La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

L'objectif général de cette procédure est de détecter et de quantifier la quantité de toxine qui pénètre dans le cytosol. Pour ce faire, la toxine est d'abord liée à la surface de la cellule hôte à quatre degrés Celsius. La toxine non liée est ensuite éliminée et les cellules sont réchauffées à 37 degrés Celsius, ce qui permet le déplacement de la toxine vers le système endomembranaire, puis dans le cytosol de l'hôte. La digitonine est alors utilisée pour rendre sélectivement perméable la membrane plasmique après la perméabilisation cellulaire.

Les extraits cellulaires sont fractionnés en fractions membranaires et cytosoliques distinctes à l'aide d'une centrifugation différentielle comme étape finale. La résonance de surface par plasma (SPR), abrégée en SBR, est utilisée pour détecter et quantifier l'entrée de la toxine dans le cytosol par perfusion de la fraction cytosolique sur un capteur SPR revêtu d'un anticorps antitoxine. Cette méthode permettra de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie des toxines, telles que l'efficacité et la cinétique de l'entrée de la toxine dans le cytosol, la quantité de toxine pénétrant dans le cytosol, ainsi que l'inhibition éventuelle par des médicaments du trafic de la toxine vers le cytosol. Avant le début de ce protocole, préparez les cellules Heli pour l'intoxication cellulaire comme décrit dans le protocole écrit, après une incubation nocturne des cellules HeLa.

Remplacer le milieu de culture par un millilitre de DMEM contenant 100 nanogrammes par millilitre de ganglioside GM1 et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ceci augmente le nombre de sites de fixation de la toxine cholérique. En tant que récepteur de la toxine, le GM1 s'interpolera dans la membrane plasmique des cellules exposées à une solution de GM1.

Après une incubation d'une heure, retirez le milieu GM et lavez les cellules deux fois avec du DMEM. Ajoutez ensuite un millilitre de DMEM contenant un microgramme par millilitre de toxine cholérique, puis placez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirez le milieu contenant la toxine et lavez les cellules deux fois.

Incubez ensuite les cellules dans un millilitre de DMEM à 37 degrés Celsius pendant la durée souhaitée. À la fin de chaque période de chase, lavez les cellules avec du PBS, puis incubez chaque puits avec 250 microlitres de PBS contenant 0,5 millimolaire d'EDTA. Après une incubation de 10 minutes sur de la glace, détachez les cellules de la plaque à six puits par une pipetage vigoureux avec une pipette P1000.

Une fois qu'un puits de cellules a été récupéré, combinez-le avec le deuxième, puis le troisième puits de la même condition. Ensuite, placez la suspension cellulaire combinée des trois puits réplicats dans un seul tube de microcentrifugeuse. Faites maintenant centrifuger le tube de microcentrifugeuse dans une microcentrifugeuse de table pendant cinq minutes.

À 5 000 ×g, des culots cellulaires de taille approximativement équivalente doivent être obtenus pour toutes les conditions. Éliminer le surnageant, puis resuspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres d'une solution de travail fraîchement préparée et refroidie de digitonine à 0,04 %. Placer la suspension cellulaire sur de la glace pendant 10 minutes, puis centrifuger la digitonine et les cellules perméabilisées à 16 000 ×g pendant 10 minutes à l'aide d'une microcentrifugeuse de table.

Transférez le cytosol contenant la fraction surnageante dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et conservez la fraction de culot contenant les organites. Les étalons de la toxine SPR sont préparés aux concentrations de cent, dix, un et 0,1 nanogramme par millilitre dans du tampon HCN. Les échantillons sont préparés en diluant les fractions surnageantes contenant le cytosol dans du tampon HCN jusqu'à un volume final d'un millilitre. Des volumes d'échantillon d'au moins un millilitre sont nécessaires afin de garantir que l'air soit éliminé du boucle d'échantillonnage de 500 microlitres avant l'injection. Les fractions de culot contenant les organites sont remises en suspension dans un millilitre de tampon HCN contenant 1 % de Triton X-100.

L'ajout d'un détergent est nécessaire pour libérer le compartiment de toxine inclus dans la membrane. Préparez également des séries parallèles de fractions cytosoliques et d'organite L pour une expérience témoin permettant de confirmer la fidélité de la procédure de fractionnement : resuspendez la fraction cytosolique dans 20 microlitres de tampon d'échantillonnage 4 x et la fraction d'organite L dans 120 microlitres de tampon d'échantillonnage 1 x. Résolvez des volumes équivalents de chaque fraction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), puis analysez par transfert Western afin de démontrer la répartition d'une protéine cytosolique dans la fraction surnageante et d'une protéine ER soluble dans la fraction pellet. Pour préparer la lame SPR, placez d'abord une lame en verre revêtue d'or portant une monocouche auto-assemblée dans l'instrument SPR.

Activer la lame capteur en perfusant une solution E-D-C-N-H-S sur la lame pendant 10 minutes à un débit de 41 microlitres par minute. Pour toutes les perfusions ultérieures, utiliser le même débit. Éliminer le tampon d'activation E-D-C-N-H-S en lavant la plaque pendant cinq minutes avec du PBS contenant 0,05 %2020.

La plaque contient désormais des brins réactifs de MI en raison du décapuchonnage par la solution E-D-C-N-H-S. Ensuite, perfuser un anticorps anti-CTA sur la lame capteur activée à une dilution de un à 20 000 dans de l'acétate de sodium 20 millimolaire pendant 15 minutes. Une baisse initiale de l'unité d'indice de réfraction, abrégée RIU, sera observée en raison du changement de pH.

