Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

L'objectif général de l'expérience suivante est d'intégrer un construct d'ADN souhaité dans le chromosome bactérien à un locus prédéterminé. Cette intégration est réalisée par un protocole d'hybridation impliquant quatre souches bactériennes modifiées. La souche réceptrice possède une séquence « landing pad » constituée d'un gène de résistance à la spectinomycine et du gène de la bêta-glucuronidase d'Escherichia coli, flanqués de sites ATP, intégrés dans son chromosome.

La souche donneuse P JH un 10 porte un plasmide contenant des sites B encadrant un gène codant pour une protéine fluorescente rouge, ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique. La souche donneuse PJC deux porte un plasmide contenant l'intégrase spécifique du site provenant du bactériophage Streptomyces C 31, sous le contrôle du promoteur LAC. La quatrième souche, MT 616, fournit les gènes de transfert nécessaires à la conjugaison, soit le transfert de plasmides d'une cellule à l'autre, ce qui conduit à la création de transductants dans les souches réceptrices.

Acquisition des deux plasmides nécessaires à l'échange de cassette médié par une intégrase. L'échange de la cassette donneuse du plasmide PJ H one 10 avec les marqueurs de la cassette « landing pad » sur le chromosome entraîne la perte des marqueurs de la cassette « landing pad », SPR et UIDA, et le maintien de la cassette donneuse RFP et GMR dans le trans-immigré résultant. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes comme la recombinaison homologue réside dans la simplicité et l'efficacité du protocole.

Il est également transférable à une grande variété de bactéries. La souche receveuse utilisée dans cette vidéo est une souche S milli latte préparée deux jours avant la procédure d'accouplement pour créer des transintégrines : inoculer à partir d'une colonie unique dans cinq millilitres de milieu TY contenant de la spectinomycine ; incuber la souche S milli à 30 degrés Celsius pendant deux jours avec agitation. La veille de la procédure d'accouplement, inoculer chacune des souches d'e coli suivantes dans cinq millilitres de milieu liquide LB enrichi avec l'antibiotique approprié : DH5α contenant le plasmide d'expression de l'intégrase dans un milieu avec de la tétracycline, MT616, la souche mobilisatrice, dans un milieu avec du chloramphénicol, et DH5α contenant le plasmide donneur de cassette dans un milieu avec de la gentamicine. Incuber les trois souches d'e coli toute la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation constante afin de préparer les cellules pour la procédure d'accouplement. Transférer 1,5 millilitre de chacune des quatre cultures dans un tube et centrifuger à 17 000 ×g pendant 30 secondes pour recueillir le culot cellulaire, jeter le milieu et resuspendre chaque culot cellulaire dans un millilitre de chlorure de sodium stérile à 0,85 %. Centrifuger à nouveau les tubes après avoir éliminé le surnageant. Resuspendre chaque culot dans 100 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 % à l'aide d'une pipette. Déposer individuellement 10 microlitres de chaque culture lavée pour chaque souche sur une plaque d'agar TY ordinaire.

Ces taches sont des taches de contrôle. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de chaque souche, à l'exception de l'e coli DH cinq alpha contenant le Pjc deux, dans un tube stérile et mélangez en pipetant de haut en bas. Déposez 120 microlitres de ce mélange sur la boîte de gélose TY ordinaire. Cette tache correspond au témoin négatif sans intégrase.

Enfin, ajoutez 40 microlitres de chacune des quatre souches dans un tube stérile, mélangez et déposez 160 microlitres de ce mélange sur la même boîte de gélose TDY. Cette inoculation correspond au spot d'accouplement par échange de cassette médié par une intégrase.

Placez la plaque dans une hotte à flux laminaire et laissez sécher les points pendant environ 20 minutes après cela. Scellez la plaque et incubez-la à 30 degrés Celsius pendant la nuit, le lendemain du tracé du protocole d’appariement. Les deux points témoins et le point d’appariement IMCE sur des plaques gélosées TY supplémentées avec de la streptomycine et de la gentamicine.

La souche réceptrice S milli porte une mutation conférant une résistance élevée à la streptomycine, utilisée pour le calcul de l'efficacité IMCE. Resuspendre environ un quart de la zone d'accouplement IMCE dans 500 microlitres de chlorure de sodium stérile à 0,85 %. Effectuer des dilutions sérielles dix fois jusqu'à 10 à la puissance moins sept. Ensemencer les dilutions allant de 10 à la puissance moins deux à 10 à la puissance moins cinq sur des boîtes de gélose TY supplémentées en streptomycine, gentamicine et xgl pour sélectionner les trans-immigrants. Ensemencer les dilutions allant de 10 à la puissance moins trois à 10 à la puissance moins sept sur des boîtes de gélose TY supplémentées en streptomycine et xgl afin de sélectionner à la fois les trans-immigrants et les récipients potentiels. Incuber les boîtes pendant trois jours à 30 degrés Celsius pour déterminer le nombre total de récipients.

Observer la fluorescence RFP sous lumière verte et à travers un filtre rouge, puis calculer le pourcentage d'efficacité IMCE en comparant le nombre d'UFC des bactéries transconjugantes au nombre d'UFC des récepteurs totaux. Environ la moitié des transconjugants auront subi un échange réciproque complet, devenant ainsi blancs et insensibles après trois jours d'incubation sur milieu Ty supplémenté en streptomycine et en gentamicine. Aucune croissance ne doit être observée avec les souches témoins suivantes : témoin sans intégrase, s. millilaté UW227, témoin E. coli MT616, témoin E. coli DH5α contenant le vecteur PJH110, et témoin E. coli DH5α contenant le vecteur PJC2. En revanche, la culture IMCE prélevée à partir du point de conjugaison doit présenter une croissance confluente sur la première strie et de nombreuses colonies sur la deuxième strie. Ces deux images suivantes montrent des suspensions de ressuspension d'une dilution 10⁻² du point de conjugaison sur gélose TY-streptomycine-xgl, et sur gélose TY-streptomycine-gentamicine-xgl.

Les colonies bleues sont des recombinants uniques. Alors que les colonies blanches sont des intégrines trans qui ont subi un véritable échange de cassette lorsqu'elles sont observées sous lumière verte et à travers un filtre rouge, elles tendent vers la dilution négative deux de la suspension de spot d'accouplement resus sur l'agar TY strept cin xgl qui ne présente pas de fluorescence. En revanche, la dilution 10 à la puissance moins deux de la suspension de spot d'accouplement resus sur l'agar Ty streptomycine Gentamycine Xgl montre deux niveaux de fluorescence.

Les colonies plus brillantes correspondent à des colonies bleues et présentent une expression plus élevée de RFP, probablement en raison d'une lecture traversante du promoteur LAC présent dans le vecteur. Les colonies moins brillantes correspondent à des colonies blanches, qui ont subi un échange réel de cassette et contiennent le gène RFP uniquement sous le contrôle de son promoteur immédiat, sans lecture traversante du promoteur LAC. Ces colonies devraient également être sensibles à la spectinomycine.

L'efficacité de l'intégration en trans, exprimée en pourcentage d'immigrants en trans par rapport au nombre total de récipients, devrait se situer dans la fourchette de 0,5 %. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la conjugaison bactérienne à l'aide de nos souches modifiées pour insérer des constructions d'ADN dans le chromosome bactérien.