules tumorales en utilisant à la fois la méthode d’impédance et le test de libération de chrome. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test de libération de chrome, est que le système basé sur l’impédance collecte des données en temps réel et nécessite moins de cellules qui n’ont pas besoin d’être marquées. Pour ce protocole, le sang provenant de donneurs HLA sains normaux A deux positifs fournit une source de pbmc ou de cellules mononucléées de sang périphérique suivant le protocole du fabricant.

Utilisez l’appel F PA plus pour séparer les BMC P du sang. Ensuite, dans six puits, les plaques chargent environ 4 millions de BMC P dans deux millilitres de média par puits. À chacun, ajoutez bien le peptide de liaison HLAA deux pour une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre de culture.

Les cellules un jour sur deux pour aider à stimuler et à développer les cellules T. Ajouter un milieu frais complété par de l’IL deux humain recombinant pour une concentration finale de 50 unités par millilitre. Au bout d’une semaine, préparez une culture de pbmc autologue, irradiez les cellules et pulsez-les pendant deux heures avec le même hla.

Deux peptides de liaison à 10 microgrammes par millilitre restimulent la culture en ajoutant un millilitre de PBM CS autologue irradié à chacun. Eh bien, continuez à ajouter des milieux frais complétés par IL deux un jour sur deux après une autre semaine, restimulez les cultures de la même manière une deuxième fois. Après six jours supplémentaires de culture, les cellules seront prêtes à l’emploi.

Préparez la station de mesure d’impédance intelligente pour l’utilisation en l’équilibrant à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure. Récoltez 75 % de cellules tumorales humaines confluentes en utilisant 0,25 % de trypsine et la centrifugation. Comptez les cellules tumorales à l’aide d’un hémocytomètre et reconstituez-les dans RPMI.

Milieu tumoral à une concentration de 7 500 cellules par microlitre. Le programme suivant, le logiciel de l’agent Excel, configure la page de mise en page avec la mise en page du puits. Configurez la page de planification pour prendre des lectures d’impédance toutes les cinq minutes pendant une période de 40 heures Pendant les 18 premières heures, le système Xceligent ne prendra que des lectures d’impédance des cellules tumorales.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu tumoral RPMI par puits. Faites une lecture de fond sur les EPL en mesurant l’impédance en l’absence de cellules. Une fois les cellules tumorales ajoutées, chargez les plaques dans la station de départ et commencez à prendre des mesures.

Les cellules tumorales commenceront immédiatement à adhérer aux EPL. Après environ 18 heures d’incubation, les cellules tumorales se seront attachées aux EPL et auront doublé pour atteindre 15 000 cellules tumorales par puits. À ce moment, récoltez les lymphocytes T préparés par grattage doux et centrifugeuse à agitation.

Les lymphocytes T les reconstituent dans un milieu RPMI avec 10 % FBS et les comptent à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois que la densité cellulaire est connue, préparez une double série de dilution de lymphocytes T de sorte que lorsque 200 microlitres de lymphocytes T sont ajoutés aux cellules tumorales, la concentration la plus élevée est de 40 lymphocytes T par cellule tumorale. La dernière dilution de la série devrait fournir 1,25 lymphocytes T par cellule tumorale.

Mettez la station EXOGEN en pause et retirez l’EPL à l’aide d’une pipette. Retirez le milieu dans les puits, puis chargez 200 microlitres de lymphocytes T en utilisant toutes les concentrations de la série de dilution comme contrôle négatif. Utilisez des milieux purs, retournez l’EPL à la station de là et poursuivez le programme à la fin du test.

Normalisez les résultats. Suivez toujours les procédures de radioprotection de l’établissement lorsque vous travaillez avec des cellules cibles marquées au chrome 51 et au chrome 51 et utilisez le blindage pour réduire l’exposition aux rayonnements. Commencez par pulser les cellules tumorales pendant deux heures à raison de 1 million de cellules par millilitre avec 10 microlitres par millilitre de chrome 51 frais.

Ensuite, lavez les cellules tumorales dans 10 millilitres de milieu RPMI avec 10 % FBS centrifugez les cellules et reconstituez-les dans le même milieu à 1 million de cellules par millilitre. Puis à une plaque inférieure ronde de 96 biens. Ajoutez 100 000 cellules tumorales par puits pour calculer la libération spontanée.