Cela sera suivi par une augmentation de l'unité d'indice de réfraction (RIU) lorsque l'anticorps sera capturé par les attaches réactives à l'amide. Sur la lame de capteur, éliminer l'anticorps non lié à l'aide d'un lavage au PBST de cinq minutes. Le signal RIU produit par l'anticorps capturé atteindra un plateau et se stabilisera, fournissant un nouveau signal de base.

Comme étape finale de la préparation de la lame, faire circuler de l'éthanolamine à une concentration d'un molaire sur la lame capteur pendant cinq minutes. Cette étape bloque et inactive tous les brins d'ancrage non liés restants sur la lame capteur. Le signal en unités d'indice de réfraction (RIU) augmentera afin d'établir une lecture de base ; faire circuler du PBST sur le capteur recouvert d'anticorps pendant cinq minutes.

Ensuite, perfuser un échantillon expérimental ou un étalon de toxine sur le capteur pendant 300 secondes. Retirer le ligand du tampon et perfuser du PBST sur le capteur pendant encore 200 secondes. Toute toxine restant liée au capteur est éliminée par un 102e lavage avec du PBST à pH 5,0.

Cela ramènera le signal à sa lecture initiale de la ligne de base, permettant ainsi de traiter un autre échantillon sur le même capteur. Avant de charger un nouvel échantillon, faire passer une petite quantité d'air à travers la boucle d'échantillonnage afin d'éliminer tout fluide résiduel provenant de l'échantillon précédent. Après l'acquisition.

Les données peuvent être analysées à l'aide du logiciel Scrubber Two, et le logiciel Igor peut être utilisé pour la préparation des figures. La toxine de la coqueluche est une toxine de type AB qui passe de la surface cellulaire au réticulum endoplasmique avant que sa chaîne A n'entre dans le cytosol.

Le test de translocation basé sur la SPR pouvait détecter les PTs présents dans le cytosol de cellules CHO intoxiquées. Aucun signal n'a été généré à partir du cytosol de cellules non intoxiquées, ce qui a confirmé l'absence d'anticorps anti-PTs. Un anticorps n'a pas réagi de façon croisée avec un composant du cytosol de l'hôte.

La fraction cytosolique provenant de cellules intoxiquées en présence de felden. A n'a également pas produit de signal positif, le BFA empêchant le transport de la toxine vers le site de translocation dans le réticulum endoplasmique, et donc la livraison de la chaîne H dans le cytosol. La choletoxine est une autre toxine de type AB qui se transloque dans le réticulum endoplasmique.

La CTA1 a été détectée dans la fraction cytosolique provenant de cellules helo traitées par la CT. Cela souligne que la méthodologie fonctionne avec plusieurs types cellulaires et peut être appliquée à toute toxine pour laquelle un anticorps dirigé contre la chaîne A est disponible. Aucun signal n’a été détecté lorsque la fraction cytosolique provenant de cellules traitées par la CT a été perfusée sur un capteur SPR revêtu d’un anticorps anti-CTB, démontrant ainsi que, contrairement à la sous-unité CTA1, le PENTAMÈRE CTB responsable de la liaison cellulaire n’entre pas dans le cytosol.

Après perfusion sur un capteur SPR revêtu d'un anticorps anti-CTA. Le signal provenant de la fraction organellaire est hors échelle par rapport au signal plus faible provenant de la fraction cytosolique. Ceci est conforme à l'inefficacité connue du transport de la CT vers le site de translocation dans le réticulum endoplasmique, ce qui limite à son tour la quantité de toxine pouvant atteindre le cytosol.

L'accumulation dépendante du temps de la toxine cytosolique transloquée peut également être surveillée. Après exposition des cellules à la toxine CT à quatre degrés Celsius, aucune toxine n'a été détectée dans le cytosol 15 minutes après réchauffement à 37 degrés Celsius.

Un faible pool de toxine cytosolique a été détecté après 30 minutes à 37 degrés Celsius, et des quantités progressivement plus importantes de toxine cytosolique ont été observées après les intervalles de chase de 45 et 60 minutes. Ceci démontre un apport continu à long terme de la toxine associée à la cellule vers le cytosol de l'hôte. L'essai est également en mesure de détecter l'inhibition du translocation de la toxine vers le cytosol : les cellules traitées avec 10 % de DMSO ont présenté de faibles niveaux de toxine de type CT dans le cytosol, comparativement aux cellules contrôles intoxiquées non traitées, ce qui indique un dépliage de la toxine.

Une chaîne est une condition préalable à la translocation vers le cytosol, de sorte que la stabilisation induite par le DMSO de la CT A1 a par conséquent empêché son déplacement du réticulum endoplasmique vers le cytosol. Afin de quantifier le blocage induit par le DMSO de la translocation de la toxine, une courbe standard établie à partir de concentrations connues de toxine a été utilisée pour calculer une concentration cytosolique de cta1 de 0,3 nanogramme par millilitre pour les cellules non traitées, et de 0,1 nanogramme par millilitre pour les cellules traitées au DMSO. L'inhibition du dépliage de la CT A1 par le DMSO a ainsi entraîné une réduction par trois de la translocation de la CT A1 du réticulum endoplasmique vers le cytosol.

Après avoir suivi cette procédure, nous pourrons utiliser d'autres techniques, telles que les tests d'intoxication, afin d'établir un lien direct entre la quantité de toxine présente dans le cytosol et l'activité de la toxine.