Name: Parasite induite génétiquement Driven maladies auto-immunes coeur de Chagas dans le modèle de poulet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Découvrez l'intégration de l'ADN mitochondrial de Trypanosoma cruzi dans le génome du poulet et son rôle dans la pathogenèse de la maladie de Chagas cardiaque. Ce modèle aviaire innovant permet d'étudier les mécanismes génétiques de cette maladie parasitaire chronique.

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Nous sommes redevables à Nancy R. Sturm, Département d&#39;immunologie, de microbiologie et de biologie moléculaire, David Geffen School of Medicine, Université de Californie à Los Angeles, pour la lecture critique du manuscrit. Le Conseil national de la recherche-CNPq, et la Fondation pour la recherche développement-FAPDF, le Brésil, a soutenu l&#39;étude. Nous remercions l&#39;aide technique de Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Alves Roseneide, et Rafael Andrade, de l&#39;Université de Brasilia, Brésil.

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<li>Yurchenko, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Leishmania+minicircle+kinetoplast+DNA+classes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).</li>
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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

En revanche pour les mammifères sensibles à la vie tout au long de T. infections cruzi, les poulets sont réfractaires à T. l&#39;infection cruzi. L&#39;avantage majeur du système de modèle de poulet est l&#39;élimination de l&#39;infection précoce dans le développement du système immunitaire embryonnaire. Ainsi, l&#39;ADN du parasite ne reste dans le corps du poulet est intégré à plusieurs loci. Utilisation de la quantité optimale de virulente T. cruzi trypomastigotes pour inoculer oeuf fertile est l&#39;étape cruciale vers l&#39;obtention de l&#39;intégration de l&#39;minicercles ADNk dans le génome d&#39;embryons de poulet. Le taux d&#39;éclosion des poussins en direct à partir d&#39;œufs inoculés avec 100 trypomastigotes est de quatre fois plus élevée que celle obtenue avec 500 parasites. Des précautions doivent être prises pour inoculer la suspension des parasites dans 10 uL de milieu de culture dans la chambre à air oeuf. Il devrait y avoir aucune fuite de blanc d&#39;oeuf. Dans des conditions optimales, l&#39;infection parasitaire intracellulaire a lieu wimince, quelques heures après la multiplication d&#39;incubation et le parasite à l&#39;intérieur des cellules hôtes les produits pendant une semaine, après quoi l&#39;infection est éliminée par l&#39;immunité innée. L&#39;intégration nécessite une infection ADNk vivre, et l&#39;inoculation de minicercles nues dans des œufs au début d&#39;embryon de poulet n&#39;entraîne pas l&#39;intégration. Les embryons ADNk-positifs et les contrôles doivent être logés dans des conditions contrôlées à 37,5 ° C et une humidité de 65%. Les poussins sont gardés dans des cages pour les deux semaines à 33 ° C température ambiante. Par la suite, les poulets sont élevés dans des cages sur des étagères suspendues séparés par des allées de 1,5 mètre de largeur dans une pièce à 22 ° C avec de l&#39;air filtré et la pression positive en vertu de l&#39;épuisement constant d&#39;assurer des conditions de protection des animaux. Les adultes sont nourris de poulet-chow et de boire l&#39;eau potable en cours d&#39;exécution pour atteindre pleine croissance et la maturité, ponte moins cinq mois d&#39;âge. Entretien des procédures d&#39;hygiène sont essentielles pour la reproductibilité des résultats lorsque l&#39;on travaille avec T. cruzi inoculédans des oeufs de poulet fertiles. Dans le modèle de système de poulet du T. infections cruzi sont éradiquées après le développement du système immunitaire dans la période précoce de la croissance de l&#39;embryon. En outre d&#39;être l&#39;infection libre, les poussins qui éclosent à partir de T. cruzi inoculé oeufs, en l&#39;absence d&#39;anticorps spécifiques, sont tolérants aux antigènes parasitaires. Le rejet des cellules cardiaques cibles par les lymphocytes cytotoxiques (unité de rejet minime, Figure 3) est vu dans les poulets ADNk-mutés montrant modifications du génotype et de dégradation de la surveillance immunologique 3. Les génotypiquement modifiés cellules T présenter rejet accéléré de tissus dans le corps auto. Le site de la lésion principale est le cœur, qui est une caractéristique de la maladie de Chagas. Le passage d&#39;une physiologique (la surveillance) à un état ​​physiopathologique est vu dans le poulet ADNk muté montrant clonage prolifération des lymphocytes cytotoxiques 3. Tson système modèle transkingdom montre un parasite induite, génétiquement axée maladie auto-immune (Figure 6), résultant de modifications du génome par le T. cruzi ADNk minicercle intégrations. Ces modifications ne sont pas considérés dans les poussins issus d&#39;œufs Lb-inoculées. Ce phénomène suggère que le traitement expérimental de la cardiomyopathie inflammatoire auto-immune dans ADNk mutées poulets peut exiger la suppression de drogue de progéniteurs de moelle osseuse de cellules T spécifiques de phénotype infiltrant le myocarde, et de la transplantation de moelle osseuse saine histocompatible pour prévenir le rejet de soi-tissu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Taq Polymérase d&#39;ADN recombinant </td><td> Invitrogen </td><td> 11615-010 </td><td></td></tr><tr><td> ADN polymérase Taq Platinum </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-030 </td><td></td></tr><tr><td> Au hasard du système amorces de marquage d&#39;ADN </td><td> Invitrogen </td><td> 18187-013 </td><td></td></tr><tr><td> Eco RI </td><td> Invitrogen </td><td> 15202-021 </td><td></td></tr><tr><td> Mbo I </td><td> Invitrogen </td><td> 15248-016 </td><td></td></tr><tr><td> Set dNTP, Solutions 100mm </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 28-4065-51 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham Hybond - N + - Cat n. </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN303B </td><td></td></tr><tr><td> PlasmidPrep Mini Spin kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9042-70 </td><td></td></tr><tr><td> Nsi I </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> R5884 1KU </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;ADN, sel de sodium de poisson sperme </td><td> AMRESCO </td><td> 0644-10G </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-poulet Bu-1b </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8370-02 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-CD45 de poulet </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8270-08 </td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-poulet TCRγδ </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8230-08 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-poulet CD8a </td><td> SouthernBiotech </td><td> 9220-02 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-poulet monocytes / macrophages </td><td> SouthernBiotech </td><td> 8420-02 </td><td></td></tr><tr><td> MyCycle Termocycler </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 580BR 5501 </td><td></td></tr></tbody></table>