N’ajoutez rien d’autre à six de ces puits à six autres. Ajoutez 100 microlitres de Triton X 100 pour lyce les cellules et calculez ainsi la libération maximale vers tous les puits restants. Ajouter les cellules T à la plaque en utilisant la série de dilution préparée précédemment.

Maintenant, incubez les plaques pendant cinq heures et prélevez des échantillons de 50 microlitres de surnageant de chacune, chargez bien les échantillons sur une plaque de luminance après avoir séché les plaques dans la hotte pendant la nuit à température ambiante. Mesurez leur CPM à l’aide d’un compteur gamma T-cell et d’un SKBR trois. Les cellules cancéreuses ont été cultivées sur des plaques d’intelligence X et l’indice cellulaire a été mesuré, ce qui est un reflet de l’impédance de la plaque, car les cellules T n’ont pas besoin d’adhérence pour proliférer.

Leur effet sur l’impédance a été négligeable sur une culture de 40 heures. Les cellules cancéreuses cultivées seules ont montré une mesure d’impédance croissante. Cependant, un ajout de lymphocytes T à 18 heures perturbe cette tendance.

Cet événement nécessite une normalisation logicielle après l’ajout de lymphocytes T et est étudié plus en détail dans l’expérience suivante. Lorsque trois cellules SK BR ont été co-cultivées avec des concentrations variables de cellules T, les réductions d’impédance dépendaient très clairement de la dose de cellules T que les données étaient collectées toutes les cinq minutes au cours de trois essais au bout de 10 heures. Les indices cellulaires ont suivi un polynôme de second ordre sur la gamme des lymphocytes T, indiquant que la station Exogen surveille la mort médiée par les lymphocytes T CD huit des tumeurs SK B trois en temps réel sous forme de baisse de l’indice cellulaire pour déterminer si les réductions d’impédance de SK BR trois par les lymphocytes T étaient spécifiques de l’antigène.

SK KBR trois cellules ont été co-cultivées avec HLA A deux cellules T positives spécifiques de la grippe qui ne reconnaissent pas HER deux nouvelles. Ces cellules avaient significativement moins d’activité lytique pour déterminer si ses deux nouveaux lymphocytes T spécifiques tuaient de manière spécifique à l’antigène, l’anticorps contre le ligand rapide a été incorporé dans les co-cultures. L’anticorps n’a pas réduit l’activité lytique des deux nouveaux lymphocytes T spécifiques de HER P 360 9.

Cependant, avec des lymphocytes T qui n’étaient pas spécifiquement activés avec des billes d’anti-CD trois, CD 28, l’anticorps a inhibé la lyse pour déterminer si la destruction se produisait d’une manière dépendante de la classe HLA un. Des anticorps anti-HLA de classe 1 ou des anticorps de contrôle des isotypes ont été ajoutés aux co-cultures. Les résultats ont fortement soutenu cette hypothèse.

Les lymphocytes T ont ensuite été co-cultivés avec d’autres cellules cancéreuses dans un rapport de un à cinq. La lignée cellulaire tumorale HLA A à deux négatifs BT 20 a été utilisée comme contrôle négatif. Les résultats montrent que la méthode est utile pour les cellules tumorales adhérentes à cibles multiples.

Deux nouvelles cellules T spécifiques de P 360 9 ont été ajoutées aux cellules cibles marquées au chrome 51, suivies d’une analyse CRA. Le test d’intelligence semble plus sensible pour analyser la cohérence. La variation intra-essai a été calculée comme le coefficient de variation en pourcentage à chaque cellule rapport entre un à 40 et un à cinq.

Celle-ci mesurée en dessous de 15 % aux ratios de cellules les plus bas. Cependant, le pourcentage de CV était élevé ou imprévisible. De plus, la variabilité de la lyse des cellules T SK BR trois par co-culture avec différentes lignées de cellules T spécifiques de P 360 9 a été examinée.

Les données ont été générées à 30 jours d’intervalle. Les tests ont été effectués en trois exemplaires et les résultats étaient très similaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer l’activité des lymphocytes T cytotoxiques à l’aide de cellules T CD huit spécifiques de l’antigène et de cellules tumorales en utilisant une approche basée sur l’impédance.