Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

Une méthode rapide et efficace d'intégrer l'ADN étranger dans des souches d'intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d'atterrissage, est décrite. Procédé permettant d'intégration spécifique de site d'une cassette d'ADN dans le locus piste d'ingénierie d'une souche donnée, par conjugaison et l'expression de l'intégrase ΦC31.

L’objectif global de l’expérience suivante est d’intégrer une construction d’ADN souhaitée dans le chromosome bactérien à un locus prédéterminé. Ceci est réalisé par un protocole d’accouplement impliquant quatre souches bactériennes modifiées. La souche réceptrice a une séquence d’atterrissage composée d’un gène de résistance à la mycine et du gène e coli bêta-glucuronidase flanqué de sites ATP intégrés dans son chromosome.

La souche donneuse P JH one 10 porte un plasmide contenant aux sites B flanquant un gène de protéine fluorescente rouge et un gène de résistance aux antibiotiques. La souche donneuse PJC deux porte un plasmide contenant l’intégrase spécifique du site du phage C 31 de streptomyces sous le contrôle du promoteur LAC. La quatrième souche MT 616 fournit les gènes de transfert nécessaires à la conjugaison, le transfert de plasmides d’une cellule à l’autre, entraîne la création de trans à travers les souches réceptrices.

Acquisition des deux plasmides nécessaires à l’échange de cassettes médié par l’intégrase. L’échange de la cassette donneuse du plasmide PJ H one 10 avec les marqueurs de la cassette de la plate-forme d’atterrissage sur le chromosome entraîne la perte des marqueurs de la plate-forme d’atterrissage, du SPR et de l’UIDA et le maintien de la cassette donneuse RFP et GMR chez le transimmigrant qui en résulte. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes comme la recombinaison homologue est la facilité et l’efficacité du protocole.

Il est également transférable à un large éventail de bactéries. La souche accepteur utilisée dans cette vidéo est une souche S milli latte deux jours avant la procédure d’accouplement pour créer des intégrines trans inoculer d’une seule colonie dans cinq millilitres de milieu TY avec spect mycine incuber la souche S milli à 30 degrés Celsius pendant deux jours en secouant la veille de la procédure d’accouplement inoculer chacune des souches E coli suivantes dans cinq millilitres de milieu liquide LB complété avec l’antibiotique approprié DH cinq alpha contenant le plasmide d’expression de l’intégrase dans un milieu avec la tétracycline MT 616, le mobilisateur intermédiaire avec du chloramphénicol et DH cinq alpha contenant le plasmide de la cassette donneuse dans un milieu avec de la gentamycine, incuber les trois souches e coli pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une agitation constante pour préparer les cellules à la procédure d’accouplement. Transférez 1,5 millilitres de chacune des quatre cultures dans un tube et centrifugez à 17 000 fois G pendant 30 secondes pour recueillir la pastille cellulaire, jetez le milieu et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans un millilitre de chlorure de sodium stérile à 0,85 % centrifugez à nouveau les tubes après avoir jeté le surnageant. Resus suspend chaque pastille dans 100 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 % à l’aide d’une pipette et repérez individuellement 10 microlitres de culture lavée pour chaque filtrer sur une plaque de gélose TY ordinaire.

Ces points sont des points de contrôle. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chaque souche, à l’exclusion de l’e coli DH cinq alpha contenant Pjc deux dans un tube stérile et mélangé par pipetage de haut en bas sur 120 microlitres de ce mélange sur la plaque de gélose TY ordinaire. Ce point est le contrôle négatif de l’absence d’intégrase.

Enfin, ajoutez 40 microlitres de chacune des quatre souches dans un mélange en tube stérile et répartissez 160 microlitres de ce mélange sur la même plaque de gélose TDY. Ce point est le point d’accouplement d’échange de cassettes médié par l’intégrase.

Placez la plaque dans une hotte à flux laminaire et laissez sécher les taches pendant environ 20 minutes après cela. Scellez la plaque et incubez à 30 degrés Celsius pendant la nuit le lendemain de la série du protocole d’accouplement. Les deux points de contrôle et le point d’accouplement IMCE sur des plaques de gélose TY complétées par de la streptomycine et de la gentamycine.

La souche accepteur millimilli S porte une mutation conférant une résistance élevée à la streptomycine pour le calcul de l’efficacité IMCE Resus suspend environ un quart du point d’accouplement IMCE dans 500 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 %Le chlorure de sodium multiplie par dix des dilutions en série à 10 à la septième plaque négative Les dilutions tendent vers les moins deux à 10 à moins cinq sur les plaques de gélose TY complétées par de la streptomycine, gentamycin et xgl à sélectionner pour les immigrants trans. Les dilutions sur plaque ont tendance à moins trois à 10 à moins sept sur les plaques de gélose TY, complétées par de la streptomycine et du xgl pour sélectionner à la fois les immigrants trans et les receveurs potentiels. C’est-à-dire que les receveurs au total incubent des assiettes à 30 degrés Celsius pendant trois jours.

Voir RFP trans sous feu vert et à travers un filtre rouge, calculez le pourcentage d’efficacité IMCE en tant qu’UFC des immigrants trans par rapport à l’UFC de l’ensemble des receveurs, environ la moitié des trans auront subi un véritable échange, ce qui les rendra blancs et insensibles après trois jours d’incubation sur Ty supplémenté en streptomycine et en gentamycine, il ne devrait pas y avoir de croissance dans les souches témoins suivantes, pas de contrôle intégrase s milli latte UW 2 27 témoin e coli MT 616 témoin e coli DH cinq alpha contenant P JH un 10 témoin et e coli DH cinq alpha contenant PJC deux témoin. En revanche, la traînée IMCE du lieu d’accouplement doit avoir une croissance confluente sur la traînée de tête et de nombreuses colonies sur la deuxième strie. Les deux images suivantes montrent des suspensions de résus d’une dilution de 10 à moins deux du point d’accouplement sur la gélose TY streptomycine xgl, et sur la gélose TY streptomycine Gentamycin xgl sur la gélose TY streptomycine Gentamycin xgl.

Les colonies bleues sont des recombinants simples. Alors que les colonies blanches sont des transintégrines qui ont subi un véritable échange de cassette lorsqu’elles sont observées sous une lumière verte et à travers un filtre rouge, elles ont tendance à la dilution négative de deux de la suspension de la tache d’accouplement sur la gélose TY streptoctocénie cin xgl manque de fluorescence. En revanche, la dilution de 10 à moins deux de la suspension de réanimation du point d’accouplement sur la gélose Ty streptomycine Gentamycin Xgl montre deux niveaux de fluorescence.

Les colonies les plus brillantes correspondent aux colonies bleues et ont une expression RFP plus élevée, probablement en raison de la promotion d’une lecture du promoteur LAC dans le vecteur. Les colonies les moins brillantes correspondent à des colonies blanches, qui ont subi un véritable échange de cassettes et contiennent des RFP avec seulement son promoteur immédiat et aucune lecture du promoteur LAC. Ces tendances des immigrants devraient également être sensibles à la mycine.

L’efficacité de l’intégration trans, exprimée en pourcentage d’immigrants trans par rapport au total des bénéficiaires, devrait être de l’ordre de 0,5 %Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la conjugaison bactérienne à l’aide de nos souches modifiées pour insérer des constructions d’ADN dans le chromosome bactérien.