parasite induite génétiquement driven maladies auto-immunes coeur de chagas dans le modèle de poulet

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Les infections à Trypanosoma cruzi aiguës acquises dans l&#39;enfance et l&#39;enfance semblent asymptomatiques, mais environ un tiers des cas chroniques montrent la maladie de Chagas en place de trois décennies ou plus tard. L&#39;auto-immunité et de la persistance du parasite sont des théories concurrentes pour expliquer la pathogénie de la maladie de Chagas 1, 2. Pour les rôles distincts joués par la persistance du parasite et l&#39;auto-immunité dans la maladie de Chagas, nous inoculer le T. cruzi dans la chambre à air des œufs fécondés. Le système de poulet immunitaire mature est une barrière étanche biologique contre T. cruzi et l&#39;infection est éradiquée sur le développement de son système immunitaire d&#39;ici la fin de la première semaine de la croissance 3. Les poussins sont des parasites sans à l&#39;éclosion, mais ils conservent intégrée contre les parasites mitochondrial kinétoplaste ADN (ADNk) minicercle dans leur génome qui sont transférés à leur progéniture. Documentation de l&#39;intégration ADNk minicercle dans le génome du poulet a été obtenu par un TargETED Premier QUEUE-PCR, hybridations de type Southern, le clonage et le séquençage 3, 4. Le ADNk minicercle intégrations rupture cadres ouverts de lecture de la transcription et les facteurs du système immunitaire, de la phosphatase (GTPase), l&#39;adénylate cyclase et phosphorylases (PKC, NF-Kappa B activateur, PI-3K) associée à la physiologie cellulaire, la croissance et la différenciation des 3, 5 - 7, et les fonctions des gènes d&#39;autres. Myocardite sévère due à un rejet de fibres cardiaques cibles par les lymphocytes effecteurs cytotoxiques est vu dans les poulets ADNk mutés, montrant une cardiomyopathie inflammatoire similaire à celle observée dans la maladie de Chagas humaine. Notamment, l&#39;insuffisance cardiaque et de la faiblesse du muscle squelettique sont présents chez les poulets adultes avec une rupture de l&#39;ADNk gène de la dystrophine dans le chromosome 1 8. Similaires altérations genotipic sont associés à la destruction des tissus réalisés par des effecteurs CD45 +, CD8γδ + et CD8a lymphocytes. Ainsi, cette infection protozoaire peut induire génétiquement axée sur la maladie auto-immune.

L&#39;inoculation de<em&gt; Trypanosoma cruzi</em&gt; Dans les œufs fertiles avant d&#39;incubation rend le parasite ADNk minicercle intégration dans l&#39;embryon des cellules génome. Croisement révèle le transfert vertical des mutations à la descendance. Le ADNk s&#39;intègre dans les régions codantes à plusieurs chromosomes et les poulets meurent d&#39;une maladie cardiaque inflammatoire auto-immune.

Parasite induite génétiquement Driven maladies auto-immunes coeur de Chagas dans le modèle de poulet

Les infections aiguës à Trypanosoma cruzi acquises pendant la petite enfance et l'enfance semblent asymptomatiques, mais environ un tiers des cas d'infection chronique...

La maladie de Cha est l'affection clinique qui résulte d'infections chroniques par l'ate prot et le tno mausi. Cette maladie affecte le cœur des personnes infectées chroniques plusieurs décennies après l'acquisition de l'infection. Un modèle expérimental transcendant les règnes montre que les œufs de poule sont perméables aux infections par le Taz macro cruise.Pendant la première semaine de croissance de l'embryon, les expériences montrent que les poulets exempts d'infection qui intègrent le parasite KA dans leur génome meurent de la maladie de Chagas cardiaque, tandis qu'un logement adéquat et un approvisionnement en nourriture et en eau de qualité garantissent le bien-être animal. La masse triple de croisière, de bonnes formes nageuses sont obtenues à partir de cultures tissulaires. Trans-illuminez les tissus et les œufs afin de visualiser leur bulle de contrôle.Les œufs ne reçoivent pas d'inoculation para. Les œufs témoins sont inoculés avec 10 microlitres de milieu de culture. Le trou est scellé avec du ruban adhésif essive 100 FL de virus mania.Les Brésiliens sont des maîtres professionnels. Des chèvres inoculent la chambre à air d'œufs de poule fécondés contenant 100 unités virales, et piègent des chèvres macro triples maîtresses dans 10 microlitres de milieu au calcium ; ces dernières inoculent la chambre à air d'œufs de poule virtualisés. Les œufs sont incubés à 37 °C et à une humidité de 65 % pendant un à deux jours, avec une rotation douce toutes les 30 minutes. Les prélèvements sont effectués de manière équivalente à partir d'œufs macro-inoculés de type rénosomateux et à partir de témoins marqués.Les joues atteignent la maturité adulte. Des échantillons de sang sont prélevés sur les veines de l'aile. Le sang est transféré dans des tubes coniques de 15 ml.Les cellules mononucléées sont séparées par centrifugation après lavage sur gradient de FICO pour éliminer les cellules blanches, puis la séparation est écartée. L'ADN génomique de taille moyenne est extrait des cellules mononucléées du sang. Placer 1,5 ml de tubes coniques dans le milieu en fonction de la conception de la PCR. La PCR est réalisée pour amplifier l'ADN nucléaire chroy G-N-A-N-G-N-A et l'ADN du plasmide GNA kg NA. Utiliser des jeux d'amorces spécifiques, préparer les tubes de réaction et les placer dans le thermocycleur après exécution.Retirer les tubes du thermocycleur. Analyser les produits de PCR. Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose.Les bandes d'ADN dans le gel sont transférées vers une membrane en nylon chargée positivement. L'hybridation est réalisée à l'aide de sondes spécifiques marquées radioactivement permettant de distinguer les rôles joués indépendamment par la persistance du parasite et par l'immunité acquise. Dans la pathogenèse de la maladie de Chagas, nous utilisons un modèle de poulet réfractaire à l'infection par le TNO cruise, sauf durant la croissance embryonnaire précoce, avant le développement du système immunitaire. Les poussins issus d'œufs inoculés avec le TNO cruise sont exempts d'infection, mais l'ADN mitochondrial du parasite, A KG A, est conservé dans l'organisme.Seuls les poussins issus d'œufs macro-inoculés au tzo présentent des bandes de kg ; l'ADN n'est pas présent dans le génome des poulets. Les poussins issus d'œufs inoculés avec des chèvres pro maîtresses de Leia brésilienne ne conservent pas les séquences circulaires mitochondriales dans leurs génomes. Piste un : vide ; piste deux : contrôle ADN ; pistes trois et quatre : témoins GS ; pistes cinq à quatorze : GS provenant d'éclosions tchèques à partir d'œufs infectés de Braziliens de Las mania.Lane 15 montre l'amplicon de *Leishmania braziliensis* d'une bande de 750 paires de bases obtenue avec les jeux d'amorces spécifiques d'ADNk LB trois et LB cinq. La lecture en quadrillage de L-P-C-R-A illustre les amorces de *Gallus gallus* qui ont été utilisées après trois cycles d'amplification avec une augmentation progressive de la température par étape. La PCR est réalisée avec différents jeux d'ADNk.Le cycle de stringence élevé de Louis crée des sites pour l'amorçage, la liaison et le cycle de haute stringence. Augmente la spécificité des produits d'amplification. Les produits de PCR provenant d'une amplification moindre ayant hybridé avec la sonde KA ont été clonés et séquencés commercialement.La séquence montre le kg d'ADN dans un cercle bleu, la jonction de recombinaison par micro-homologie intermédiaire en jaune et le gallo gA GNA en vert. Le cartographage de l'intégration du kg d'ADN dans le génome du poulet est réalisé par une technique de PCR ciblée utilisant un amorçage spécifique, suivie d'une PCR en temps réel (RTP-PCR). Les poulets adultes porteurs de la mutation ont développé une maladie cardiaque de Chagas.Plus les témoins se développent vers une vie saine. Les poulets mutés KDNA présentent un agrandissement de la silhouette cardiaque sur les radiographies. L'autopsie montre que les poulets témoins ont une taille cardiaque réduite.Le Cajun, un poulet muté, présente une hydro-péricarde, une hydro-tox, et un cœur volumineux. La cardiomégalie est similaire à celle observée dans la maladie de Chagas du cœur. Le cœur de poulet contrôlé par Moog montre une histologie normale.Le kg d'un poulet muté révèle un tunnel formé dans le myocarde par les lymphocytes cytotoxiques qui entourent les fibres cardiaques. Les séquences de cercles aviaires s'intégrant dans des régions codantes de plusieurs chromosomes sont mises en évidence par une PCR de type imbriqué modifiée qui combine des amorces kg ADN avec des jeux d'amorces spécifiques à l'ADN de l'hôte datant de plusieurs décennies. Les poulets présentant une mutation de l'ADN décèdent d'insuffisance cardiaque et présentent une cardiomégalie.La pathologie en microscopie montre une myocardite semblable à la myocardite de Chagas, traduisant un cœur affecté. Chez le poulet muté NA en kg, il s'agit d'une maladie génétiquement déterminée. C'est la première fois que les manifestations cliniques et pathologiques de la maladie de Chagas sont reproduites dans un modèle expérimental transrègne bien défini.Merci.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre la procédure d’injection intraveineuse de cellules cancéreuses dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïde du poulet pour générer un modèle de métastases cancéreuses CAM. Les cellules injectées finissent par former des colonies de cellules cancéreuses uniques dispersées, ce qui permet d’étudier l’invasion du cancer et les métastases.

Injection intraveineuse de cellules cancéreuses dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïde du poulet : une procédure pour établir un modèle de cancer de la membrane chorioallantoïde pour étudier l’invasion du cancer et les métastases

Dans ce protocole, fluorescent étiquetés T. cruzi ont été injectées dans des larves de poisson zèbre transparent, et la motilité de parasite a été observée in vivo à l’aide de la microscopie de fluorescence nappe de lumière.

Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Le carcinome rénal métastatique de cellules claires est une maladie sans modèle animal complet pour l’investigation préclinique complète. Ce protocole illustre deux nouveaux modèles animaux pour la maladie : le modèle orthotopique ment implanté de souris et le modèle chorioallantoic de membrane de poulet, qui démontrent la métastasis de poumon ressemblant à des cas cliniques.

Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Ici, nous avons fourni une méthode pour atteindre la transfection stable des parasites de poulet Eimeria par nucléozoites nucléozoites ou merozoites de deuxième génération. Les parasites eimeriens génétiquement modifiés exprimant des gènes antigéniques hétérologues pourraient être utilisés comme vecteurs de vaccination.

Nucléofection et propagation in vivo des parasites de poulet Eimeria

Nous présentons le modèle chorioallantoic de membrane de poulet comme modèle alternatif, transplantable, in vivo pour l'engraftment des lignes gynécologiques et urologiques de cellules cancéreuses et des tumeurs patient-dérivées.

Utilisation du modèle De membrane chorioallantoïque de poulet In Vivo pour étudier les cancers gynécologiques et urologiques

Les embryons de poulet, en tant que modèle de développement classique, sont utilisés dans notre laboratoire pour évaluer les cardiotoxicités développementales après une exposition à divers contaminants environnementaux. Les méthodes d’exposition et les méthodes d’évaluation morphologique/fonctionnelle établies sont décrites dans ce manuscrit.

Utilisation de l’embryon de poulet comme outil puissant dans l’évaluation des cardiotoxicités développementales

Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Le protocole fourni ici décrit en détail les étapes détaillées de la réalisation d’études d’efficacité médicamenteuse dans un modèle bioluminescent d’infection à Trypanosoma cruzi , en mettant l’accent sur l’acquisition, l’analyse et l’interprétation des données. Des procédures de dépannage et de contrôle de la qualité visant à minimiser les problèmes techniques sont également fournies.

Démystifier l’imagerie par bioluminescence in vivo d’un modèle murin de la maladie de Chagas pour des études d’efficacité de médicaments

Cette vidéo montre comment provoquer hypophysite auto-immunes chez la souris SJL et comment évaluer sa gravité par histopathologie.

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

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